獸藥殘留的檢測方法(定稿文件)

1、說 明 書 摘 要本發(fā)明提供一種獸藥的檢測方法，所述方法包括如下步驟：（1）樣品的處理：將待測樣品進行前處理，加入提取劑后經(jīng)過多個步驟處理得到上清液過濾得到的濾液用于UPLC-MS/MS測定；（2）獸藥殘留的測定，將得到的樣品在一定的測定條件下進行超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的測定。本發(fā)明的檢測方法具有靈敏度高，專屬性強的特點，能夠滿足獸藥殘留的測定。5權(quán) 利 要 求 書 1. 一種獸藥殘留的檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：（1）樣品的處理：將待測樣品進行前處理，加入提取劑后進行勻漿，之后進行超聲提取，之后進行第一次離心分離得到上清液，用氮氣將上清液吹干后得到的殘余物用初始流動相溶解，

2、混勻，之后進行第二次離心分離得到上清液，取上清液進行微孔濾膜過濾得到的濾液用于UPLC-MS/MS測定；（2）獸藥殘留的測定將步驟（1）得到的樣品進行超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的測定，測定條件如下：色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動相為甲醇和甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)；源溫為105-115；脫溶劑溫度為340-360；脫溶劑氣流速度為600L·h-1-700L·h-1；錐孔反吹氣流速度為45 L·h-1-55L·h-1。2. 如權(quán)利要求1所述的獸藥殘留的檢測方法，其中所述

3、獸藥為四環(huán)素類藥物、受體激動劑類藥物、喹諾酮類藥物、磺胺類藥物。3. 如權(quán)利要求1或2所述的獸藥殘留的檢測方法，其中所述獸藥為四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素、特步他林、西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、噴布洛爾、苯乙醇胺A、培氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，氧氟沙星，伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、西諾沙星、諾氟沙星、達氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯達嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲異噁唑

4、、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一種、幾種或全部。4. 如權(quán)利要求1-3任一項所述的獸藥殘留的檢測方法，步驟（2）所述梯度洗脫程序為：0-10.0 min：甲醇的體積比為3.0-90.0%；10.0-10.1min：甲醇的體積比為90.0-3.0；10.1-13.0 min：甲醇的體積比為3.0。5. 如權(quán)利要求1-4任一項所述的獸藥殘留的檢測方法，其中步驟（1）所述氮氣吹干上清液的溫度為25-35，優(yōu)選在30下進行。6. 如權(quán)利要求1-5任一項所述的獸藥殘留的檢測方法，其中步驟（1）所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為9000 r·min-1-11000 r·

5、;min-1，離心的時間為8 min -12min，優(yōu)選所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為10000 r·min-1，離心的時間為10 min。7. 如權(quán)利要求1-6任一項所述的獸藥殘留的檢測方法，其中步驟（1）所述提取劑為10%三氯乙酸水溶液與乙腈的混合溶液；優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液：乙腈=（1525）：（7585）；更優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液：乙腈=20：80。8. 如權(quán)利要求1-7任一項所述的獸藥殘留的檢測方法，其中步驟（1）所述在第一次離心分離后得到上清液的同時得到沉淀，對沉淀進行再次提取，得到上清液與第一次離心分離得到的上清液進行合并，將合并

6、后的上清液進行下一步驟的氮氣吹干。9. 如權(quán)利要求1-8任一項所述的獸藥殘留的檢測方法，其中步驟（2）的甲酸水溶液的質(zhì)量濃度為0.04-0.07，優(yōu)選質(zhì)量濃度為0.05。10. 如權(quán)利要求1-9任一項所述的獸藥殘留的檢測方法，其中步驟（2）所述色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動相為甲醇和甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)；毛細管電壓為3.5 KV；錐孔電壓為3.0 V；RF透鏡電壓為0.5 V；源溫為110；脫溶劑溫度為350；脫溶劑氣流速度為650L·

7、;h-1；錐孔反吹氣流速度為50L·h-1。說 明 書一種獸藥殘留的檢測方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及以一種檢測方法，特別是涉及一種獸藥殘留的檢測方法。背景技術(shù)獸藥在防治動物疾病、提高生產(chǎn)效率、改善畜產(chǎn)品質(zhì)量等方面起著十分重要的作用。然而，由于養(yǎng)殖人員對科學(xué)知識的缺乏以及一味地追求經(jīng)濟利益，致使濫用獸藥現(xiàn)象在當(dāng)前畜牧業(yè)中普遍存在。隨著人們對動物源食品由需求型向質(zhì)量型的轉(zhuǎn)變，動物源食品中的獸藥殘留已逐漸成為全世界關(guān)注的一個焦點。獸藥殘留是指用藥后蓄積或存留于畜禽機體或產(chǎn)品(如雞蛋、奶品、肉品等)中原型藥物或其代謝產(chǎn)物，包括與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)殘留。目前，在動物源食品中較容易引起獸藥殘留量超標(biāo)的獸藥

