生化大實驗實驗報告2

1、生 化 大 實 驗實 驗 報 告姓 名： 王國賓學 號：82101132325 班 級：碩士九班實驗班級：一班 專 業(yè)：農(nóng)藥專業(yè) 實驗一：多酚氧化酶(PPO)的分離提取一、實驗目的通過本項實驗，學習和了解蛋白質(zhì)的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關(guān)的儀器設(shè)備的正確使用的方法，以及蛋白質(zhì)的提取分離的系統(tǒng)技術(shù)。二、實驗原理：1.蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中的的溶解度不同，通過向溶液中加入適量的固體硫酸銨來調(diào)節(jié)粗提液的鹽濃度從而將PPO蛋白從體系中析出。2.大分子蛋白質(zhì)不能通過透析膜。三、材料與試劑1.材料：馬鈴薯(約每小組100-200g)2.試劑：0.03M磷酸緩沖液pH6.0(內(nèi)含0.02M巰基

2、乙醇，0.001MEDTA，5甘油，1的聚乙烯吡咯烷酮)配制時配×10倍的濃縮液1000ml；固體硫酸銨；0.03M磷酸緩沖液pH6.0(內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCl2)配置時配。3.實驗器械與儀器設(shè)備：試管與試管架；燒杯、玻璃攪棒；移液管、滴管等；試劑瓶；透析袋；過濾紗布；植物組織勻漿器；pH計和pH試紙；GL20C高速冷凍離心機；DL一7A大容量低速冷凍離心機。四、操作步驟1.粗酶提取：馬鈴薯組織按1：1(WV)比例與0.03M磷酸緩沖液pH6.0(內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5甘油，1聚乙烯吡咯烷酮)混合，勻漿后4層紗布過濾

3、，濾液以6000rpm離心10min，棄除沉淀獲得酶提取液。2.鹽析分級沉淀：在酶提取液中加入固體硫酸銨36.45g使其達到40%飽和度,邊加邊攪拌使硫酸銨充分溶解，然后6000rpm離心20min棄除沉淀，離心上清液再加入固體硫酸銨30.75g達到70%飽和度，邊加邊攪拌使硫酸銨充分溶解，然后6000rpm離心20min，棄除上清液，收集粗酶沉淀，沉淀用0.03M磷酸緩沖液（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2,其液體pH6.0）溶解，裝入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至無硫酸根離子，獲得粗酶液供上柱使用。五、實驗結(jié)果和分析1.初提的酶液為米黃色，經(jīng)

4、過夜透析后，得到了澄清的略帶黃色的液體，可以用來進一步的柱層析。實驗二：胰蛋白酶原的提取與分離一、實驗目的 本實驗擬通過從豬胰臟中制備胰酶結(jié)晶實驗，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結(jié)晶的操作技術(shù)。同時為親和層析、免疫學實驗準備樣品。二、實驗原理胰酶是醫(yī)藥、食品、飼料等工業(yè)上重要的酶抑制劑，胰酶的分離提取是普通生化實驗的最主要、最經(jīng)典的實驗。提取制備胰酶的經(jīng)典方法，多采用硫酸銨分級沉淀，胰酶在75%飽和度硫酸銨中沉淀，其他雜蛋白一般在10%硫酸銨飽和度下被沉淀而除去。經(jīng)此多次提取，最后在pH8.0硼酸緩沖液中得到結(jié)晶。胰酶在pH3.0時最穩(wěn)定，可在低溫下儲存較長時間而不失活。低于此pH，酶易

5、變性；高于pH5.0時，酶易自容而失活。因此提取制備胰酶的全部操作過程宜在低pH和低溫下進行。胰酶以無活性的酶原形式存在于動物的胰臟中。胰蛋白酶原在正常生理條件下可被腸激酶和鈣離子所激活或自我活化成為有活性的酶。三、實驗材料與試劑1.材料：新鮮豬胰臟2.試劑：pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M NaOH溶液、0.1M HCl溶液、0.025M HCl溶液、0.01M HCl溶液、0.4MpH9.0硼酸緩沖液（母液為0.8M，用時稀釋一倍）、Tris、硫酸銨。四、操作步驟1.胰蛋白酶原的提取與分離（1）稱取1-1.5Kg新鮮豬胰臟，在冰浴下剝除脂肪和結(jié)締組織，在低溫下用絞肉機絞

6、碎胰臟后，加入2倍體積已預冷的乙酸酸化水提取。在提取過程中，是提取液維持在pH2.5-3.0之間。在冷室5左右攪拌提取18-24h，而后用4層紗布過濾，盡量擰擠出濾液。用50ml乙酸酸化水再提取殘渣一次，時間約為1-2h，合并濾液，將濾液pH值調(diào)至2.5-3.0，放置3-5h后，收集濾液，量其總體積。（2）鹽析：加固體粉狀硫酸銨進行鹽析，使溶液至75%飽和度。鹽析溶液放冷室中過夜，次日4000rpm離心，或用布式漏斗抽濾，濾餅經(jīng)壓干后稱重，得到胰蛋白酶原粗制品。2.胰蛋白酶原的激活將胰蛋白酶原組分用10倍體積的冷蒸餾水，分多次加入使濾餅溶解，量其體積。取出1ml溶液用于測定溶液中硫酸銨的含量。

