紅細(xì)胞膜蛋白提取流程課件

1、 紅細(xì)胞膜蛋白提取鑒定紅細(xì)胞膜蛋白提取鑒定內(nèi)容內(nèi)容 1. 紅細(xì)胞膜提取紅細(xì)胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量測(cè)定（膜蛋白提取及定量測(cè)定（Lowry法）法） 3.膜蛋白電泳分離、分子量測(cè)定膜蛋白電泳分離、分子量測(cè)定 SDS-PAGE 4.western blotting 鑒定鑒定-actin 實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求： 分別按上各點(diǎn)，寫出：原理，操作步驟，結(jié)果，討論，結(jié)論分別按上各點(diǎn)，寫出：原理，操作步驟，結(jié)果，討論，結(jié)論 手寫，手寫，A4 紙大小紙大小 ，報(bào)告首頁寫明，報(bào)告首頁寫明 實(shí)驗(yàn)者，專業(yè)。實(shí)驗(yàn)者，專業(yè)。實(shí)驗(yàn)分組每個(gè)班分三大組，每組十人左右，選出組長(zhǎng)每個(gè)班分三大組，每組十人左右，選出組長(zhǎng)實(shí)

2、驗(yàn)進(jìn)行一大組為單位實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一大組為單位 1.1.純化純化RBCRBC膜膜 2.SDS-PAGE 22.SDS-PAGE 2塊膠（一個(gè)凝膠架）塊膠（一個(gè)凝膠架） 3.western blot3.western blot 4.3-4 4.3-4 人一小組測(cè)定蛋白質(zhì)含量人一小組測(cè)定蛋白質(zhì)含量 一一.紅細(xì)胞膜提取制備（低滲法紅細(xì)胞膜提取制備（低滲法）原理：原理： RBC置低滲緩沖液置低滲緩沖液(pH7.4)，破裂溶血，破裂溶血 溶血液。溶血液。 溶血液置高速離心作用中，去除溶液中溶血液置高速離心作用中，去除溶液中Hb和和其它內(nèi)含物，制得純凈的其它內(nèi)含物，制得純凈的RBC膜稱為血影膜稱為血影 “ghos

3、t”注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1.1.離心步驟一定要離心步驟一定要“平衡、對(duì)稱放置平衡、對(duì)稱放置”2.2.溶血液離心后上清吸取小心，以免丟失溶血液離心后上清吸取小心，以免丟失“膜膜”3. 3. 緩沖液緩沖液pH7.4pH7.4，偏酸使，偏酸使HbHb殘留增加殘留增加4.4.此分離方法適合于人、大鼠；牛、豬等易使此分離方法適合于人、大鼠；牛、豬等易使脂蛋白脫落，脂蛋白脫落，1mMCaCl1mMCaCl2 2可防止此種膜的不穩(wěn)可防止此種膜的不穩(wěn)定性。定性。5.5.本實(shí)驗(yàn)因條件限制，在常溫離心。如需保持本實(shí)驗(yàn)因條件限制，在常溫離心。如需保持蛋白活性，應(yīng)在蛋白活性，應(yīng)在4 4C C離心。離心。（1）RBC分

4、離：分離： 15 ml RBC液液 2000rpm 5分鐘分鐘 RBC（沉淀）（沉淀）3倍體積倍體積等滲等滲磷酸磷酸Buffer 2000rpm 5分鐘分鐘2 洗凈之洗凈之RBC （2）溶血液制備）溶血液制備 RBC加入加入低滲低滲磷酸磷酸buffer（1:50) (在在 燒杯中）燒杯中） 稍攪拌稍攪拌 置冰箱凍格（置冰箱凍格（4C）溶血過夜）溶血過夜 （以上步驟已完成！）（以上步驟已完成?。┤苎海萌苎?，用“水泵水泵”吸去上清。吸去上清。 ?。耗ず茌p?。耗ず茌p二、二、 RBC膜純化（洗滌）膜純化（洗滌） RBC膜轉(zhuǎn)至膜轉(zhuǎn)至 1.5ml塑料管（塑料管（2個(gè)個(gè)/大組）大組） 9000rpm