8、主要有抗生素類、磺胺類和激素類等藥物。濫用獸藥極易造成動物源食品中有害物質(zhì)的殘留，這對人體健康造成直接危害。例如長期食用獸藥殘留超標(biāo)的食品后，當(dāng)體內(nèi)蓄積的藥物濃度達到一定量時人體會產(chǎn)生多種急慢性中毒現(xiàn)象。目前，國內(nèi)外已有多起有關(guān)人食用鹽酸克侖特羅超標(biāo)的豬肺臟而發(fā)生急性中毒事件的報道。四環(huán)素類藥物能夠與骨骼中的鈣結(jié)合，抑制骨骼和牙齒的發(fā)育。磺胺類藥物能夠破壞人體造血機能等。另一方面，動物機體長期反復(fù)接觸某種抗菌藥物后，其體內(nèi)敏感菌株受到選擇性的抑制，從而使耐藥菌株大量繁殖，耐藥性細菌的產(chǎn)生使得一些常用藥物的療效下降甚至失去療效。此外，濫用獸藥對畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境也造成極大危害。動物用藥后，一

9、些性質(zhì)穩(wěn)定的藥物隨糞便、尿被排泄到環(huán)境中后仍能穩(wěn)定存在，從而造成環(huán)境中的藥物殘留。長期濫用藥物嚴重制約著畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。如長期使用抗生素易造成畜禽機體免疫力下降，影響疫苗的接種效果，還可引起畜禽內(nèi)源性感染和二重感染。對動物性食品中的獸藥殘留進行監(jiān)控的一個重要手段就是建立快速準(zhǔn)確的殘留分析方法。目前，報道的文獻及國家標(biāo)準(zhǔn)中大多是單一獸藥或單一種類獸藥的檢測方法，但在實際工作中，由于動物性食品安全的保證需要多個指標(biāo)進行綜合指證，因此，單個樣本常需要多次檢測工作，極大的浪費了人力、物力及財力。多殘留的檢測能夠更好的節(jié)省時間、提高工作效率，并能更加有效地監(jiān)測動物產(chǎn)品的安全性。另一方面，國內(nèi)外報道

10、的動物源性食品中藥物殘留檢測的檢測方法主要有液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫法及生物傳感器技術(shù)。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)是一種將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的方法，其敏感性和特異性較好。ELISA具有樣品前處理簡單，純化步驟少，大量樣本分析時間短，適合于做成試劑盒現(xiàn)場篩選等優(yōu)點，使其可實現(xiàn)快速現(xiàn)場監(jiān)測，是現(xiàn)階段食品安全檢測領(lǐng)域應(yīng)用較多的一項檢測技術(shù)。但它也存在著很多缺陷：對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分；對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)；分析分子量很小的化合物或很不穩(wěn)定的化

11、合物有一定的困難。生物傳感器是由一種生物敏感膜和電化學(xué)轉(zhuǎn)換器兩部分配合，對特定種類的化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。在獸藥殘留分析上得到了較廣泛的應(yīng)用。雖然生物傳感器具有微型化、響應(yīng)速度快、樣品用量少的特點，但還存在著結(jié)果的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和使用壽命方面的問題。現(xiàn)有技術(shù)的方法常有靈敏度不高、前處理繁瑣、檢測藥物單一或重現(xiàn)性不好等問題，很難滿足對藥物殘留的同時確證檢測。液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）的檢測方法以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢互補，將色譜對復(fù)雜

12、樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，在藥物分析領(lǐng)域具有了廣泛的應(yīng)用。液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）分析樣品中定性和定量方面的優(yōu)勢是單獨液相分析不能媲美的。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：提供一種新的獸藥殘留的檢測方法，其是通過液質(zhì)聯(lián)用的檢測方法實現(xiàn)多種類多樣品的檢測。具體來說，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種獸藥殘留的檢測方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：（1）樣品的處理：將待測樣品進行前處理，加入提取劑后進行勻漿，之后進行超聲提取，之后進行第一次離心分離得到上清液，用氮氣將上清液吹干后得到的殘余物用初始流動相溶解，混勻，之后進行

