分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案

1、河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案課程名稱 分子生物學(xué) 指導(dǎo)教師 李市場(chǎng) 河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案首頁(yè)實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)一、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)4每次實(shí)驗(yàn)組數(shù)6每組人數(shù)5實(shí)驗(yàn)類型綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：控溫?fù)u床(37)，高速冷凍離心機(jī)，水浴鍋，冰箱（-20,70）超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱(37)，752分光光度計(jì)，滅菌鍋等。實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)菌處于容易吸收外源dna的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒dna或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)人細(xì)菌的過(guò)程。其原理是細(xì)菌處于0，cacl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的dna形成抗dna酶

2、的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收dna復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)中獲得的新的表型（如ampr等）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源dna。將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求： 實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求把每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟都進(jìn)行分析。注意事項(xiàng)：無(wú)菌操作 低溫操作實(shí)驗(yàn)一 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理 將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體

3、細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源dna。轉(zhuǎn)化(transformation)是將外源dna分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(r,m),它可以容忍外源dna分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的od600 來(lái)控制。dh5菌株的od600 為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌

4、株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 1ng的cccdna即可使50l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,dna溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5。3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如cacl2 等均需是最高純度的(gr.或ar.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜dna的污染。 本實(shí)驗(yàn)以e.coli dh5a菌株為受體細(xì)胞,并用cacl2處理,使其處于感受態(tài),然后與puc19質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于puc19質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(ampr )，可通過(guò)amp抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)入puc19，

5、則在含amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了puc19。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。一. 儀器 控溫?fù)u床(37) 高速冷凍離心機(jī)水浴鍋 冰箱（-20,70）超凈工作臺(tái) 培養(yǎng)箱(37) 752分光光度計(jì) 滅菌鍋二. 試劑 cacl2 無(wú)菌水,冰胰蛋白胨 酵母粉 amp nacl三. 其他用品移液器， 槍頭1.5ml ,50ml 離心管 三角瓶 500ml 200ml 6cm平皿 試劑瓶60ml量筒 燒杯瓊脂 甘油酒精燈 三角玻棒酒精棉球 火柴溶液配制 0.1 mol/l cacl2溶液 配置 滅菌lb液體培養(yǎng)基氨芐青霉

6、素（amp），用無(wú)菌水配制成50_60 mg/ml溶液，抽慮滅菌置20冰箱中保存。四. 材料 e.coli.dh5 質(zhì)粒 dna 五: 實(shí)驗(yàn)步驟：(cacl2) （20人一班，分三組）第一天：從大腸桿菌dh5平板上挑取一個(gè)單菌落接于2 ml lb液體培養(yǎng)基的試管中,37振蕩培過(guò)夜。 第二天：1. 取0.5 ml菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有50 ml lb液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37振蕩培養(yǎng)23 h(此時(shí)，od600 0.4-0.5，細(xì)胞數(shù)務(wù)必 108ml。此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵)3. 將菌液轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，冰上放置10 min。4. 離心10 min（4000r/min）,回收細(xì)胞。45. 倒出培養(yǎng)液

7、，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡。6. 用冰冷的0.1 mol/l cacl2 10 ml懸浮沉淀，立即放在冰上30 min。7. 04 6000 r/min,離心10 min，回收細(xì)胞。8. 用冰冷的0.1mol/l cacl2 2 ml懸浮細(xì)胞，（務(wù)必放在冰上）。9. 分裝細(xì)胞，每200 l一份。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化：10. 取200 l新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入dna 2 l（50 ng ）混勻冰上放置30 min。同時(shí)作兩個(gè)對(duì)照管受體菌對(duì)照：200 l感受態(tài)細(xì)胞2 l無(wú)菌水質(zhì)粒對(duì)照：200 l 0.1 mol/l cacl2溶液2 l 質(zhì)粒dna溶液11 .將管放到42循環(huán)水浴12

8、 min。12. 冰浴2 min。13. 每管加800 l lb液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1 h（慢搖）。14. 將適當(dāng)體積（200 l）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。15. 倒置平皿37培養(yǎng)1216 h，出現(xiàn)菌落。16.計(jì)算轉(zhuǎn)化效率關(guān)于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化講解：1、 感受態(tài)細(xì)胞的概念重組dna分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱為重組dna分子的轉(zhuǎn)化。在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體