5、5 沉淀（膜）沉淀（膜）低滲低滲磷酸磷酸Buffer（pH7.4) ?ml （吹打）（吹打） 9000rpm 54 沉淀沉淀 等滲等滲磷酸磷酸Buffer 1ml 9000rpm 5分鐘分鐘 沉淀（沉淀（RBC膜）膜）0.6ml等滲等滲Buffer （即為（即為RBC原液）原液）三、三、 樣品處理：樣品處理： 1.SDS-PAGE用樣品處理（一大組）：用樣品處理（一大組）： 0.3ml RBC原液原液+0.3ml 樣品溶解液樣品溶解液 沸水浴沸水浴 5 2.Lowry法測(cè)定用樣品處理法測(cè)定用樣品處理 (3-4 人人/group）： A. 取取0.3ml RBC原液原液 1.5ml H2O 15

6、0ul NaOH 沸水浴沸水浴 5 待測(cè)管待測(cè)管1： 取取A液液0.1ml0.9ml H2O 待測(cè)管待測(cè)管2： 取取A液液0.3ml0.7ml H2O四、四、Lowry法測(cè)定膜蛋白含量法測(cè)定膜蛋白含量立即搖勻，放置立即搖勻，放置15分鐘。以第管為空白管，在分光光度計(jì)上以分鐘。以第管為空白管，在分光光度計(jì)上以620比色，讀取。比色，讀取。以各管標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫座標(biāo)，各管吸光度值為縱座標(biāo)作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各管標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫座標(biāo)，各管吸光度值為縱座標(biāo)作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.紅細(xì)胞膜樣品蛋白含量的測(cè)定紅細(xì)胞膜樣品蛋白含量的測(cè)定 將待測(cè)管將待測(cè)管1、2同上加入堿性銅及酚試劑，一同測(cè)定同上加入堿

7、性銅及酚試劑，一同測(cè)定 管號(hào)管號(hào)試劑試劑H2O (ml) 0.90.80.60.40.21.0標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白0.10.20.40.60.8_堿性銅試劑堿性銅試劑搖勻，放置分鐘搖勻，放置分鐘酚試劑酚試劑含標(biāo)準(zhǔn)蛋白含標(biāo)準(zhǔn)蛋白u(yù)g255010015020001.1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備標(biāo)準(zhǔn)曲線制備作圖作圖： 橫坐標(biāo)以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量橫坐標(biāo)以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量 縱坐標(biāo)以縱坐標(biāo)以A620A620吸光度值吸光度值 圖比例應(yīng)為圖比例應(yīng)為3:23:2（橫：縱）（橫：縱）計(jì)算：計(jì)算： 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)樣品的濃度，計(jì)算在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)樣品的濃度，計(jì)算 提取膜的提取膜的 Pr mgPr mg數(shù)數(shù)/ml/ml樣品樣品 注意稀

8、釋倍數(shù)注意稀釋倍數(shù)要求要求：計(jì)算原提取計(jì)算原提取RBCRBC液的液的PrPr含量含量五、五、SDS-PAGE測(cè)定膜蛋白分子量測(cè)定膜蛋白分子量 不連續(xù)電泳系統(tǒng)不連續(xù)電泳系統(tǒng)： 電泳緩沖液電泳緩沖液pH離子強(qiáng)度與凝膠中不同（濃縮效應(yīng)）離子強(qiáng)度與凝膠中不同（濃縮效應(yīng)） （一）垂直板安裝（一）垂直板安裝 每套板兩塊玻璃下端對(duì)齊，每套板兩塊玻璃下端對(duì)齊，夾好，放在膠架上！夾好，放在膠架上！ （二）凝膠制備（見表）（二）凝膠制備（見表） 先配好分離膠（留距齒先配好分離膠（留距齒梳梳1cm），待其凝固后，），待其凝固后，再配濃縮膠。再配濃縮膠。 （三）電泳裝置安裝（三）電泳裝置安裝 先裝內(nèi)槽，試無滲漏；先裝

9、內(nèi)槽，試無滲漏； 放入外槽中，加放入外槽中，加Buffer。 上樣品：上樣品： 每孔每孔18ul，2塊塊/組組 每塊板留一每塊板留一標(biāo)準(zhǔn)蛋白孔標(biāo)準(zhǔn)蛋白孔（四）（四） 電泳：電泳： 100V進(jìn)分離膠調(diào)至進(jìn)分離膠調(diào)至80V 約約1.5小時(shí)小時(shí) 10分離膠分離膠 10 ml5濃縮膠濃縮膠 5ml30凝膠儲(chǔ)備液凝膠儲(chǔ)備液3.31.0蒸餾水蒸餾水4.04.01.5mol/L Tris-HCl Buffer2.51mol/L Tris-HCl Buffer1.010SDS0.10.0810 過硫酸銨過硫酸銨0.06（60ul)0.06(60ul)TEMED8ul8ul加入過硫酸銨，加入過硫酸銨，TEMED