13、第二次離心分離得到上清液，取上清液進行微孔濾膜過濾得到的濾液用于UPLC-MS/MS測定；（2）獸藥殘留的測定將步驟（1）得到的樣品進行超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的測定，測定條件如下：色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動相為甲醇和甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)；源溫為105-115；脫溶劑溫度為340-360；脫溶劑氣流速度為600L·h-1-700L·h-1；錐孔反吹氣流速度為45 L·h-1-55L·h-1。其中，所述獸藥為四環(huán)素類藥物、受體激動劑類藥物、喹諾酮類藥物、磺胺

14、類藥物。其中，所述獸藥為四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素、特步他林、西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、噴布洛爾、苯乙醇胺A、培氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，氧氟沙星，伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、西諾沙星、諾氟沙星、達氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯達嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲異噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一種、幾種或全部。其中，步驟（2）所述梯度洗脫程序為：

15、0-10.0 min：甲醇的體積比為3.0-90.0%；10.0-10.1min：甲醇的體積比為90.0A-3.0；10.1-13.0min：甲醇的體積比為3.0。其中，步驟（1）所述氮氣吹干上清液的溫度為25-35，優(yōu)選在30下進行。其中，步驟（1）所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為9000 r·min-1-11000 r·min-1，離心的時間為8 min -12 min，優(yōu)選所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為10000 r·min-1，離心的時間為10 min。其中，步驟（1）所述提取劑為10%三氯乙酸水溶液與乙腈的混合溶液；優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙

16、酸水溶液：乙腈=（1525）：（7585）；更優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液：乙腈=20：80。其中，步驟（1）所述在第一次離心分離后得到上清液的同時得到沉淀，對沉淀進行再次提取，得到上清液與第一次離心分離得到的上清液進行合并，將合并后的上清液進行下一步驟的氮氣吹干。其中，步驟（2）的甲酸水溶液的體積濃度為0.04-0.07，優(yōu)選體積濃度為0.05。其中，步驟（2）所述色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動相為甲醇和甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)；毛細

17、管電壓為3.5 KV；錐孔電壓為3.0 V；RF透鏡電壓為0.5 V；源溫為110；脫溶劑溫度為350；脫溶劑氣流速度為650L·h-1；錐孔反吹氣流速度為50L·h-1。本發(fā)明的有益技術(shù)效果如下：本發(fā)明的檢測方法具有靈敏度高，專屬性強的特點。本發(fā)明采用的超高液相色譜進行測定，超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography簡稱UPLC）是分離科學(xué)中的一個全新類別，UPLC借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。超高液相色譜在測定上相對于普通液相

18、色譜存在很多優(yōu)點。與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它縮短了分析時間，同時減少了溶劑用量降低了分析成本。UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合了液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜提供結(jié)構(gòu)信息的功能，具有靈敏度高、選擇性強的優(yōu)勢，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) (MS/MS或MSn) 的應(yīng)用，可以獲得豐富、有效的化合物結(jié)構(gòu)信息，建立快速、高效的分析研究體系。本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，針對4種四環(huán)素類藥物、18種磺胺類藥物、14種喹諾酮類藥物及10種受體激動劑藥物建立了一種快速簡便、專屬性強、靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法，以

19、保障對動物源性食品中該類藥物殘留的檢測。此外，本發(fā)明為了提高分析的靈敏度和專一性，進行多時間段的多反應(yīng)檢測掃描（MRM）（multi-period MRM，mpMRM），即按照待測藥物的保留時間，分為多個時間段分別進行MRM掃描，并同時進行定性和定量的雙離子通道分析，進而進一步提高該方法的準(zhǔn)確性和專屬性。本發(fā)明建立了穩(wěn)定高效的測定方法，當(dāng)待測樣品通過本發(fā)明測定方法進行測定時，通過與所述的定性離子色譜圖及保留時間進行殘留藥物的定性分析，并進一步通過定量離子色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線最終確定殘留藥物的含量。附圖說明圖1：4種四環(huán)素類藥物混合對照物的定量離子通道色譜圖；圖2：10種-受體激動劑類藥物和3種氘代

