課件動(dòng)物細(xì)胞工程3

1、二、動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)兩個(gè)細(xì)胞正在融合 受精作用人工條件下，如何促成動(dòng)物體細(xì)胞的融合？（一）動(dòng)物細(xì)胞融合（一）動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合誘導(dǎo)劑：細(xì)胞融合誘導(dǎo)劑： 滅活的病毒、滅活的病毒、（其它物理化學(xué)手段同（其它物理化學(xué)手段同植物體細(xì)胞雜交）植物體細(xì)胞雜交） 滅活的病毒滅活的病毒有絲分裂應(yīng)用：應(yīng)用： 主要用于制備單克隆主要用于制備單克隆抗體抗體滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理：滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理： 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上

2、的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開(kāi)，細(xì)胞白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開(kāi)，細(xì)胞發(fā)生融合。發(fā)生融合。 滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。能力，但并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株主要用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振動(dòng)、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞融合的原理動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的比較 如果患者想知道自己是否得了乙型肝炎，一般如果患者想知道自己是否得了乙型肝炎，一般是先檢查血液里是否有

3、病毒的蛋白質(zhì)，也就是病毒是先檢查血液里是否有病毒的蛋白質(zhì)，也就是病毒的抗原等的抗原等 2 1abc血清中的抗體血清中的抗體有時(shí)患者體內(nèi)無(wú)乙肝病毒，但是用血清抗體進(jìn)行檢驗(yàn)有時(shí)患者體內(nèi)無(wú)乙肝病毒，但是用血清抗體進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的免疫反應(yīng)（即假陽(yáng)性）。時(shí)，會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的免疫反應(yīng)（即假陽(yáng)性）。如何得到單一的抗體如何得到單一的抗體a a或或b b？人們獲得抗體的傳統(tǒng)方法是什么？人們獲得抗體的傳統(tǒng)方法是什么？ 細(xì)胞融合、細(xì)胞重組、雜交瘤技術(shù)細(xì)胞融合、細(xì)胞重組、雜交瘤技術(shù) 將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞（雜交細(xì)胞）。（雜交細(xì)胞）。 把不同細(xì)胞的部件重新組裝，包括核移把不

4、同細(xì)胞的部件重新組裝，包括核移植、葉綠體移植、核糖體重建及線粒體裝配等。植、葉綠體移植、核糖體重建及線粒體裝配等。 通過(guò)細(xì)胞融合產(chǎn)生特異雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞融合產(chǎn)生特異雜交瘤細(xì)胞，用于生產(chǎn)單克隆抗體。用于生產(chǎn)單克隆抗體。單克隆抗體制備的原理及流程單克隆抗體制備的原理及流程（二）單克隆抗體（二）單克隆抗體1）注射特定抗原）注射特定抗原4）篩選雜交瘤細(xì)胞）篩選雜交瘤細(xì)胞3）雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)）雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)1 制備過(guò)程：制備過(guò)程：5）細(xì)胞培養(yǎng)（克?。┘?xì)胞培養(yǎng)（克?。?）提取單克隆抗體）提取單克隆抗體2 單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)慰寺】贵w的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、靈敏度高特異性強(qiáng)、靈敏度高2）效應(yīng)）效應(yīng)b細(xì)胞細(xì)胞+骨

5、髓骨髓瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞1 1）作為體外診斷試劑）作為體外診斷試劑3 3 應(yīng)用應(yīng)用結(jié)合藥物的單克隆抗體結(jié)合藥物的單克隆抗體2 2）運(yùn)載藥物）運(yùn)載藥物 如制備生物導(dǎo)彈如制備生物導(dǎo)彈鼠源性的嵌合的 用于治療是很受限制的。原因是：用于治療是很受限制的。原因是：人源性的對(duì)鼠源化抗體進(jìn)行改造對(duì)鼠源化抗體進(jìn)行改造-蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程直接生產(chǎn)人源化抗體直接生產(chǎn)人源化抗體-基因工程基因工程 monoclonal antibodieskhlerkhler 和和 milstein 75milstein 75年建立的技年建立的技術(shù)，通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得的針對(duì)單一術(shù)，通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得的針對(duì)單一抗原決定

6、簇的高特異性抗體?？乖瓫Q定簇的高特異性抗體。1。細(xì)胞融合。細(xì)胞融合（1）動(dòng)物與抗原免疫：加強(qiáng)免疫）動(dòng)物與抗原免疫：加強(qiáng)免疫（2）骨髓瘤細(xì)胞：體外無(wú)限繁殖并不分泌抗體；）骨髓瘤細(xì)胞：體外無(wú)限繁殖并不分泌抗體；hgprt基因缺失，基因缺失，經(jīng)經(jīng)8-氮鳥嘌呤培養(yǎng)基篩選；對(duì)數(shù)期氮鳥嘌呤培養(yǎng)基篩選；對(duì)數(shù)期（3）免疫）免疫b細(xì)胞懸液制備：擠壓脾臟細(xì)胞懸液制備：擠壓脾臟（4）飼養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞生長(zhǎng)需要一定密度；融合細(xì)胞大量死亡需要）飼養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞生長(zhǎng)需要一定密度；融合細(xì)胞大量死亡需要清除；加入同種活細(xì)胞（飼養(yǎng)細(xì)胞）清除；加入同種活細(xì)胞（飼養(yǎng)細(xì)胞）小鼠腹腔細(xì)胞（巨噬細(xì)胞；小鼠腹腔細(xì)胞（巨噬細(xì)胞；分泌促細(xì)胞生長(zhǎng)因子