7、因為硫酸銨可與活化劑鈣離子結(jié)合，生成硫酸鈣，如果鈣離子過少會直接影響胰酶原的激活過程。因此按上述濾餅中含有的硫酸銨與鈣結(jié)合生成CaSO4之后，尚保存0.1McaCl2慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻。用5M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。3.純化去除雜蛋白，量取胰蛋白酶溶液體積后，用5M硫酸溶液調(diào)節(jié)濾液pH至2.5-3.0，抽濾除去硫酸鈣沉淀，得濾液。加入已研細的硫酸銨粉末，使其溶液達40%飽和度。放置5冰箱中5-8h，抽濾除去沉淀，保留濾液。再向該濾液中加入固體硫酸銨粉末使其溶液達75%飽和度，放5冰箱過夜，次日抽濾收集沉淀壓干后稱重。五、實驗結(jié)果與討論1. 得到澄清的酶液。2. 用新鮮的

8、豬胰臟是因為新鮮的胰臟胰酶含量高，容易分離提取。3. 提取過程中保持pH值2.5-3.0之間，是因為胰酶在低pH值下沒有活性，不會催化其他蛋白的水解從而降低酶的含量。實驗三：卵清蛋白分離提取一、實驗目的 掌握雞卵清蛋白的提取方法和操作步驟。二、實驗原理雞卵粘蛋白存在于雞蛋清中，對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，高純度的雞卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比為1:1。雞卵粘蛋白是糖蛋白，分子量為28000，但糖成份上有差別。有四種不同組份，等電點的范圍為pH 3.94.5,280 nm的消光系數(shù)為：A4.13（1,1 cm）。雞卵粘蛋白在中性或酸性溶液中對熱和高濃度的脲都是相當穩(wěn)定的，而在堿性溶液中比較不穩(wěn)定

9、。由于雞卵粘蛋白對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，因此可以用雞卵粘蛋白作親和配基制備純化胰酶的親和柱材。三、實驗材料與試劑1.材料：新鮮雞蛋2只2.試劑：10 TCA（用固體NaOH調(diào)pH至1.051.10，需要50 ml）；5 N HCL；5 N NaOH；冷丙酮；胰蛋白酶液；BAEE0.05 M；pH 8.0 TrisHCL緩沖液（每ml含0.34BAEE和2.22 mg CaCl2，50 ml。）；pH 8.0，0.1 M TrisHCL緩沖液。四、操作步驟1.取兩只新鮮雞蛋，得蛋清50 ml，置于燒杯中，外用溫水浴2530，在不斷攪拌條件下，緩慢加入等體積的三氯乙酸丙酮（1:2V/V），立即

10、出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，加完后最終pH約3.5，再繼續(xù)攪拌30 min，然后在4放置過夜。2.次日用布氏漏斗抽濾，得黃綠色清液。3.邊攪拌邊加入4預冷的丙酮200 ml沉淀蛋白，在4放置2 h之后將上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于10000 rpm離心5 min，收集沉淀。4.將沉淀溶于10 ml無離子水中，對無離子水（50倍）透析4 h，換水兩次，再對碳酸鈉緩沖溶液透析過夜，4000 rpm離心10 min，去除不溶物，取少量上清液，用水稀釋適當倍數(shù)，測A280計算所得蛋白總量。五、實驗結(jié)果與分析1. 上清液中得到含有分離提取的卵蛋白，所得卵清蛋白用于胰酶的柱層析。2.在實驗中要控制pH

11、值，不能使其成堿性，否則粘蛋白會分解，影響粘蛋白的量。3.在離心以后一定要弄清楚是收集沉淀還是上清液，否則實驗將會失敗。實驗四：凝膠色譜層析純化PPO一、實驗目的 通過凝膠色譜層析分離純化PPO的操作，以期掌握凝膠色譜層析的基本原理、運用及操作技術(shù)，并了解凝膠色譜測定蛋白質(zhì)分子量的基本原理和操作方法。二、實驗原理柱層析技術(shù)是常用的純化酶、蛋白質(zhì)的手段。在普通生化操作中經(jīng)常通過離子交換層析和凝膠層析聯(lián)用實現(xiàn)蛋白質(zhì)的純化。選擇適當?shù)南疵摋l件便可將混合物中的組分逐個洗脫下米，達到分離純化的目的。凝膠色譜技術(shù)使入十年代初發(fā)展起來的一種快速、簡單的分離技術(shù)，設(shè)備簡單、操作方便，對蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)有很高

12、的分離效果。 其分離純化蛋向質(zhì)的原理使分子篩效應：即凝膠色譜柱的重要參數(shù)，由于凝膠色譜分離蛋白質(zhì)是根據(jù)分子量大小進行的，蛋白質(zhì)的洗脫體積與分子量對數(shù)大小負相關(guān)，因此利用標準分子量及其洗脫體積可作分子量洗脫體積的標準曲線，根據(jù)曲線和未知蛋白的洗脫體積可以求得待分離蛋白的分子量人小。三、材料與試劑1.試劑：0.02M TrisHCL緩沖液Ph7.4(內(nèi)含0.00lM EDTA)配制時配×10倍濃縮1000m1；NaCl；聚已二醇；DEAE纖維素DE52；葡聚糖凝膠Sephadex G200：蘭葡萄糖一40、70、100等；2.實驗器械與儀器設(shè)備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管