20、內(nèi)標(biāo)混合對照物的定量離子通道色譜圖；圖3：14種喹諾酮類藥物混合對照物的定量離子通道色譜圖；圖4 18種磺胺類藥物混合對照物的定量離子通道色譜圖；上述各圖是UPLC-MS/MS測定結(jié)果的原始圖譜，由于軟件系統(tǒng)是英文的，故輸出的原始圖是英文的，其中1207代表樣品的名稱，圖中的英文翻譯如下：Channels ：質(zhì)譜檢測離子的通道Tetracycline：四環(huán)素、Oxytetracycline：土霉素、Chlorotetracycline：金霉素、Doxycycline：強力霉素；Terbutaline；特步他林、Cimaterol：西馬特羅、Salbutamol：沙丁胺醇、Salbutamol-

21、D6：氘代沙丁胺醇、Fenoterol：菲諾特羅、 Ractopamine：萊克多巴胺、Ractopamine-D6：氘代萊克多巴胺、Clorprenaline：氯丙那林、Clenbuterol：克倫特羅、Clenbuterol-D9：氘代克倫特羅、Tulobuterol：妥布特羅、Penbutolol：噴布洛爾、Phenyl EA A：苯乙醇胺A；Pefloxacin：培氟沙星，Ciprofloxacin：環(huán)丙沙星，Enrofloxacin：恩諾沙星，Ofloxacin：氧氟沙星，Enoxacin：伊諾沙星、Pipemidic Acid吡哌酸、Nalidixic Acid：萘啶酸、Cinox

22、acin：西諾沙星、Norfloxacin：諾氟沙星、Danofloxacin：達氟沙星、Lomefloxacin：洛美沙星、Difloxacin：二氟沙星、Sarafloxacin：沙氟沙星、Sparfloxacin：司帕沙星;Sulfadoxine：磺胺鄰二甲氧嘧啶、Sulfadiazine：磺胺嘧啶、Sulfathiazole：磺胺噻唑、Sulfapyridine：磺胺吡啶、Sulfamerazine：磺胺甲基嘧啶、Sulfamoxol：磺胺二甲基噁唑、Sulfameter：磺胺對甲氧嘧啶、Sulfamethazine：磺胺二甲嘧啶、Sulfamethizole：磺胺甲噻二唑、Sulfa

23、methoxypyridazine：磺胺甲氧噠嗪、Sulfamethoxazole：磺胺甲噁唑、Sulfachloropyridazine：磺胺氯達嗪、Sulfamonomethoxine：磺胺間甲氧嘧啶、Sulfacetamide：磺胺醋酰、Sulfisoxazole：磺胺二甲異噁唑、Sulfaphenazole：磺胺苯吡唑、Sulfadimethoxine：磺胺二甲氧嘧啶、Sulfaquinoxaline：磺胺喹噁啉。具體實施方式本發(fā)明提供了一種獸藥殘留的檢測方法，所述方法包括如下步驟：（1）樣品的處理：將待測樣品進行粉碎，加入提取劑后進行勻漿，之后進行超聲提取，之后進行第一次離心分離得到

24、上清液，用氮氣將上清液吹干后得到的殘余物用初始流動相溶解，混勻，之后進行第二次離心分離得到上清液，取上清液進行微孔濾膜過濾得到的濾液用于UPLC-MS/MS測定；所述待測樣品是各類動物源的肉、蛋、奶。當(dāng)所述的樣品為肉時，前處理的步驟是通過料理機進行粉碎；當(dāng)待測樣品是蛋時，去殼打碎；當(dāng)待測樣品是奶時，只需要簡單過濾除雜就可以。所述的兩次離心分離目的是使樣品中蛋白質(zhì)盡量全部除去，防止堵塞液相色譜柱，同時減少殘留物質(zhì)對測定結(jié)果的干擾。所述的提取劑為10%三氯乙酸水溶液與乙腈的混合溶液，兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液：乙腈=（1525）：（7585），優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液：乙

25、腈=20：80。所述的提取劑的選擇是考慮到蛋白沉淀、藥物溶解性及酸堿性進行選擇的結(jié)果，選擇單獨的有機溶劑不利于小分子藥物的溶解。選擇酸性溶液過多會使樣品中的殘留藥物破環(huán)，而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。優(yōu)選地，所述在第一次離心分離后得到上清液的同時得到沉淀，對沉淀進行再次提取，得到上清液與第一次離心分離得到的上清液進行合并，將合并后的上清液進行下一步驟的氮氣吹干。優(yōu)選地，所述的再次提取是將沉淀加入提取劑后進行勻漿，之后進行超聲提取，之后進行離心分離得到上清液，將得到的該上清液與第一次離心分離得到的上清液進行合并，將合并后的上清液進行下一步驟的氮氣吹干。所述微孔濾膜的孔徑大小為0.45 m。優(yōu)選地，氮氣