7、和分泌促細(xì)胞生長(zhǎng)因子和“清道夫清道夫”）；脾臟細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）；脾臟細(xì)胞和成纖維細(xì)胞（5）細(xì)胞融合：早期用仙臺(tái)病毒，現(xiàn)在用）細(xì)胞融合：早期用仙臺(tái)病毒，現(xiàn)在用peg，使細(xì)胞膜上脂質(zhì)，使細(xì)胞膜上脂質(zhì)結(jié)構(gòu)重新排列；瘤細(xì)胞：結(jié)構(gòu)重新排列；瘤細(xì)胞：b細(xì)胞細(xì)胞=1：5；加瘤細(xì)胞和；加瘤細(xì)胞和b細(xì)胞對(duì)照細(xì)胞對(duì)照（6）基礎(chǔ)培養(yǎng)系統(tǒng)：胎牛血清；無(wú)?？贵w；加抗生素）基礎(chǔ)培養(yǎng)系統(tǒng)：胎牛血清；無(wú)?？贵w；加抗生素2。選擇性培養(yǎng)。選擇性培養(yǎng)（1）hat培養(yǎng)液：細(xì)胞合成培養(yǎng)液：細(xì)胞合成dna有兩條途徑：一為主要途徑，有兩條途徑：一為主要途徑，利用糖和氨基酸合成核苷酸，氨基碟呤可阻斷；二為補(bǔ)救途徑，利用糖和氨基酸合成核苷酸

8、，氨基碟呤可阻斷；二為補(bǔ)救途徑，通過(guò)磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（通過(guò)磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hgprt）或胸腺嘧啶核苷激酶（）或胸腺嘧啶核苷激酶（tk）利）利用次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。所以骨髓瘤細(xì)胞缺乏用次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。所以骨髓瘤細(xì)胞缺乏hgprt和和tk，死亡；，死亡；b細(xì)胞具有細(xì)胞具有hgprt，但在體外不能長(zhǎng)期培，但在體外不能長(zhǎng)期培養(yǎng)，自然死亡；只有雜交瘤細(xì)胞從養(yǎng)，自然死亡；只有雜交瘤細(xì)胞從b細(xì)胞獲得細(xì)胞獲得hgprt或或tk基因基因在在hat培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖。培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖。（2）陽(yáng)性克隆篩選：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（）陽(yáng)性克隆篩選：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）檢驗(yàn)特異）檢驗(yàn)

9、特異性抗體性抗體（3）克隆化培養(yǎng)：）克隆化培養(yǎng)：1個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞/孔孔3。mcab擴(kuò)大生產(chǎn)：擴(kuò)大生產(chǎn)：（1）腹腔積液型（）腹腔積液型（2）細(xì)胞生物反應(yīng)器）細(xì)胞生物反應(yīng)器4。 mcab鑒定與純化鑒定與純化（1）單克隆抗體的鑒定（）單克隆抗體的鑒定（2）純化：辛酸或）純化：辛酸或硫酸銨鹽析；二抗采用蛋白硫酸銨鹽析；二抗采用蛋白a或蛋白或蛋白g層析層析monoclonal antibodies: 均一；純度、效價(jià)高；均一；純度、效價(jià)高； 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) 細(xì)胞合成細(xì)胞合成dnadna有有d d和和s s兩條途徑，其中兩條途徑，其中d d途徑能途徑能被氨基嘌呤阻斷。被氨基嘌呤阻斷。 淋巴細(xì)胞中有這兩種淋

10、巴細(xì)胞中有這兩種dnadna的合成途徑，但不能的合成途徑，但不能在體外無(wú)限增殖；骨髓瘤細(xì)胞中只有在體外無(wú)限增殖；骨髓瘤細(xì)胞中只有d d途徑，可途徑，可以在體外無(wú)限增殖。以在體外無(wú)限增殖。 將這兩種細(xì)胞在試管中混合，可以獲得兩兩將這兩種細(xì)胞在試管中混合，可以獲得兩兩融合的細(xì)胞。融合的細(xì)胞。 如何從融合的細(xì)胞中分離出雜交瘤細(xì)胞？如何從融合的細(xì)胞中分離出雜交瘤細(xì)胞？hathat培養(yǎng)基培養(yǎng)基 篩選雜交瘤細(xì)胞 將雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)。測(cè)定時(shí)，加入相應(yīng)的抗原等物質(zhì)，檢測(cè)各孔的上清液中細(xì)胞分泌的抗體，產(chǎn)生有色反應(yīng)的為陽(yáng)性。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 篩選特定的雜交瘤細(xì)胞 2 1 將雜交瘤細(xì)胞（細(xì)胞表面攜帶抗體）固定于微孔板上。測(cè)定時(shí)，加入抗原、酶標(biāo)抗體，清洗游離的成分之后，加入酶促反應(yīng)底物，產(chǎn)生有色反應(yīng)即為陽(yáng)性。 酶聯(lián)免