13、等；試劑瓶、層析柱、pH計和pH試紙、恒流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監(jiān)測儀、GL-20C高速冷凍離心機、DL-7A大容量低速冷凍離心機四、操作步驟1.葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡（1）柱材處理稱取一定量的Sephadex G200干粉，加無離子水或蒸餾水浸泡溶脹48 h，去掉懸浮的細微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進抽濾瓶中，進行抽真空處理，直到凝膠液中沒有氣泡出現(xiàn)為止。（2）裝柱將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過高會產(chǎn)生氣泡

14、，影響蛋白質(zhì)分離速度，濃度過低易產(chǎn)生凝膠分層，影響蛋白質(zhì)的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.52 cm處，停止裝柱。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白檢測議，待層析柱的平衡。（3）平衡 在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程中的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.51 ml/ min，當下出口流出液的pH值與平衡緩沖液的pH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中用0

15、.02M Tris-HCl緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）預先將DE52柱進行平衡。2.上樣將粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）洗脫雜蛋白。3.洗脫用0.02M Tris-HCl緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）洗脫，收集洗脫液進行酶活性、蛋白質(zhì)濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質(zhì)分析測定。實驗五：離子交換層析進一步純化PPO一、原理離子交換劑是一種不溶性高分子化合物，分子中含有可解離的基團，在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用。當一定量的溶液通過交換柱是時，溶液中的離子不斷被交換而濃度逐漸減少，

16、全部被交換并吸附在樹脂上。交換反應都是平衡反應，在連續(xù)添加新的交換溶液下，平衡不斷按正方向進行，直至完全把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來。兩種以上的成分被交換吸附在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時，被洗脫的能力則決定于各自洗脫反應的平衡常數(shù)。蛋白質(zhì)的洗脫過程分兩個階段吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)通過改變PH使吸附的蛋白質(zhì)火去電荷而達到解離。通過增加離子強度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭離子交換劑上的電荷位置，使吸附的蛋白質(zhì)與離子交換劑解開。不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成電鍵數(shù)日不同，親和力大小有差異。二、實驗試劑0.02M Tris-HCl緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）

17、配制時配×10倍濃縮液1000ml；NaCl；聚乙二醇；DEAE纖維素 DE52。三、操作步驟1. DEAE纖維素的處理及裝柱（1）處理 AE纖維素 DE 52弱堿型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE 52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質(zhì)；再在0.5N的Hcl溶液中浸泡12h，用無離子水或蒸餾水洗至pH值中性或pH4以上，并將其在抽濾斗中抽干；將抽干的離子交換劑浸泡在0.5N的HCl溶液中浸泡12h，再用無離子水或蒸餾水洗至中性。（2）裝柱 將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱

18、中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.52 cm處，停止裝柱。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白檢測議，待層析柱的平衡。（3）平衡 在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程中的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中的系統(tǒng)一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.51 ml/ min，當下出口流出液的pH值與平衡緩沖液的pH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中用0.02M Tris-HCl緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）預先將DE

19、52柱進行平衡。2.上樣：將粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）洗脫雜蛋白。3.洗脫：用含有0.2-0.6MnaCl的0.02M Tris-HCl緩沖液pH7.4（內(nèi)含0.001M EDTA）進行梯度洗脫。4.收集PPO活性部分洗脫液，測定酶活性和蛋白濃度。實驗六：PPO酶含量和活性的測定一、蛋白質(zhì)含量測定一考馬斯亮藍G250法測定蛋白質(zhì)濃度（一）實驗原理與目的考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)濃度的基本原理是：考馬斯亮藍G-250本身為紅色，當與蛋白質(zhì)結(jié)合時，紅色就轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，使染料的最大吸收峰從465nm轉(zhuǎn)移到590nm，染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合

20、與595nm的吸收值在一定蛋白質(zhì)濃度下呈線形相關(guān)，其蛋白結(jié)合反應在23min內(nèi)完成，而反應生成的復合物在1h內(nèi)比較穩(wěn)定地存在于溶液中，因此,用標準濃度地蛋白測得OD595值繪制標準曲線，即可求得待測樣品中蛋白質(zhì)濃度。此方法試劑簡單、經(jīng)濟。測定簡便快捷，具有與Lawry法相當?shù)撵`敏度，受溶液中其它物質(zhì)的干擾很小，并且可采用對照來消除。（二）儀器與試劑1.材料：經(jīng)硫酸銨沉淀獲得PPO粗酶液，DEAE一纖維素DE52分離的酶液和Sephadex G一200分離純化的酶液樣品。 2.儀器與器皿：分光光度計，分析天平，容量瓶，移液管和試管等。3.試劑：考馬斯亮藍G一250蛋白試劑：稱取100mg考馬斯亮