9、菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源dna片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。camp可以使感受態(tài)水平提高一萬(wàn)倍，而ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無(wú)菌甘油或-70保存（有效期6個(gè)月）。2、 轉(zhuǎn)化的概念及原理在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒dna或以其為載體構(gòu)建的重組dna導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工

10、程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。 受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：電擊法，cacl2等化學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源dna分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的dna分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法（cacl2法），該法最先是由cohen于1972年發(fā)現(xiàn)的。其原理是細(xì)菌處于0，cacl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的dna形成抗dnase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收dna復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基

11、因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到5×1062×107轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒dna，可以滿足一般的基因克隆試驗(yàn)。如在ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它的二價(jià)金屬離子（如mn2+、co2+）、dmso或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高1001000倍?；瘜W(xué)法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，菌株適用范圍廣，感受態(tài)細(xì)菌可以在-70保存，因此被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)化。除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使dna進(jìn)入細(xì)菌，轉(zhuǎn)化率最高能達(dá)到1091010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)dna。因操作

12、簡(jiǎn)便，愈來(lái)愈為人們所接受。3、 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素、細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的od600控制。對(duì)tg1菌株，od600為05時(shí)，細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右。（應(yīng)注意od600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過(guò)高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且

13、受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。、質(zhì)粒dna的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒dna應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源dna的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源dna的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，dna溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，重組dna分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10100倍，因此重組dna大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。、試劑的質(zhì)量所用的cacl2等試劑

14、均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4。、防止雜菌和雜dna的污染整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜dna的轉(zhuǎn)入。、整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開(kāi)冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒dna的提取及其酶切實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)4每次實(shí)驗(yàn)組數(shù)6每組人數(shù)5實(shí)驗(yàn)類型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒dna。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：微量移液器，微量離心管，常用玻璃器皿，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，臺(tái)式離心機(jī)，高壓滅菌鍋實(shí)驗(yàn)原理：

15、堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna與線性染色體dna在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。 在ph值介于12.012.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的dna雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒dna的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互纏繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入ph4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)ph 至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒dna的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體dna的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開(kāi)，復(fù)性就不會(huì)那木迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體dna與不穩(wěn)定的大分子rna，蛋白質(zhì)sds復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 用堿

16、裂解法提取質(zhì)粒dna學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：分析實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)步驟。注意事項(xiàng)：1、時(shí)間要嚴(yán)格控制；2、注意實(shí)驗(yàn)所用的溫度。河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案首頁(yè)實(shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒dna的提取及其酶切實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒dna。實(shí)驗(yàn)原理 堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna與線性染色體dna在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。 在ph值介于12.012.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的dna雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒dna的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互纏繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入ph4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)ph 至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒dna的兩條互

17、補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體dna的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開(kāi)，復(fù)性就不會(huì)那木迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體dna與不穩(wěn)定的大分子rna，蛋白質(zhì)sds復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。實(shí)驗(yàn)儀器：微量移液器，微量離心管，常用玻璃器皿，臺(tái)式高速離心機(jī)，分光光度計(jì)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，臺(tái)式離心機(jī)，高壓滅菌鍋。試劑及溶液：(1) 用堿法提取質(zhì)粒dna溶液1（get緩沖液）：50 mmol葡萄糖， 10mmol/l edta，25mmol/ltris.hci ph 8.o，用前加溶菌酶4rngml。溶液2（變性液）：02 rnoi/i naoh，1 sds。溶液3

18、（乙酸鉀溶液）：60 ml的5 moll kac, 11.5 ml,冰醋酸，28.5ml h2o。（2）緩沖液ecor酶解緩沖液（l 0×）tbe緩沖液（i o×）：稱取tris 108g,硼酸55g, 0.5moil, edta（ph8.o）40 ml，用h2o定容到l000 ml，高壓滅菌作為l 0×貯液9稀釋1 0倍后作為工作液使用。te緩沖液：1 0 rnmoll tris hcl， i mmoll edta ph 8.o，其中含有rnase2 0 µgml。（3）上樣液及其他試劑上樣液（6×）：0.25溴酚藍(lán),質(zhì)量濃度40蔗糖水溶液。

