醫(yī)學(xué)高級職稱論文

1、5-aza-cdr對人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及tfpi-2 mrna表達(dá)的影響5-aza-cdr對人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及對人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及tfpi-2 mrna表達(dá)的表達(dá)的影響影響 作者：杜雅冰，邵應(yīng)舉，樊青霞，孫楨，王琳，趙培榮 作者單位：(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州450002) 【摘要】目的探討5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-aza-cdr)干預(yù)對食管鱗癌細(xì)胞株eca9706生長增殖及其組織因子途徑抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，tfpi-2)基因表達(dá)的影響。方法選取食管鱗癌細(xì)

2、胞株eca9706，并用不同濃度的5-aza-cdr處理該細(xì)胞株。mtt法檢測干預(yù)前后細(xì)胞增長率的變化，fcm法檢測干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化，rt-pcr技術(shù)檢測干預(yù)前后eca9706細(xì)胞tfpi-2基因mrna的表達(dá)，免疫組化檢測干預(yù)前后eca9706細(xì)胞tfpi-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果食管鱗癌細(xì)胞株eca9706存在tfpi-2基因超甲基化狀態(tài)，經(jīng)5-aza-cdr處理后，超甲基化狀態(tài)解除，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡率明顯提高(p0.05);細(xì)胞中tfpi-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)mrna的表達(dá)水平也較處理前明顯提高(p0.05)。結(jié)論食管癌細(xì)胞系tfpi-2基因超甲基化可抑制其mrna表達(dá)，

3、當(dāng)其超甲基化解除后，細(xì)胞增殖受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡率相應(yīng)提高。 【關(guān)鍵詞】 食管癌;組織因子途徑抑制物-2;5-氮雜-2-脫氧胞苷;甲基化;免疫組化;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng);凋亡 abstract： objectiveto explore the effects of 5-aza-2-deoxycytidine (5-aza-cdr) intervention on the growth and proliferation of eca9706 cell line and protein expression of tissue factor pathway inhibitor-2 (tfpi-2

4、). methodseca9706 cell line was treated by 5-azacdr of different concentrations; mtt， flow cytometry， immunohistochemistry and rt-pcr were used to determine the cell growth， apoptosis， and the expression of tfpi-2 gene and its protein. resultseca9706 cell line had hypermethylation of tfpi-2. after d

5、emethylation by 5-aza-cdr treatment， the proliferation of eca9706 was inhibited， the apoptosis rate was also increased significantly in the concentration-dependent manner. rt-pcr detected that mrna expression of tfpi-2 gene in eca9706 cell line recovered significantly (p0.05). conclusion5-aza-cdr ca

6、n slow the growth of eca9706 cell， increase the apoptosis rate， reactivate the tfpi-2 gene transcription and protein expression by demethylation. key words： esophageal carcinoma; tissue factor pathway inhibitor-2; 5-aza-cdr; methylation; immunohistochemistry; rt-pcr; apoptosis 組織因子途徑移植物2(tissue fact

7、or pathway inhibitor， tfpi-2)是絲氨酸蛋白酶抑制物，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。目前，關(guān)于tfpi-2在食管癌中的基因表達(dá)情況的分析研究尚少。本研究旨在探討tfpi-2基因的失活機(jī)制，并尋找食管癌治療的新靶點(diǎn)。 1材料與方法 1.1材料 rpmi-1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物科技有限公司;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自天津市灝洋生物制品科技有限公司;trizol試劑購自mbi公司;rt-pcr試劑盒購自mbi公司;5-aza-cdr購自sigma公司;人食管癌細(xì)胞株eca9706由鄭州大學(xué)腫瘤生物學(xué)研究室惠贈。 1.2細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 人食管癌細(xì)胞eca9706

8、以含10 ml/l胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，37 、50 ml/l co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每23 d消化傳代1次。 1.3mtt法檢測干預(yù)前后細(xì)胞增長率的變化 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度至5104/ml接種于96孔板，按5-aza-cdr濃度分為6組：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mol/l，每組復(fù)設(shè)5個(gè)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別于24、48、72 h后加入mtt液，4 h后棄去上清液，每孔加dmso 150 l，在490 nm波長測定各孔吸光度值(absorbance，a)。細(xì)胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，

9、cpir)按公式計(jì)算：cpir=(1-實(shí)驗(yàn)組a均值/對照組a均值)100%。 1.4流式細(xì)胞儀(fcm)檢測干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按5105/ml的密度接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后加藥，分組如下：對照組(0 mol/l),1.6 mol/l 5-aza-cdr組，25.6 mol/l 5-aza-cdr組，102.4 mol/l 5-aza-cdr組。每組均于5-aza-cdr作用48 h后消化收集細(xì)胞，700 ml/l冰乙醇固定，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡測定。 1.5rt-pcr技術(shù)檢測tfpi-2基因mrna的表達(dá) 分組同fcm，每組細(xì)胞均5-aza-cdr作用48 h