21、藍G一250溶于50ml 90的乙醇中，加入85(VV)磷酸100ml，最后加入無離子水或蒸餾水定容到1000ml。 （三）作步驟樣品中蛋白質(zhì)濃度的測定：考馬斯亮藍G250 l00l，樣品20l，對照用TrisHCl 20l。再用制作標準曲線的方法對樣品進行測定，測定的0D595值結(jié)果由標準曲線求出樣品的蛋白質(zhì)濃度。二、 PPO活性測定（一）原理與方法 PPO催化各種酚與O2氧化為醌。本實驗是采用鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉-0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8的反應體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計410nm處使反應體系的OD值產(chǎn)生變化，通過OD值上升的讀數(shù)變化確定PPO

22、的酶活大小。其方法是：在含有4mlPH5.8的O.2M磷酸氫二鈉0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05m10.05M鄰苯二酚溶液，在30恒溫水浴中預熱后加入0.05ml酶液，反應5分鐘，在分光光度計410nm處讀取吸光值。在上述條件下，以A410讀數(shù)，以每分鐘增加0.01OD值定義為一個酶活性單位(U)。（二）儀器與試劑(1)樣品：凝膠色譜DE52層析純化洗脫組分；葡聚糖凝膠洗脫組分(2)底物：鄰苯二酚；0.01M鄰苯二酚溶液(3)反應體系：O.2M鄰酸二氫鈉0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8(4)器皿與儀器：試管、恒溫水浴等，分光光度計（三）實驗步驟樣品中蛋白質(zhì)活性的測定：檸檬酸緩沖液（buff

23、er）20l，底物鄰苯二酚20ul樣品20l，對照用TrisHCl 20l。在分光光度計410nm下測定酶活。（四）實驗結(jié)果：凝膠色譜層析純化后PPO酶蛋白質(zhì)含量和活性的測定樣品活性活性CK（1）0.000.00粗酶（2）0.5050.08130.5310.07540.3611.74050.2960.52760.2280.16370.1780.07080.1560.14090.140.077100.0400.079110.0690.047實驗七：親和層析純化胰酶一、試驗目的與原理目的：通過將胰蛋白酶和抑制劑-雞卵粘蛋白與sephadex-G75偶聯(lián)及親和層析純化胰酶的操作，來了解親和層析的基本

24、原理，掌握親和柱層析和柱材活化偶聯(lián)及親和層析操作的基本過程和技術(shù)。原理：利用生物分子和相對應分子之間親和結(jié)合和解離性質(zhì)而建立起來的層析方法稱之為親和層析。本實驗通過將胰蛋白酶抑制劑雞卵粘蛋白與Sephadex-G75偶聯(lián)及親和層析純化胰酶的操作，以了解親和層析的基本原理，掌握親和柱材活化偶聯(lián)及親和層析操作的基本過程和技術(shù)。二、儀器與試劑1.材料：粗胰蛋白酶、雞卵粘蛋白、SepharoseG752.試劑：0.05M NaIO4溶液、5% K2CO3、0.27gKBH4、0.1M Tris-HCl pH7.5(含0.5M KCl，0.05M CaCl2)、0.1N 甲酸鉀-0.5M KCl pH2

25、.5三、實驗步驟1. SepharoseG75的活化及偶聯(lián)將2.5g干重的葡聚糖凝膠SepharoseG75溶脹洗滌數(shù)次、緩慢攪拌，加入0.05M NaIO4溶液50ml，靜置30min后，蒸餾水洗滌數(shù)次，抽干備用。接著，將純化的雞卵粘蛋白溶于水中，加入已經(jīng)活化好的葡聚糖凝膠。用5% K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH至7.5-9.0，緩慢攪拌3h。在此過程中一定要保持pH的穩(wěn)定。將0.27gKBH4溶于20ml水中，緩慢攪拌加入上述體系反應5h，pH維持在6.5-7.5之間，洗滌數(shù)次備用。2.親和層析將雞卵粘蛋白SepharoseG75 裝柱（1×10 cm）,用pH7.5, 0.1 M含0.

26、5 M KCl，0.05 M CaCl2的緩沖液平衡，平衡約23倍的柱體積。將粗胰酶液上樣柱層析。用紫外蛋白監(jiān)測儀280 nm處監(jiān)測蛋白吸收峰，隨著上柱和流出的雜蛋白量的平衡，吸收峰達到穩(wěn)定，一旦上柱的胰蛋白酶量超過柱的負荷時，則胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此時應停止樣品上樣，改用pH 7.5的平衡緩沖液洗出雜蛋白，待洗出液的吸收回到基線后，改用0.1 N的甲酸鉀0.5 M KCl，pH 2.5的洗脫液解吸，柱的流速維持在1.5 ml /min左右，收集洗脫下來的蛋白峰蛋白，則總蛋白量及比活性，并根據(jù)上柱樣品的總蛋白量和比活性計算經(jīng)親和層析后胰蛋白酶比活性提高的倍數(shù)，總蛋白回收率，胰蛋白酶量。

27、當胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基線后，重新用緩沖液平衡，親和層析柱可以反復使用。四、實驗結(jié)果與分析本實驗中序號2-9為收集液，經(jīng)測定吸光值第6瓶最高用于后續(xù)的電泳。樣品空白透析液混合液23456789蛋白00.5470.3430.0140.0250.0180.0210.0240.0170.0340.031酶活00.640.430.120.080.070.060.100.060.120.10五、注意事項1.在上樣品時可以多上一些，若柱子裝不下，可以將下端出液口打開，放出部分液體，待到檢測儀的讀數(shù)有大的變化時收集洗液。2.層析柱一定要平衡好后才能使用，否則實驗結(jié)果會很不準確。3.檢測儀使用前一定