26、吹干上清液的溫度為25-35，優(yōu)選在30下進行。優(yōu)選地，所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為9000 r·min-1-11000 r·min-1，離心的時間為8 min -12min；優(yōu)選第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為10000 r·min-1，離心的時間為10min。通過所述的提取過程盡量地將藥物提取，并保證動物內(nèi)源性雜質(zhì)的去除最大化，在兩者同時兼顧的前提下，在本發(fā)明檢測方法中提取的次數(shù)以2次為優(yōu)選。（2）獸藥殘留的測定將步驟（1）得到的樣品進行超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的測定；測定條件如下：色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱

27、；流動相為甲醇和0.05甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30；進樣量為10L；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)；毛細管電壓為3.5 KV；錐孔電壓為3.0 V；RF透鏡電壓為0.5 V；源溫為110；脫溶劑溫度為350；脫溶劑氣流速度為650L·h-1；錐孔反吹氣流速度為50L·h-1。優(yōu)選地，所述梯度洗脫程序為：0-10.0 min：甲醇的體積比為3.0-90.0%；10.0-10.1min：甲醇的體積比為90.0-3.0；10.1-13.0 min：甲醇的體積比為3.0。所述梯度洗脫的流動相配比和洗脫程序可以保證各個藥

28、物的良好分離和定量。優(yōu)選地，所述獸藥為四環(huán)素類藥物、受體激動劑類藥物、喹諾酮類藥物、磺胺類藥物。優(yōu)選地，所述獸藥為四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素、特步他林、西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、噴布洛爾、苯乙醇胺A、培氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，氧氟沙星，伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、西諾沙星、諾氟沙星、達氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯達嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲異噁唑、磺胺苯吡唑

29、、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一種或幾種或全部。所述的四種獸藥殘用途較為廣泛，在動物組織中殘留較多，同時檢測上述四類獸藥對于食品的檢測具有重要意義。上述46種藥物涉及的范圍很廣，結(jié)構(gòu)類型豐富，這說明本發(fā)明的方法可以用于多種藥物的檢測。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明獸藥殘留的檢測方法包括如下步驟：（1）樣品前處理動物性肌肉組織首先用料理機充分粉碎，冷凍保存；準(zhǔn)確稱取解凍后的動物源性食品5.0 g，置于50 mL的離心管中，加入10%三氯乙酸：乙腈提取液（V：V=20：80）10.0 mL，充分勻漿后，超聲提取10 min，10 000 r·min-1 離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移

30、到另一50 mL離心管中，殘渣再用提取液10.0 mL重復(fù)提取一次，合并提取液，將提取液于30下氮氣吹干。殘余物用初始流動相2.0 mL溶解，渦旋混勻，以10 000 r·min-1的速率高速離心10 min。取適量上清液，0.45 m 微孔濾膜過濾，供UPLC-MS/MS測定。（2）樣品的檢測：色譜條件與質(zhì)譜條件色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱 (100 mm×2.1 mm，1.7m)；流動相:A相為甲醇，B相為0.05甲酸水溶液，梯度洗脫：0-10.0 min：3.0A-90.0%A；10.0-10.1min：90.0A-3.0A；10.

31、1-13.0 min：3.0A；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30；進樣量為10L。電噴霧離子源(ESI+)；毛細管電壓為3.5 KV；錐孔電壓為3.0 V；RF透鏡電壓為0.5 V；源溫為110 ；脫溶劑溫度為350 ；脫溶劑氣流速為650L·h-1；錐孔反吹氣流速為50 L·h-1。實施例實施例11 儀器與試藥1.1 儀器Waters Ultra Performance LC液相色譜儀(Waters公司)，Quattro Premier XE 質(zhì)譜儀(Waters公司)，MassLynx v 4.1數(shù)據(jù)處理軟件 (Waters公司)；Waters A

32、cquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7m)；TranssonicTP 690超聲波清洗器（Elma 公司）;3K15離心機（Sigma 公司）；Millipore Elix Milli-Q純水儀。1.2 材料色譜純甲醇（Fisher Scientific公司產(chǎn)品）；色譜純乙腈（Fisher Scientific公司產(chǎn)品）；超純水；其他試劑均為分析純。所用46種藥物均是商購獲得，各個藥物的純度均高于98.0%。將健康牛肉（經(jīng)過測定不含所述的46種藥物中的任一種）定量加入所述的四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素、特步他林、西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特