10、即刻灌膠。即刻灌膠。（五）取膠（五）取膠: : 用專用板平面輕輕用專用板平面輕輕“橇橇”開板，推入小平皿中。開板，推入小平皿中。 注意：注意： 一塊半干轉(zhuǎn)移（浸入轉(zhuǎn)移一塊半干轉(zhuǎn)移（浸入轉(zhuǎn)移Buffer20minBuffer20min） 另一塊考馬斯亮藍(lán)染色另一塊考馬斯亮藍(lán)染色 染色染色2 2小時(shí)后，小時(shí)后，7%7%醋酸脫色（醋酸脫色（4 4） 每組做好標(biāo)記（寫好名字），交生化室掃描或攝像每組做好標(biāo)記（寫好名字），交生化室掃描或攝像保留。保留。分子量計(jì)算分子量計(jì)算1.測(cè)量：測(cè)量： cmcm a.a.每條帶距離每條帶距離 （起始點(diǎn)至帶中心）（起始點(diǎn)至帶中心） b b. .起始至示蹤染料距離起始至示

11、蹤染料距離2. MR2. MR： 條帶距離條帶距離(a)(a) MR= MR= 起始至示蹤染料距離起始至示蹤染料距離 (b)(b)ab1410062403024分子量分子量KD遷移距離遷移距離cmMR705540352515預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白3.半對(duì)數(shù)圖：（六條標(biāo)準(zhǔn)蛋白）半對(duì)數(shù)圖：（六條標(biāo)準(zhǔn)蛋白）（參照統(tǒng)計(jì)學(xué)散點(diǎn)法）參照統(tǒng)計(jì)學(xué)散點(diǎn)法） 橫坐標(biāo)橫坐標(biāo)為遷移率為遷移率MR 縱坐標(biāo)縱坐標(biāo)為為L(zhǎng)ogM（直接按每一蛋白分子量標(biāo)在半對(duì)數(shù)圖中）（直接按每一蛋白分子量標(biāo)在半對(duì)數(shù)圖中）4.計(jì)算待測(cè)樣品蛋白質(zhì)分子量：計(jì)算待測(cè)樣品蛋白質(zhì)分子量： 選在標(biāo)準(zhǔn)蛋白遷移范圍內(nèi)的相應(yīng)待測(cè)樣品中的三選在標(biāo)準(zhǔn)蛋白遷移范圍內(nèi)的相應(yīng)待測(cè)樣

12、品中的三條帶，測(cè)量距離計(jì)算條帶，測(cè)量距離計(jì)算MR，Mw 9876543210.1 0.2 0.3 0.4.橫坐標(biāo)為遷移率橫坐標(biāo)為遷移率MR；（六條標(biāo)準(zhǔn)蛋白）；（六條標(biāo)準(zhǔn)蛋白）縱坐標(biāo)為縱坐標(biāo)為L(zhǎng)ogM（直接按每一標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量）（直接按每一標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量）2060100六、六、western blotting(-actin鑒定鑒定)1.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 將與凝膠塊將與凝膠塊(切去多余部分切去多余部分)一般大小的一般大小的NC膜、濾紙均浸入轉(zhuǎn)移膜、濾紙均浸入轉(zhuǎn)移Buffer中中20分鐘，取出，在半干轉(zhuǎn)移槽中按以下順序放置：分鐘，取出，在半干轉(zhuǎn)移槽中按以下順序放置： (上）上）陰極端陰極端 濾紙濾紙-凝膠凝膠-膜膜-濾紙濾紙 陽極端（下）陽極端（下） 用玻棒滾動(dòng)去除空氣氣泡，蓋好上蓋。用玻棒滾動(dòng)去除空氣氣泡，蓋好上蓋。 開啟電源，調(diào)電壓時(shí)間開啟電源，調(diào)電壓時(shí)間20 v， 20分鐘分鐘2.封閉封閉 將膜取出將膜取出TBST中洗中洗5，放置于封閉液中，放置于封閉液中10分鐘，用分鐘，用TBST洗洗53；3.一抗孵育一抗孵育 將膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室溫孵育將膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室溫孵育 1小時(shí)，用小時(shí)，用TBST洗洗5分鐘分鐘3；4.二抗孵育二抗孵育 將膜放入已放二抗溶液的