28、要調(diào)零，還要使用正確的檔位。實驗八：SDSPAGE測定蛋白質(zhì)分子量及蛋白質(zhì)的純度鑒定一、實驗目的與原理目的：本實驗的是對多酚氧化酶的純化度鑒定及分子量的測定，通過實驗，學習和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)純度和分子量的鑒定。原理：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移取決丁它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素。每克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g的SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而消除了蛋向質(zhì)原有的電荷差別，使蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量，而與蛋向質(zhì)所帶的電荷無關(guān)，在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量的對數(shù)與電泳遷移率間是負相關(guān)。二、儀器與試劑1.材

29、料：硫酸銨鹽析沉淀的多酚氧化酶粗酶樣品、DEAE-纖維素DE52柱層忻的品和SephadexG-100柱層析的樣品。2.試劑：(1)丙烯酰胺(Acr母液)：30Acr (AcrBis)；(2)10的SDS溶液；(3)10的過硫酸銨溶液；(4)四甲基乙二胺(TEMED)；(5)分離膠緩沖液：1.5M Tris，PH8.8；(6)濃縮膠緩沖液：1.0M Tris，PH6.8；(7)電極緩沖液：10×30g Tris，125g甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3；(8)樣品緩沖液：0.2M Tris，PH6.8，lSDS，30甘油，巰基乙醇及溴酚蘭；(9)染色液：0

30、.15考馬斯亮藍R250，溶于脫色液；(10)脫色液：50的甲醇，7的冰醋酸的水溶液；(11)標準分子量蛋白。3.儀器設(shè)備：電泳儀，垂直電泳槽等。三、實驗步驟1.凝膠制備：用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽（注意不能漏膠），垂直放置。將下表列出的的配方，配成分離膠溶液，立即倒入垂直槽，并慢慢加入無離子水，將凝膠液面壓平，20 min后凝聚。倒出無離子水，用吸水紙吸干，倒人按表配成的濃縮膠，再插入梳子。SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制（10）分離膠試劑體積（ml）Acr儲液10分離膠緩沖液1010%SDS10%APS0.60.1TEMED0.02補水至30濃縮膠（3.5%）試 劑體 積（ml）Acr 儲液2

31、.2緩沖液3.010%SDS10%APS0.30.1TEMED0.02補水至202.點樣： 分別取樣品若干毫升于離心管中，按1：11：5的比例加入5×樣品緩沖液，在沸水浴中加熱35 min，取出待用。用微量注射器分別吸取不超過30l不同濃度的標準蛋白樣品和實驗樣品注入樣品槽。點樣結(jié)束后，調(diào)節(jié)電泳儀電流升到10 mA，當溴酚藍進入分離膠將電源加到1520 mA（23 mA/em）,保持電流穩(wěn)定不變，當溴酚藍遷移到離分離膠底12 cm時，即可停止電泳。3.染色：電泳完畢后，取出凝膠板，浸入染色液中，在37溫箱中保溫過夜。倒掉染色液，用脫色液，用脫色液脫掉剩余染料后，倒入脫色液第二天換一次

32、脫色液，24 h后，即可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶。四、實驗結(jié)果及注意事項1、實驗結(jié)果：2、影響蛋白質(zhì)電泳分離效果的因素：（1）蛋白質(zhì)樣品中的鹽濃度 影響蛋白條帶的遷移率和帶型，因此為消除鹽濃度的影響，溶解蛋白時最好用去離子水，再加等量2×SDS-PAGE樣品緩沖液，必要時經(jīng)過透析或進行Sephader G25過柱。（2）SDS的質(zhì)量 由于變性蛋白是與SDS結(jié)合而帶負電荷，蛋白結(jié)合SDS的量與蛋白質(zhì)的分子量成正比，因此質(zhì)量不同的SDS，相同的蛋白質(zhì)樣品，將可能出現(xiàn)不同遷移率的電泳圖譜。（3）上樣孔是否平齊，若上樣孔不平齊，也影響蛋白電泳的遷移率。（4）為防止相鄰泳道樣品的擴散，而導致電泳條

33、帶的不整齊，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩沖液。實驗九：Western-blotting一、實驗原理Western印跡法檢測蛋白敏感度達1-5ng，0.75mm厚的SDS-PAGE板一個孔能檢測出來的蛋白量為100g，只要不低于總蛋白量萬分之一，就能被檢測。分析樣品未知時，應同時有陽性對照。雜交技術(shù)主要有NC膜的封閉，靶蛋白與一抗反應，結(jié)合的靶蛋白的一抗與二抗反應，顯色。技術(shù)的主要原理為轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白帶，用其他蛋白為封閉液，封閉其他蛋白的可結(jié)合位點，加入特異性的一抗，免疫反應，一抗與靶蛋白結(jié)合，加入二抗，使之與一抗反應，反應后，洗滌除去多余二抗。二抗為酶標抗