33、羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、噴布洛爾、苯乙醇胺A、培氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，氧氟沙星，伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、西諾沙星、諾氟沙星、達氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯達嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲異噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉（以下簡稱46種獸藥），將加入獸藥后牛肉加入首先用料理機充分粉碎，冷凍保存；準(zhǔn)確稱取解凍后的牛肉5.0 g，置于50 mL的離心管中，加入10%三氯乙酸：乙

34、腈提取液（V：V=20：80）10.0 mL，充分勻漿后，超聲提取10 min，10 000 r·min-1離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到另一50 mL離心管中，殘渣再用提取液10.0 mL重復(fù)提取一次，合并提取液，將提取液于30下氮氣吹干。殘余物用初始流動相2.0 mL溶解，渦旋混勻，以10 000 r·min-1的速率高速離心10 min。取適量上清液，0.45 m 微孔濾膜過濾，供UPLC-MS/MS測定。2方法與結(jié)果2.1 方法2.1.1色譜條件色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動相為甲醇和0.05甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫，A

35、相為甲醇，B相為0.05甲酸水溶液，0-10.0 min：3.0A-90.0%A；10.0-10.1min：90.0A-3.0A；10.1-13.0 min：3.0A；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30；進樣量為10L。2.1.2質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)；毛細管電壓為3.5 KV；錐孔電壓為3.0 V；RF透鏡電壓為0.5 V；源溫為110；脫溶劑溫度為350；脫溶劑氣流速度為650L·h-1；錐孔反吹氣流速度為50L·h-1。2.2質(zhì)譜條件優(yōu)化將所述的46種藥物分別進行MS掃描，確定各個藥物的定性離子和定量離子，并優(yōu)化各個藥物離子對的碰撞電壓

36、。為了提高分析的靈敏度和專一性，選用多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multi-Reaction Monitoring，MRM) 進行檢測，并同時進行定性和定量的雙離子通道分析，進而進一步提高該方法的定性準(zhǔn)確性和專屬性。46種藥物保留時間、定性離子對和定量離子對列于表1。為了增強方法的靈敏度，本研究進行多時間段的多反應(yīng)檢測掃描，即按照待測藥物的保留時間，分為多個時間段分別進行MRM掃描，以增加每個藥物的掃描時間，進而提高靈敏度。具體來說，根據(jù)各個藥物的保留時間確定監(jiān)測時間，得到測定結(jié)果見表2。表1 46種藥物的保留時間、定性離子對和定量離子對藥物保留時間定量離子對定性離子對四環(huán)素類四環(huán)素(Tetracycli

37、ne)4.89445.1>410.1445.1>428.1土霉素(Oxytetracycline)5.02461.2>426.0461.2>443.1金霉素(Chlorotetracycline)6.21479.2>443.9479.2>462.3強力霉素 (Doxycycline)7.22445.1>428.1445.1>410.1受體激動劑類藥物特步他林(Terbutaline)2.95226.0>124.9226.0>151.9西馬特羅( Cimaterol)3.13220.0>159.9220.0>202.0沙丁胺

38、醇(Salbutamol)3.20240.1>147.9240.1>222.0菲諾特羅(Fenoterol)3.83304.0>134.9304.0>104.9萊克多巴胺(Ractopamine)4.99302.1>164.0302.1>106.9氯丙那林(Clorprenaline)5.35214.0>153.9214.0>196.0克倫特羅(Clenbuterol)5.46277.0>202.9277.0>259.0妥布特羅(Tulobuterol)6.02228.0>153.9228.0>171.9噴布洛爾( Pen

39、butolol)9.15292.1>201.0292.1>236.1苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A）7.27345.2>327.2345.2>150.0喹諾酮類藥物培氟沙星(Pefloxacin)4.67334.2>316.2334.2>290.2環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)4.96332.1>314.1332.1>288.1恩諾沙星( Enrofloxacin)4.99360.2>316.2360.2>245.1氧氟沙星（Ofloxacin）4.66362.1>318.1362.1>261

40、.1伊諾沙星（Enoxacin）4.71321.0>232.1321.0>303.2吡哌酸（Pipemidic Acid）4.23304.0>217.1304.0>189.0萘啶酸（Nalidixic Acid）7.52233.0>215.0233.0>187.0西諾沙星（Cinoxacin）6.17263.1>245.1263.1>217.1諾氟沙星（Norfloxacin）4.85320.0>302.2320.0>276.2達氟沙星（Danofloxacin）5.03358.2>340.1358.2>238.1洛美沙星

