質(zhì)粒提取簡(jiǎn)介及問(wèn)題分析

1、-作者xxxx-日期xxxx質(zhì)粒提取簡(jiǎn)介及問(wèn)題分析【精品文檔】質(zhì)粒提取簡(jiǎn)介及問(wèn)題分析一、導(dǎo)論(一) 質(zhì)粒提取的原理：為了方便理解，這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液I，50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，； 溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS；溶液III，3 M 醋酸鉀，2 M 醋酸。 讓我們先來(lái)看看溶液I的作用。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不過(guò)的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中

2、缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言幾乎沒有任何影響，所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒什么大不了的，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽質(zhì)粒呢？只要用等體積的水或LB培養(yǎng)基來(lái)懸浮菌體就可以了。有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。 輪到溶液I

3、I了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2%的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備的NaOH，無(wú)非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer(雙層膜)結(jié)構(gòu)向micelle(微囊)結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌(不妨可以自己試一下)，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)镾DS也

4、是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢?那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，千萬(wàn)不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪MDNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩。溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加2M醋酸溶液看看就知道

5、不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS，也會(huì)有少量沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉(SDS)遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(PDS)，而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高

6、濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。(二)細(xì)菌的收獲和裂解。細(xì)菌的收獲可通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對(duì)質(zhì)粒和宿主

7、的每一種組合分別提出精確的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來(lái)選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。1、大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來(lái)。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來(lái)所需要的作用力。2、可用更劇烈的方法來(lái)分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過(guò)煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正

8、常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。3、一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放相對(duì)大量的糖類，當(dāng)隨后用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)它們會(huì)惹出麻煩。糖類會(huì)在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時(shí)，不宜使用煮沸法。4、當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA 株，如HB101) 中小量制備質(zhì)粒時(shí)，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒芡耆珳缁顑?nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制

9、酶消化)時(shí)，質(zhì)粒DNA會(huì)被降解。但如果通過(guò)一個(gè)附加步驟(用酚：氯仿進(jìn)行抽提)可以避免此問(wèn)題。5、目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來(lái)煞為費(fèi)事，而在對(duì)數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時(shí)從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時(shí)從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。(三)質(zhì)粒DNA的純化。常用的純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。如，用氯化銫-溴化乙

10、錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過(guò)嵌入堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和(每2個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合1個(gè)溴化乙錠分子)。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來(lái)，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。然而該過(guò)程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展

11、了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、分級(jí)沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。二、質(zhì)粒DNA的小量制備(一)細(xì)菌的收獲和裂解。1、收獲。1) 將2ml含相應(yīng)抗生素的LB加入到容量為15ml 并通氣良好(不蓋緊)的試管中，然后接入一單菌落，于30劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。2) 將培養(yǎng)物倒入離心管中，4、12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4。3) 吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。2、堿法裂解。1) 將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100l用冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。溶液I可成批配制，高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4。須確使細(xì)菌沉淀在溶液I中完全分散。2) 加200l新配制的

12、溶液。蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。3) 加150l用冰預(yù)冷的溶液。蓋緊管口，將管倒置后溫和地振蕩10秒鐘溶液在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3-5分鐘。4) 用離心機(jī)于4、12000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。5) 可做可不做：加等量酚：氯念，振蕩混勻， 用微量離心機(jī)于4 以12000g離心 2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不必用酚：氯仿進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會(huì)得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。6) 用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混

13、合， 于室溫放置2分鐘。7) 用微量離心機(jī)于4以12 000g離心5分鐘。8) 小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。9) 用1ml70%乙醇于4洗滌雙鏈DNA沉淀，去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。i. 此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒(如Xf3或pUC)，其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物3-5g。ii. 如果要通過(guò)限制酶切割反應(yīng)來(lái)分析DNA，可取1l DNA溶液加到另一含8l水的微量離心管內(nèi)，加1l 10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶， 在適宜溫育1-2小時(shí)。將剩余的DNA貯存于-20。iii. 此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100m

14、l細(xì)菌培養(yǎng)物：。3、煮沸裂解。1) ()，1mmol/L EDTA()，5% Triton X-100。2) ()配制，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。3) 將離心管放入煮沸的水浴中，時(shí)間恰為40秒。4) 用微量離心機(jī)于室溫以12000g離心10分種。5) 用無(wú)菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。6) 在上清中加入40l 5mol/L乙酸鈉()和420l異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。7) 用微量離心機(jī)于4以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。8) 小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方

15、法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管的液滴。9) 加1ml 70%乙醇，于4以12 000g離心2分鐘。10)按步驟8)所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r(shí)沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無(wú)可見的液體(2-5)分鐘。 11)用50l含無(wú)DNA酶的胰RNA酶(20g/ml)的TE()溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20。 注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌株(endA 株，如HB101 )中小量制粒尤其DNA時(shí)，建議舍棄煮

16、沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能完全滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在Mg 2 存在下溫育(V中用限制酶時(shí))質(zhì)粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟9)之間增加一步，即用酚：氯仿進(jìn)行抽提，可以避免這一問(wèn)題。(二) 質(zhì)粒DNA小量制備的問(wèn)題與對(duì)策。堿裂解和煮沸都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒有什么麻煩。多年來(lái)，在我們實(shí)驗(yàn)室中日常使用這兩種方法的過(guò)程中，只碰到過(guò)兩個(gè)問(wèn)題：1、有些工作者首次進(jìn)行小量制備時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA

17、。2、在十分偶然的情況下，個(gè)別小時(shí)制備物會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。三、質(zhì)粒DNA的大量制備(一) 在豐富培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒許多年來(lái)，一直認(rèn)為在氯霉素存在下擴(kuò)增質(zhì)粒只對(duì)生長(zhǎng)在基本培養(yǎng)基上的細(xì)菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復(fù)制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物2-5mg質(zhì)粒DNA，而且重復(fù)性也很好。1) 將30ml含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)晚期()。培養(yǎng)基中應(yīng)含有相應(yīng)抗生素，用單菌落或從單菌落中生長(zhǎng)起來(lái)的小量液體閉關(guān)物進(jìn)行接種。2) 將含相應(yīng)抗生素的500ml LB或Terrific肉湯培養(yǎng)基(

18、預(yù)加溫至37)施放入25ml對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37劇烈振搖培養(yǎng)25小時(shí)(搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分)，所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。3) (34mg/ml溶于乙醇)，使終濃度為170g/ml。像pBR322一類在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復(fù)的質(zhì)粒，有必要通過(guò)擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到餉新一代的質(zhì)粒(如pUC質(zhì)粒)可復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)，因此無(wú)需擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進(jìn)行處理，具有抑制細(xì)菌復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)，可減少細(xì)菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡(jiǎn)化質(zhì)粒純化的過(guò)程。所以一般說(shuō)來(lái)，盡管要在生長(zhǎng)中的細(xì)菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊

19、。4)于37劇烈振搖(300轉(zhuǎn)/分)，繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)。(二) 細(xì)菌的收獲和裂解。1、收獲。1) 4以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。2) 將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl()，1mmol/L EDTA()。3) 按步驟1)所述方法離心，以收集細(xì)菌細(xì)胞。2、堿裂解法。1) 將冼過(guò)的500ml 培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物來(lái)自收獲細(xì)菌的步驟3 重懸于10ml(18ml)溶液I中。2) 加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，溶于10mmol/L Tris-HCl

20、()。當(dāng)溶液的pH值低于8.0時(shí)，溶菌酶不能有效工作。3) 加20ml(40ml)新配制的溶液。蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。4) 加15nl(20ml)用冰預(yù)冷的溶液。封住瓶口，搖動(dòng)離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時(shí)應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個(gè)液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀-SDS-蛋白質(zhì)-膜復(fù)合物。5) 用合適轉(zhuǎn)頭于4以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘

21、稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液與細(xì)菌裂解物混合不充分步驟4)。6) 上清過(guò)濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。7) 用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4離心，鹽也會(huì)了生沉淀。8) 小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70%乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。9) 用3ml TE()溶解核酸沉淀。四、質(zhì)粒DNA的純化(一) 聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒DNA。1、將核酸溶液所得轉(zhuǎn)入15mlCorex 管中

22、， 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于4下以10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。2、將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖)于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。3、小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70%乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。4、用500l含無(wú)DNA酶的胰RNA酶(20g/ml

23、 )的TE()溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。5、加500l含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量離心機(jī)于4以12000g離心5分鐘，以回收質(zhì)粒DNA。6、吸出上清，用400l TE()溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。7、將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100l 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積(約1ml)乙醇，于室溫放置10分鐘，于4以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒DNA。8、吸去上清，加200l處于4以12 000g離心2分鐘。9、吸去上清，敞開管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到最后

24、可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。 10)用500l TE()溶解沉淀1：100稀釋用TE() 后測(cè)量OD 260，計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度(1OD260=50g質(zhì)粒DNA/ml)， 然后將DNA貯于-20。10、純化。一些試劑的生化作用原理1、溶液溶霉菌：水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。葡萄糖：增加溶液的粘度，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA：金屬離子螯合劑，螯合Mg2+，Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶(DNase)對(duì)DNA的降解作用(DNase 作用時(shí)需要一定的金屬離子強(qiáng)度作輔基)，同時(shí)EDTA的存在，有利于溶霉菌的作用。因?yàn)槿苊咕姆磻?yīng)要求有較

25、低的離子強(qiáng)度環(huán)境。2、溶液-NaOH-SDS液NaOH：核酸在pH值為59的溶液中是最穩(wěn)定的，但pH大于12或小于3時(shí)，就會(huì)引起雙鍵之間氫鍵的解離而變性。在溶液中的NaOH濃度為0.2N，加入提取液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就會(huì)高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS：為陰離子表面活性劑，主要功能有：溶解細(xì)胞膜上的脂肪與蛋白，從而破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核蛋白SDS蛋白質(zhì)結(jié)合為復(fù)合物，使蛋白變性沉淀下來(lái)，但SDS能抑制核糖核酸沒的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，以防用RNase去除RNA時(shí)受到干擾。3、溶液-3M KAc()溶液：KAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4

26、.8，必須加入大量的冰醋酸，所以該溶液實(shí)際上是KAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的KAc溶液是為了把pH 12.6的抽取液pH調(diào)回到中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3molL KAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾伞p少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物作用后，能形成溶解度較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀完全。4、為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA:此為實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是低度極性，可以以任意比例和水相混容，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。D

27、NA溶液時(shí)以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在的DNA，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合。其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來(lái)代替無(wú)水乙醇(因無(wú)水乙醇價(jià)格更貴)，但加95%乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中總有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，會(huì)影響收得率。折衷的做法是初次沉淀DNA是可用95%乙醇代替無(wú)水乙醇，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用異丙醇選擇性沉淀DNA，一般在室溫下放置1530min即可。使用乙醇在低溫條件下沉淀DNA，分子運(yùn)動(dòng)大大減少，DNA易于聚合而沉淀，且溫度越低，DNA沉淀得越快。5、RNase處理核糖核酸后，再次沉淀DNA時(shí)為什么一定要加NaAc至最濃度達(dá)0.10.25M。在pH 8左