34、體，通過酶標反應，在顯色液中可呈現(xiàn)結(jié)合結(jié)合一抗、二抗的靶蛋白。二、儀器與試劑1.材料：檢測蛋白2.儀器：電轉(zhuǎn)移槽，電泳儀，塑料封口機，搖床3.試劑：點擊緩沖液加20%甲醇，封閉液（1%脫脂奶粉溶于TBST中），TBST（150mM NaCl，50mM Tris-HCl ，pH 7.5）0.01% antiform，0.02% 疊氮鈉，二抗稀釋液，0.5% Tween20，堿性磷酸鹽顯色液三、操作步驟1、剪6塊3mm濾紙，和一塊Nc膜。將剪好的3mm濾紙和Nc膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5分鐘。2、安裝轉(zhuǎn)移裝置，將3塊3mm的濾紙放在海綿上，然后依次將NC膜，凝膠即為蛋白質(zhì)電泳所得的粗胰酶，提純以后的胰

35、酶條帶以及標準酶條帶），另3塊濾紙海綿的順序放好。在支架加緊上述幾層，放入電泳槽中，NC膜的一次向正極，凝膠一側(cè)向負極。3、在40V電壓下電泳6小時。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，切下一個孔所對應的膜的一半用考馬斯亮蘭染色。觀察轉(zhuǎn)移效果。將其余的NC膜放在一張干凈的3mm濾紙上，室溫干燥1小時。將NC膜封閉：將干燥后的Nc膜放于平皿中，加入封閉液，液面要沒住，輕輕搖蕩2小時。將第一抗體用封閉液稀釋，將封閉好的NC膜放入塑料袋中，加入一抗0.1ml，將袋中氣泡排除，封口，4下輕輕振蕩2小時。4、反應結(jié)束，剪開塑料袋，棄去反應液，用PBS洗三次，將膜放入一個塑料袋中，加入稀釋過的二抗溶液0.1ml，封口，在室溫下振

36、蕩1小時。反映結(jié)束，取出，用PBS洗3次。將膜放入顯色液中，室溫下輕輕搖蕩。待條帶出現(xiàn)后，用水沖洗，剛TE終止。四、實驗結(jié)果經(jīng)過一系列的實驗過程，最終NC膜上出現(xiàn)與凝膠上相一致的較為模糊的淺色藍色條帶，實驗基本完成。四、注意事項安裝放置順序為：濾紙、NC膜、膠、濾紙。并且膜要靠近正極，因為蛋白質(zhì)變形后帶負電，從負極轉(zhuǎn)移到正極。實驗十：染色體DNA的提取一、實驗目的與原理DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學研究的主要對象。本實驗通過裂解液裂解細胞，有機溶劑反復抽提，使DNA進入水相與蛋白成分分開，在RNase作用下，降解RNA以純化DNA。通過實驗學習和掌握提取植物染色體

37、DNA的原理和方法。二、材料與試劑1.材料：大腸桿菌2.試劑: 細胞裂解液 100mM Tris-HCl、 5mM EDTA、500mM NaCl、1.25% SDS、pH 7.5； 飽和酚；氯仿/異戊醇；酚/氯仿/異戊醇；70%及無水乙醇；3M NaAC ；50×TAE緩沖液；電泳載樣緩沖液；無菌水三、操作步驟:1.將培養(yǎng)好的菌液1.5ml，離心除去上清液收集菌體，10000rpm,1-3min。2.加入65預熱的細胞裂解液600l懸浮菌體，再加入60l飽和苯酚滾動混勻后，65水浴30 min。3.加入600l氯仿混勻，靜置4-5 min后10000rpm離心15 min，取上清液

38、。4.等體積氯仿再抽提一次，靜置2min后10000rpm離心15 min，取上清液。5.加入2倍體積冷無水乙醇（-20）、0.1體積3M乙酸鈉（pH5.2），置于室溫10 min,12000-15000rpm離心10 min。6.70%乙醇洗滌DNA一次,無水乙醇沉淀DNA，12000-15000rpm離心10min。7.將沉淀的DNA溶于40-100l的無菌水中。8.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量。四、實驗結(jié)果五、注意事項實驗結(jié)果較為理想可能是在DNA提取過程中注意到了以下幾個問題：1.加入裂解液后使菌體與裂解液充分接觸，充分裂解。2.飽和苯酚使得與DNA結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)充分變性，徹底除

39、去蛋白質(zhì)。3.取上清液時應該遵守寧可少得上清，也不要將下層取出的原則。4.提取DNA時動作要輕，不能攪拌，應滾動混勻或是顛倒混實驗十一：質(zhì)粒DNA的提取與純化一、實驗原理與目的 目的：掌握堿變性抽提質(zhì)粒法的一般步驟和操作方法，熟悉質(zhì)粒的純化方法和步驟。原理：細菌質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，其大小范圍從1Kb-200以上Kb不等，它們是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒的存在能賦于菌體一些特殊的表型，這些表型主要有對抗生素的抗性、修飾酶等。由于有些質(zhì)粒與DNA分子量較小特別是與自身遺傳有關(guān)的DNA分子極小，可攜帶外源基因量較大，且轉(zhuǎn)移性強、拷貝數(shù)高(松弛型質(zhì)粒)、還