19、溴化乙啶染色液（10 rngm t）：在20ml水中溶解0.2g溴化乙啶，混勻后4避光保存。異丙醇，7 0乙醇等。實(shí)驗(yàn)步驟（一） 提取質(zhì)粒1. 將2 ml 含相應(yīng)抗生素的lb液體培養(yǎng)基加入試管中，接入上述的含puc19質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2. 取培養(yǎng)物倒入微量1.5ml離心管中，4000 r/min 離心 2 min。3. 棄上清，吸盡殘液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。4. 加入100ul溶液，充分混勻，室溫放置10 min。加200 ul溶液 （新鮮配制），蓋緊管蓋，輕輕顛倒數(shù)次混勻，將離心管放冰上5min。5. 加入150ul溶液 （冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上

20、放置15min。6. 12000 r/min ,離心15 min ，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。7. 加入等體積酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反復(fù)混勻，12000 r/min，離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。8. 加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后，室溫放置510 min。12000r/min離心 5 min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。9. 用1 ml 70% 乙醇洗滌質(zhì)粒dna沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。10. 加50 ul te緩沖液，其中含有20 ug/ml的胰rna酶，使dna完全溶解，20保存。（二）酶切取dna溶液，加酶切緩沖液，ecor

21、i酶1 ul，無(wú)菌水補(bǔ)至總體積10 ul，37保溫3h,加終止液，準(zhǔn)備下個(gè)實(shí)驗(yàn)電泳，分析質(zhì)粒dna的限制性酶切圖譜。質(zhì)粒提取的關(guān)鍵問(wèn)題即質(zhì)粒提取中三種溶液的作用：堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液： 溶液i，50 mm葡萄糖 / 25 mm tris-cl / 10 mm edta，ph 8.0； 溶液ii，0.2 n naoh / 1% sds； 溶液iii，3 m 醋酸鉀 / 2 m 醋酸。 讓我們先來(lái)看看溶液i的作用。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的ph，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)ph值的tris-cl溶液，是再自然不過(guò)的了。那么50 mm葡萄糖是干什么的呢？說(shuō)起來(lái)不可思議，加了葡萄糖后最大的好處

22、只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液i中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒(méi)有任何影響。所以說(shuō)溶液i中葡萄糖是可缺的。那么edta呢？大家知道edta是ca2+和mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制dnase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液i中加入高達(dá) 10 mm 的edta，無(wú)非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加edta，其實(shí)也沒(méi)什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕dna會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的te緩沖液中有edta。如果哪天你手上正好缺了溶液i，可不可以抽提質(zhì)

23、粒呢？實(shí)話告訴你，只要用等體積的水，或lb培養(yǎng)基來(lái)懸浮菌體就可以了。有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。 輪到溶液ii了。這是用新鮮的0.4 n的naoh和2的sds等體積混合后使用的。要新從濃naoh稀釋制備0.4n的naoh，無(wú)非是為了保證naoh沒(méi)有吸收空氣中的co2而減弱了堿性。很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是sds，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上naoh是最佳 的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 n naoh，即

24、便是有sds也無(wú)法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用sds當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)閟ds也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)naoh的作用誤以為是為了讓基因組dna變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)dna變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是naoh溶解的細(xì)胞，那為什么要加sds呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，千萬(wàn)不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組dna片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對(duì)待女孩子一樣），不然基因組dna也會(huì)斷裂?；蚪Mdna的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩。每個(gè)人都知道，

25、溶液iii加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)sds碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的sds溶液中加如2m的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與sds的加入有關(guān)系。如果在溶液ii中不加sds會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然sds不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1的sds溶液中慢慢加入5 n的nacl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)sds在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了sds的沉淀。但如果你加入的不是nacl而是kcl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷

26、基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, pds），而pds是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液iii加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了sds中的鈉離子形成了不溶性的pds，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道sds專門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)sds分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組dna也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪Mdna太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的dna自然容易被pds給共沉淀了，盡管sds并不與dna分子結(jié)合

27、。那么2 m的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和naoh，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷dna，所以要中和之?；蚪Mdna一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被pds共沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組dna混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總dna條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液iii加入后基因組dna無(wú)法快速?gòu)?fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，dna分子在中性溶液中都是溶解的。naoh本來(lái)是為了溶解細(xì)胞而用的，dna分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來(lái)其實(shí)沒(méi)有關(guān)系。溶液iii加入并混合均勻后在冰