10、。tfpi-2的上、下游引物分別為5-gtcgattctgctgttttcc-3和5-atggaattttc tttggtgcg-3，合成產(chǎn)物為440 bp;-actin作為內(nèi)參照，上下游引物分別為5-aggcattgtgatggactccg-3和5-agtgatgacctggccgtcag-3，合成產(chǎn)物為301 bp。按照試劑盒說明書，用trizol試劑提取細(xì)胞總rna，經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析后，按sigma公司revertaid first strand cdna synthesis kit說明書操作。先逆轉(zhuǎn)錄制備單鏈cdna，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用上、下游產(chǎn)物進(jìn)行pcr反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。

11、反應(yīng)條件為：94 預(yù)變性3 min，然后94 變性30 s,51 退火30 s,72 延伸30 s，循環(huán)30次，最后72 延伸5 min,4 保溫。擴(kuò)增片段經(jīng)20 g/l瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 1.6免疫組化方法檢測tfpi-2蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按5104/ml的密度接種于經(jīng)預(yù)處理的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后加藥(分組同rt-pcr)。培養(yǎng)48 h后加入40 g/l多聚甲醛溶液固定30 min,30 ml/l h2o2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下10 min,100 ml/l動物血清封閉，室溫下10 min，滴加1 100的稀釋的tfpi-2抗體4 過夜，二抗室溫下1 h，滴加辣根酶標(biāo)記

12、鏈霉卵白素，37 孵育30 min，dab顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片。另取爬片滴加pbs 液代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：tfpi-2蛋白陽性信號均呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野(每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè))，按陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行結(jié)果判定。陽性率=(陽性細(xì)胞數(shù)/1 000)100%。 1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用spss16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x-s)表示，采用單因素方差分析加lsd兩兩比較法進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。 2結(jié)果 2.1干預(yù)前后細(xì)胞增長率的變化 經(jīng)mtt檢測，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率明顯高于未加藥組，且隨著作

13、用時(shí)間的延長和濃度的增加而增加(表1)。表1不同濃度的5-aza-cdr對eca9706細(xì)胞增殖的影響 2.2干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化 流式細(xì)胞儀分析可見，經(jīng)不同濃度5-aza-cdr誘導(dǎo)48 h后，eca9706細(xì)胞各處理組凋亡率分別為(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%，與5-aza-cdr誘導(dǎo)濃度成正比。與對照組(1.390.27)%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)，且各濃度組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05，圖1)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。 2.3干預(yù)前后eca9706細(xì)胞mrna的表達(dá)情況 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，eca9706細(xì)胞中tf

14、pi-2 mrna表達(dá)在各用藥組和未用藥組之間有明顯差異，tfpi-2 mrna在未用藥組細(xì)胞中未見表達(dá)。經(jīng)1.6、25.6、102.4 mol/l 5-aza-cdr處理后可見tfpi-2 mrna表達(dá)，表明在一定范圍內(nèi)隨5-aza-cdr藥物濃度的增加tfpi-2 mrna表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖2)。圖1各組流式細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖a：對照組;b：1.6 mol/l 5-aza-cdr組;c：25.6 mol/l 5-aza-cdr組;d：102.4 mol/l 5-aza-cdr組。圖25-aza-cdr處理前后eca9706細(xì)胞tfpi-2 mrna的表達(dá)m：dna marker;-actin：3

15、01 bp;tfpi-2：440 bp;1：對照組;2：102.4mol/l組;3：25.6 mol/l組;4：1.6 mol/l組;5：h2o對照組。,2.4干預(yù)前后tfpi-2蛋白的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)5-aza-cdr作用eca9706細(xì)胞48 h，tfpi-2蛋白的陽性表達(dá)率增加，對照組、1.6 mol/l組、25.6 mol/l組、102.4 mol/l組tfpi-2蛋白的陽性表達(dá)率分別為(2.101.42)%、(9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同濃度組之間以及用藥組與對照組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05，圖3)。圖3各組tf