40、帶有選擇性標記，因此質(zhì)粒是進行分子生物學實驗操作,進行遺傳工程改良物種等工作時的最主要的DNA載體。質(zhì)粒DNA的提取可以說是分子生物學實驗中的最基本、最重要的實驗。質(zhì)粒DNA的提取根據(jù)實驗目的不同，可以有不同的方法，但基本步驟多為三步，第一細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增，第二細菌菌體的裂解，第三質(zhì)粒DNA的純化。二、材料與試劑1.材料：大腸桿菌2.試劑 Solution 50mM 葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 10mM EDTA(pH 8.0), 高壓滅菌，4保存 Solution 0.2M NaOH, 1% SDS, 現(xiàn)配現(xiàn)用 Solution 5N KAC pH 4.8, 高

41、壓滅菌，4保存 3M NaAC pH 5.2 高壓滅菌，4保存, 5：氨芐青霉素 25mg/ml, 溶菌酶 8mg/ml, 氯仿/酚, 異丙醇, LB培養(yǎng)基, 電泳試劑三、操作步驟:1. 2ml/20ml 培養(yǎng)菌體 37 200rpm 過夜，4 5000rpm離心10min沉淀菌體細胞。2. 預冷的TES 緩沖液洗滌沉淀，4 5000rpm離心10min沉淀菌體細胞。3. 加入預冷的1ml Solution ,冰浴,10min。4. 重新懸浮，加入150l溶菌酶母液，室溫放置5min。5. 加入1.2mlSolution ,冰浴中5min后,加入0.9ml預冷乙酸鉀混勻, 4、12000rpm

42、離心10min，取上清。6. 1.5ml異丙醇,-20冰箱內(nèi)放置15min, 4、12000rpm離心10min，取沉淀。7. 懸于400lTE緩沖液中,加入40l,3M NaAC,酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀, 4、12000rpm離心10min，取沉淀。8. 冷凍干燥后再懸浮于50lTE緩沖液中。9. 電泳檢測提取質(zhì)量。五、實驗結(jié)果分析1.該實驗成功的標志是把染色體DNA、蛋白質(zhì)與RNA去除干凈，獲得一定得率的質(zhì)粒DNA。去掉染色體DNA最為重要，也較困難，因為在全部提取過程中，只有一次機會去除染色體DNA，其關(guān)鍵步驟是加入溶液與溶液時，控制變性與復性操作時機，既要使試劑與染色體DNA充分作用

43、使之變性，又要使染色體DNA不斷裂解成小片段，從而能與質(zhì)粒DNA相分離。這就要求試劑與溶菌液充分搖勻，搖動時用力適當，一般來說當溶液加入時可用力振蕩幾次，因為此時細菌還沒有與堿和SDS作用，染色體DNA尚未釋放，不必擔心其分子斷裂，加入SDS后，則要注意不能過分用力振蕩，溫和混勻,但又必須讓它反應充分。加入溶液II混勻之后,一定在冰上放置,不要搖動,對于溶液III,同樣處理。2. 加入溶液I之前,注意將離心管倒扣過來,將培養(yǎng)基完全流出.3加乙醇沉淀DNA時，要把離心管加蓋倒翻搖動45次，注意觀察水相與乙醇之間沒有分層現(xiàn)象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以獲得更多的DNA。4乙醇沉淀DNA離

44、心后，要把離心管四周的上清液抽干或自然揮發(fā)(可將離心管倒置于濾紙上以盡量讓管內(nèi)液體流出)。否則，用TE緩沖液溶解DNA時，既困難又不完全。5為了得到純凈的DNA樣品和清晰的電泳條帶，加入1l RNA酶，將管置50水浴箱內(nèi)30min，消化RNA。6抽提產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、EB染色后，在紫外線燈下可觀察到三個條帶，自前往后分別為：超螺旋、線性及開環(huán)質(zhì)粒DNA。實驗十二：DNA片斷的酶切技術(shù)一、實驗目的與原理限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶,這類酶的發(fā)現(xiàn)和應用促進了以DNA重組為基礎(chǔ)的生物工程技術(shù)的迅猛發(fā)展。該類酶是體外剪切基因片段的重要工具。本部分實驗主要通過Eco

45、R，Hind 兩種限制性內(nèi)切酶對DNA的雙酶切及部分酶切操作，使學員能掌握內(nèi)切酶的實驗操作技術(shù)。二、材料與試劑1.材料：DNA2.試劑 EcoR及緩沖液 Hind 及緩沖液 DNA 0.532g/l TAE緩沖液三、操作步驟EcoR 、Hind 雙酶切取3支干凈、滅菌新Eppendof管，分別按下表加入(體系均為20l)：模板基因組DNA 4l質(zhì)粒DNA 4l-DNA 2l緩沖液2l2l2lEcoR1l1l1lHind 1l1l1lddH2O12l12l14l37保溫1-2小時，保溫結(jié)束后，加入0.5M(pH 7.2)EDTA(使終濃度達到10mM)，加入6l電泳加樣緩沖液，電泳分析。四、實驗