28、上放置，目的是為了pds沉淀更充分一點(diǎn)。 不要以為pds沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實(shí)還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒dna，不然時(shí)間一長(zhǎng)就會(huì)因?yàn)榛烊氲膁nase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個(gè)全面的介紹。酚（phenol）對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來(lái)最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4m的異硫氰酸胍），離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還

29、有一點(diǎn)，酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就會(huì)被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收?；厥蘸蟮乃嗪凶銐蚨嗟柠}，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒dna沉淀出來(lái)。這時(shí)候如果放到20，時(shí)間一長(zhǎng)反而會(huì)導(dǎo)致大量鹽的沉淀，這點(diǎn)不同于普通的dna酒精沉淀回收，所以不要過(guò)分小心了。高濃

30、度的鹽會(huì)水合大量的水分子，因此dna分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺(jué)發(fā)生了鹽的沉淀，就用70的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個(gè)小時(shí)以上，并用tip將沉淀打碎，就能得到好的樣品。得到的質(zhì)粒樣品一般用含rnase（50 ug/ml）的te緩沖液進(jìn)行溶解，不然大量未降解的rna會(huì)干擾電泳結(jié)果的.河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案首頁(yè)實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)三、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)4每次實(shí)驗(yàn)組數(shù)6每組人數(shù)5實(shí)驗(yàn)類型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dna的方法和技術(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：恒溫培養(yǎng)箱，瓊脂糖凝膠電泳，臺(tái)式離心機(jī)，高壓滅菌鍋，紫外線投射儀器。實(shí)驗(yàn)原理： dna分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)

31、時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。dna分子在高于等電點(diǎn)的ph溶液中帶負(fù)電荷在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈dna幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，dna分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即dna分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的dna片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。dna分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系.。凝膠電泳不僅可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的dna, 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同,但構(gòu)型不同的dna分子。如上次實(shí)驗(yàn)提取的puc19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna(covalentl

32、y closed circular dna，簡(jiǎn)稱 cccdna)，開(kāi)環(huán)質(zhì)粒dna，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna1條鏈斷裂，（open circular dna, 簡(jiǎn)稱ocdna）,線狀質(zhì)粒dna ，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna2條鏈發(fā)生斷裂，（linear dna，簡(jiǎn)稱l dna）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒dna分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒dna泳動(dòng)最快，其次為線狀dna，開(kāi)環(huán)質(zhì)粒dna。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：利用電泳技術(shù)分離已經(jīng)酶切過(guò)的質(zhì)粒dna.學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：要求星期一做完實(shí)驗(yàn)后，星期五交上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有圖示。注意事項(xiàng)：1、注意瓊脂糖的濃度，2、用溴化乙錠染色時(shí)要戴上手套。實(shí)驗(yàn)三

33、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dna的方法和技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理dna分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。dna分子在高于等電點(diǎn)的ph溶液中帶負(fù)電荷在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈dna幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，dna分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即dna分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的dna片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。dna分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系.。凝膠電泳不僅可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的dna, 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同,但構(gòu)

34、型不同的dna分子。如上次實(shí)驗(yàn)提取的puc19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna(covalently closed circular dna，簡(jiǎn)稱 cccdna)，開(kāi)環(huán)質(zhì)粒dna，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna1條鏈斷裂，（open circular dna, 簡(jiǎn)稱ocdna）,線狀質(zhì)粒dna ，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna2條鏈發(fā)生斷裂，（linear dna，簡(jiǎn)稱l dna）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒dna分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒dna泳動(dòng)最快，其次為線狀dna，開(kāi)環(huán)質(zhì)粒dna。儀器、材料與試劑一、儀器1.恒溫培養(yǎng)箱2.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)3.臺(tái)式離心機(jī)4.