16、pi-2蛋白的表達(dá)情況 3討論 人tfpi-2(htfpi-2)基因定位于7q22區(qū)域，全長由8164個(gè)堿基組成，其cdna全長為1 222 kb。其mrna的啟動子具有典型的管家基因特征，沒有典型的tata盒或caat盒，在推定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域gc含量超過80%1。tfpi-2可在體內(nèi)多種組織廣泛表達(dá)，在這些組織內(nèi)一旦出現(xiàn)腫瘤，tfpi-2的表達(dá)水平也會隨之顯著下降2。有研究證實(shí)，在絨毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維肉瘤和胸部惡性腫瘤組織中，與腫瘤產(chǎn)生相關(guān)的tfpi-2表達(dá)水平減少可能與其啟動子的甲基化密切相關(guān)1,3-5。啟動子區(qū)cpg島高甲基化在腫瘤形成機(jī)制中的確切作用尚不

17、清楚，然而眾多證據(jù)表明，腫瘤抑癌基因cpg島異常的甲基化導(dǎo)致基因失活和轉(zhuǎn)錄抑制是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一6-8。 目前，有體外實(shí)驗(yàn)表明，dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-cdr通過去甲基化作用可使多種含有cpg島的高甲基化抑癌基因重新表達(dá)，從而恢復(fù)抑癌功能9。本實(shí)驗(yàn)rt-pcr結(jié)果顯示，tfpi-2在eca9706細(xì)胞中無表達(dá)，經(jīng)過不同濃度的5-aza-cdr處理eca9706細(xì)胞后，tfpi-2亦重新出現(xiàn)表達(dá)，且在一定范圍內(nèi)隨藥物誘導(dǎo)濃度的增大表達(dá)逐漸增強(qiáng)。mizuno等10研究表明，腫瘤細(xì)胞中dnmt的表達(dá)較正常的高412倍，也證實(shí)dnmt上調(diào)參與腫瘤發(fā)生。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)mtt

18、實(shí)驗(yàn)可知，經(jīng)過5-aza-cdr干預(yù)處理過的eca9706細(xì)胞增殖明顯受抑制，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用越明顯。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，dna啟動子區(qū)去甲基化能較明顯地抑制食管癌細(xì)胞增殖，并與其誘導(dǎo)劑量呈正相關(guān)，推測這種抑制作用與去甲基化后重新激活tfpi-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有著直接關(guān)系;此外可能與去甲基化后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。進(jìn)而通過流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度5-aza-cdr干預(yù)的eca9706的細(xì)胞中，用藥組與對照組相比細(xì)胞凋亡率凋亡率有所增加，并且與5-aza-cdr誘導(dǎo)劑量有依賴性關(guān)系。bender等11在同等條件下用5-aza-cdr處理惡性腫瘤細(xì)胞系和正常纖維細(xì)胞系時(shí)，發(fā)現(xiàn)

19、腫瘤細(xì)胞增殖均被抑制，而纖維細(xì)胞增殖不被抑制。因此，5-aza-cdr對eca9706細(xì)胞增殖的抑制及凋亡的增加不是藥物的毒性影響，可能是因?yàn)槭箃fpi-2重新表達(dá)的結(jié)果。 目前，國外以tfpi-2為藥物研究靶點(diǎn)，就tfpi-2在腫瘤治療、腫瘤臨床診斷、促進(jìn)傷口愈合和動脈粥樣硬化治療等領(lǐng)域中的應(yīng)用，也正在進(jìn)行廣泛深入的研究。本研究用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-cdr處理人食管癌eca9706細(xì)胞株，檢測tfpi-2基因表達(dá)的變化及其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期尋找治療腫瘤的新靶點(diǎn)。 【參考文獻(xiàn)】 1hube f， reberdiau p， iochmann s， et al. characte

20、rization and functional analysis of tfpi-2 gene promoter in a human choriocarcinoma cell line j. thromb res， 203， 109(4)：207-215. 2miyagii y， koshikawa n， yasumitsu h， et al. cdna cloning and mrna expression of a serine protein 5 and tissue factor pathway inhibitor-2 j. j biochem， 1994， 116(5)：939-9

21、42. 3rao cn， segawa t， navari jr， et al. methylation of tfpi-2 gene is not the sole cause of its silencing j. int j oncol， 2003， 22(4)：843-848. 4konduri sd， srivenugopal ks， yanamandra n， et al. promoter methyl and silencing of the tissue factor pathway inhibitor-2(tfpi-2)， a gene encoding an inhibi

22、tor of matrix metalloproteinases in human glioma cells j. oncogene， 2003， 22(29)：4509-416. 5steiner fa， hong ja， fischette mr， et al. sequential5-aza-2-deoxycytidi- ne/depsipeptide fk228 treatment induces tissue factor pathway inhibitor 2(tfpi-2) expression in cancer cells j. oncogene， 2005， 24(14)：2386-2397. 6herman jg， baylin sb. promoter-region hypermethylation and gene silencing in human cancer j. curr top microbiol immunol， 2000， 249：35-54. 7jones pa， baylin sb. the