41、（Lomefloxacin）5.15352.1>265.1352.1>308.1二氟沙星（Difloxacin）5.23400.2>382.1400.2>356.1沙氟沙星（Sarafloxacin）5.42386.2>299.1386.2>342.2司帕沙星（Sparfloxacin）5.87393.1>349.2393.1>292.2磺胺類藥物磺胺鄰二甲氧嘧啶（Sulfadoxine）5.30311.1>156.0311.1>108.1磺胺嘧啶（Sulfadiazine）3.33251.1>156.0251.1>108

42、.1磺胺噻唑（Sulfathiazole）3.63256.0>155.9256.0>92.0磺胺吡啶（Sulfapyridine）3.76250.0>155.9250.0>184.0磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine）3.95265.0>155.9265.0>171.9磺胺二甲基噁唑（Sulfamoxol）4.36268.0>155.9268.0>113.0磺胺對甲氧嘧啶（Sulfameter）4.41281.0>156.0281.0>215.1磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine）4.48279.0>186.027

43、9.0>124.0磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole）4.52271.0>155.9271.0>92.0磺胺甲氧噠嗪（Sulfamethoxypyridazine）4.71281.0>155.9281.0>108.0磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole）5.12254.0>155.9254.0>92.0磺胺氯達嗪（Sulfachloropyridazine）4.99285.0>155.9285.0>108.0磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）5.22281.1>155.9281.1>108.0

44、磺胺醋酰（Sulfacetamide）2.96215.1>156.0215.1>108.1磺胺二甲異噁唑（Sulfisoxazole）5.39268.1>156.0268.1>113.1磺胺苯吡唑（Sulfaphenazole）5.97315.1>160.1315.1>156.0磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine）6.32311.0>155.9311.0>108.0磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline）6.54301.0.1>155.9301.0>92.0表2 46個藥物的mpMRM參數(shù)藥物時間（min）mpMR

45、M監(jiān)測離子碰撞電壓（V）四環(huán)素類藥物四環(huán)素（Tetracycline）4.3-5.2 445.1>410.019445.1>428.111土霉素（Oxytetracycline）4.8-5.3 461.2>426.020461.2>443.113金霉素（Chlorotetracycline）5.7-6.9 479.2>443.922479.2>462.317強力霉素（Doxycycline）7.0-10.0 445.1>428.121445.1>410.120受體激動劑類藥物特步他林(Terbutaline)3.0-3.5 226.0>12

46、4.922226.0>151.916西馬特羅(Cimaterol)2.8-3.1 220.0>159.916220.0>202.010氯丙那林(Clorprenaline)5.1-5.7 214.0>153.916214.0>196.011克倫特羅(Clenbuterol)5.3-5.9 277.0>202.916277.0>259.010噴布洛爾(Penbutolol)7.0-10.0 292.1>201.020292.1>236.115萊克多巴胺(Ractopamine)4.8-5.3 302.1>106.928302.1>

47、164.016菲諾特羅(Fenoterol)3.7-4.0 304.0>104.916304.0>134.912妥布特羅(Tulobuterol)5.7-6.9 228.0>153.916228.0>171.912沙丁胺醇(Salbutamol) 3.0-3.5240.1>222.018240.1>147.910苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A）7.0-10.0345.2>150.025345.2>327.215喹諾酮類藥物培氟沙星(Pefloxacin)4.5-4.9334.2>316.220334.2>290.

48、215環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)4.8-5.2332.1>288.123332.1>314.118恩諾沙星( Enrofloxacin)4.8-5.3360.2>316.218360.2>245.125氧氟沙星（Ofloxacin）4.4-4.9362.1>261.120362.1>318.125伊諾沙星（Enoxacin）4.5-4.9321.0>232.120321.0>303.230吡哌酸（Pipemidic Acid）4.1-4.5304.0>217.120304.0>189.030萘啶酸（Nalidixic Ac

49、id）7.0-10.0233.0>215.015233.0>187.025西諾沙星（Cinoxacin）5.7-6.9263.1>245.115263.1>217.120諾氟沙星（Norfloxacin）4.7-5.1320.0>302.220320.0>276.215達氟沙星（Danofloxacin）4.8-5.3358.2>340.120358.2>238.121洛美沙星（Lomefloxacin）4.9-5.5352.1>265.123352.1>308.115二氟沙星（Difloxacin）5.0-5.6400.2>3