35、高壓滅菌鍋5.紫外線透射儀二、材料1.三羥甲基氨基甲烷(tris)2.硼酸3.乙二胺四乙酸(edta)4.溴酚藍(lán)5.蔗糖6.瓊脂糖7.溴化乙錠8.dna marker實(shí)驗(yàn)步驟(一) 制備瓊脂糖凝膠電泳槽及用膠量：稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml0.5×tbe緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化取出搖勻，則為1%的瓊脂糖凝膠液。冷卻至60, 加入適量eb, 混勻。 （二）膠板的制備1. 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴(yán)，不能留縫隙）。2. 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。梳子調(diào)整齊3. 將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液

36、，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。4. 待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，將膠槽放在電泳槽內(nèi)。5. 加入電泳緩沖液至電泳槽中。 （三）加樣, 用移液器將已加入上樣緩沖液的dna樣品加入樣品孔（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。 （四）電泳1. 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，dna片段從負(fù)極向正極移動(dòng)）。dna的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過(guò)5 v/cm。 2. 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。 （五）染色將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液中，染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作）。問(wèn)題討論1）在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒dna是共價(jià)閉環(huán)dn

37、a（covalently closed circular dn a，cccdna），常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處缺刻，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開(kāi)環(huán)dna（open circular dna，ocdna）；若兩條鏈在同一處或其附近斷裂，則變成性狀d n a分子。在電泳時(shí)，同一質(zhì)粒的電泳速度因dna的構(gòu)型不同而異，其次序?yàn)椋篶ccdna直線dnaocdna，因此在本次實(shí)驗(yàn)中瓊脂糖凝膠電泳上的自制質(zhì)粒呈現(xiàn)3條帶。如果你不小心在溶液ii（實(shí)驗(yàn)二）加入后過(guò)度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組dna的片斷

38、。 非常偶然的是，有時(shí)候抽提到的質(zhì)粒會(huì)有710條帶，這是由于特殊的dna序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。2）瓊脂糖是一種從海藻中提取出來(lái)的線狀高聚物，當(dāng)熔化再凝固后就會(huì)形成固體基質(zhì)，其密度取決于溶液中所含瓊脂糖的量。帶負(fù)電荷的核酸就可以在這種基質(zhì)中。于電場(chǎng)的作用下向陽(yáng)極移動(dòng)。核酸在瓊脂糖基質(zhì)中的遷移率取決于下列參數(shù)：dn a的分子大??；瓊脂糖的濃度；dna的構(gòu)象；所加電壓；電場(chǎng)方向；堿基組成與溫度；嵌入的染料；電泳緩沖液的組成等。瓊脂糖濃度對(duì)核酸遷移率的影響是：一定大小的dna片段，在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移率不同；在一定濃度的瓊脂糖凝膠能夠分辨的核酸片段大小范圍內(nèi)，核

39、酸片段的遷移率與其相對(duì)分子質(zhì)量大小相反。3）溴化乙啶的化學(xué)名稱是3， 8二氨基r乙基6一苯基菲錠溴鹽（3，sdiamino5ethyl6phenylphenanthridinium bromide，簡(jiǎn)稱ethidiumbromide或eb或etbr），由于溴化乙錠分子插入，在紫外光的照射下，瓊脂糖凝膠電泳中dna的條帶呈現(xiàn)出桔黃色的熒光，便于檢測(cè)。eb能插人dna分子中的堿基對(duì)之間，完成與dna結(jié)合（超螺旋dna與eb結(jié)合能力小于雙鏈閉環(huán)，而雙鏈閉環(huán)dna與eb結(jié)合能力小于線狀雙鏈dna），dna所吸收的260nm的紫外光（uv）傳遞給fe，或者結(jié)合的eb本身在3o0nm和360nm吸收的射線

40、均在可見(jiàn)光譜的紅橙區(qū)，以590nm波長(zhǎng)發(fā)射出來(lái)。eb染色具有以下特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便快速，室溫下染色15mm20mm；不會(huì)使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的dna即可檢出；可以加到樣品中，隨時(shí)用紫外吸收追蹤檢查。但應(yīng)該特別注意的是，溴化乙啶是誘變劑，配制和使用時(shí)應(yīng)戴乳膠（或一次性塑料）手套，并且不要將該染色液灑在桌面或地面上。凡是沾污溴化乙啶的器皿或物品，必須經(jīng)特殊處理后，再進(jìn)行清洗或棄去。河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案首頁(yè)實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)四植物基因組dna的提取實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)4每次實(shí)驗(yàn)組數(shù)6每組人數(shù)5實(shí)驗(yàn)類型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)從植物組織中提取dna的方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：低溫離心機(jī)，臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋，紫外分光光度計(jì)，液氮灌等。實(shí)驗(yàn)原理：