50、82.125400.2>356.120沙氟沙星（Sarafloxacin）5.1-5.7386.2>299.127386.2>342.219司帕沙星（Sparfloxacin）5.7-6.9393.1>292.225393.1>349.220磺胺類藥物磺胺鄰二甲氧嘧啶（Sulfadoxine）5.0-5.6311.1>156.020311.1>108.122磺胺嘧啶（Sulfadiazine）3.2-3.7251.1>156.016251.1>108.125磺胺噻唑（Sulfathiazole）3.5-4.0256.0>155.915

51、256.0>92.025磺胺吡啶（Sulfapyridine）3.6-4.0250.0>155.916250.0>184.016磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine）3.8-4.2265.0>155.916265.0>171.915磺胺二甲基噁唑（Sulfamoxol）4.2-4.6268.0>155.916268.0>113.017磺胺對甲氧嘧啶（Sulfameter）4.3-4.6281.0>156.015281.0>215.117磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine）4.3-4.7279.0>186.016279.0&

52、gt;124.022磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole）4.4-4.7271.0>155.916271.0>92.025磺胺甲氧噠嗪（Sulfamethoxypyridazine）4.6-4.9281.0>155.916281.0>108.025磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole）4.8-5.3254.0>155.916254.0>92.025磺胺氯達嗪（Sulfachloropyridazine）4.8-5.3285.0>155.925285.0>108.015磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）4.9-5.

53、5281.1>155.916281.1>108.025磺胺醋酰（Sulfacetamide）2.5-5.3215.1>156.021215.1>108.116磺胺二甲異噁唑（Sulfisoxazole）5.2-5.6268.1>156.013268.1>113.117磺胺苯吡唑（Sulfaphenazole）5.7-6.9301.0>155.916301.0>92.025磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine）5.7-6.9311.0>155.917311.0>108.025磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline）5.

54、7-6.9315.1>160.120315.1>156.018mpMRM數(shù)據(jù)采集模式在一個循環(huán)中檢測多個藥物，節(jié)約分析時間，尤其是mpMRM靈敏度高，能夠檢測含量較低的待測組分。現(xiàn)有技術(shù)中，對四環(huán)素類藥物檢測的定量限為500.0ppb，或200.0 ppb，而在mpMRM掃描中上述4個藥物的檢測限均能達到5.0ppb，表明該數(shù)據(jù)采集模式能夠顯著提高靈敏度。2.3方法驗證2.3.2專屬性實驗將1.2制備的用于檢測的樣品進行測定得到色譜圖見圖1-4。通過圖可以看出，46種藥物能和其他色譜峰完全分離，空白組織沒有干擾，達到了多藥物的同時檢測。2.3.3線性關(guān)系和檢測限準(zhǔn)確量取適量的46個

55、藥物的標(biāo)準(zhǔn)液，分別添加到5.0 g健康牛肉中，制得含量為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 , 200.0 ng·mL-1的系列空白添加試樣，按1.2的前處理方法項下所述方法進行處理，然后進行UPLC-MS/MS測定。對于四環(huán)素類藥物、磺胺類及喹諾酮類藥物，以各藥物定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，樣品濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定檢出限（S/N>3）和定量限（S/N>10），對于-受體激動劑類藥物，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計算，結(jié)果見表3。表 3 46種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測限藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線rLOD(ng/

56、mL)LOQ(ng/mL)四環(huán)素（Tetracycline）Y=102.17X+13.010.9992.05.0土霉素（Oxytetracycline）Y=29.99X+43.690.9902.05.0強力霉素（Doxycycline）Y=147.43X+5.220.9902.05.0金霉素（Chlorotetracycline）Y=25.57X+6.750.9952.05.0特步他林(Terbutaline)Y=0.676X-0.150.9960.51.0西馬特羅( cimaterol)Y=0.494X-0.240.9930.51.0沙丁胺醇(Salbutamol)Y=1.524X+0.0760.9980.51.0菲諾特羅(Fenoterol)Y=0.005X+0.0020.9920.51.0萊克多巴胺(Ractopamine)Y=1.104X+0.1550.9990.51.0氯丙那林(Clorprenaline)Y=1.765X-0.4300.9980.51.0克倫特羅(Clenbuterol)Y=0.61X-0.0580.9980.51.0妥布特羅(Tulobute