46、結(jié)果五、實驗結(jié)果分析1.建立一個標準的酶切反應 目前大多數(shù)研究者遵循一條規(guī)則，即10個單位的內(nèi)切酶可以切割1g不同來源和純度的DNA。通常，一個50l的反應體系中，1l的酶在1X NEBuffer終濃度及相應溫度條件下反應1小時即可降解1g已純化好的DNA。如果加入更多的酶，則可相應縮短反應時間；如果減少酶的用量，對許多酶來說，相應延長反應時間（不超過16小時）也可完全反應。2.選擇正確的酶 不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個相應的識別位點。識別堿基數(shù)目少的酶比堿基數(shù)目多的酶更頻繁地切割底物。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端產(chǎn)物

47、可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接，而所有的平端產(chǎn)物都可以互相連接。3. 酶 內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應當立即置于冰上。酶應當是最后一個被加入到反應體系中（在加入酶之前所有的其它反應物都應當已經(jīng)加好并已預混合）。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。4.DNA 待切割的DNA應當已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應該是酶切要考慮到的因素。5.緩沖液 對于每一種酶NEB都提供相應的最佳緩沖液，可保證幾乎100%的酶活性。使用時的緩沖液濃度應為1X。有的酶要求100g/ml的BSA以實現(xiàn)最佳活性。在這種情況下，我們也相應提供100X的BSA（10mg/

48、ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響。6.反應體積 內(nèi)切酶活力單位的定義是：1小時內(nèi)，50l反應體積中，降解1g的底物DNA所需的酶為一個活力單位。因此酶：DNA的反應比例可以由此確定。較小的反應體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過總體積的10%（一般酶都貯存于50%的甘油中）。7.混合 這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應完全，必須使反應液充分混合。我們推薦用槍反復吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。8.反應溫度 大部分酶的反應溫度為37°C；從嗜熱菌中分離出來的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。

49、一般為50-65°C不等。9.反應時間 1酶活單位的定義時間為1小時。如果加入的酶較多，可以相應地縮短反應時間；反之，如果加入的酶量較少，也可以延長時間以使反應達到完全。10.對照反應 如果發(fā)現(xiàn)您的DNA底物不能被成功切開，可以進行對照實驗以查明原因。具體方法如下：將不加內(nèi)切酶的底物DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對照DNA（有多個已知酶切位點）同時進行反應。若實驗結(jié)果表明底物DNA降解，則說明DNA在純化過程中或反應液里引入了核酸酶污染；若實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對照DNA被成功切開，則可以排除酶質(zhì)量的原因，此時可以將對照DNA和待切底物DNA混合起來再次進行反應，以確

50、定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在（通常是鹽、EDTA或酚），則混合物里的對照DNA也無法被切開。實驗十三：DNA片斷的連接技術(shù)一、實驗目的與原理 DNA酶切片段的連接是兩DNA片段相鄰的5'磷酸和3'羥基間可由連接酶催化形成磷酸二酯鍵，這個連接反應在體外一般都有大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶催化，但分子生物學實驗中主要采用T4DNA連接酶，因該酶在正常條件下，即能完成連接反應。本實驗擬通過T4DNA連接酶對酶切片段的連接操作，使學員掌握這一DNA片段的連接技術(shù)。二、試劑T4DNA連接酶；10×T4DNA連接酶緩沖液；200mM Tris-HCL (pH

51、7.6)；50mM MgCl2；50mM DTT；500g/ml 牛血清白蛋白；5mM ATP ；DNA；酚/氯仿；酚 ；TE緩沖液；電泳緩沖液；3M NaAC。三、操作步驟取1支干凈、滅菌新Eppendof管，分別按下表加入(體系為10l)：10×連接酶緩沖液1載體1-DNA3連接酶1ddH2O416過夜。提取已聯(lián)接好的DNA片段，電泳分析。四、實驗注意事項1. 10x Ligation Buffer含有ATP，使用前應在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化，然后置于冰上。不要加熱融化以免ATP降解。2.T4 DNA Ligase對熱敏感，容易失活。使用時請放置冰上，用后立即置冰箱中

52、冷凍保存。3.插入片斷和載體片斷的比例要高。4.反應體系10l，不要太大。實驗十四：受體菌感受態(tài)細胞的制備一、實驗目的與原理目的：本實驗擬通過這方面的操作，讓學員了解和學習感受態(tài)細胞的制備過程。原理：當細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)時，即為感受態(tài)，而用理化手段使細菌處于感受態(tài)的操作為致敏過程。感受態(tài)細胞制備是重組基因能否實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一重要的技術(shù)關(guān)節(jié)。二、材料與試劑 1.材料：大腸桿菌 2.試劑 LB培養(yǎng)基、0.1N CaCl2、0.1M MgCl2、3mM 氯化6氨合高鈷；TFB: 10mM MES (pH 6.3)；45mM MnCl2；10mM CaCl2；100mM KCl三、操作步驟1

53、.大腸桿菌在LB平板上劃線培養(yǎng)12-16小時，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)大腸桿菌到對數(shù)期。2.取1ml培養(yǎng)物7000rpm,離心3min.收集菌體，冰浴放置。3.用預冷的氯化鎂懸浮菌體，7000rpm離心3min.收集菌體，冰浴放置。4.用預冷的氯化鈣懸浮菌體，冰浴15min，7000rpm離心3min收集菌體，冰浴放置。5.加入200l預冷氯化鈣(或TFB)，放置于冰浴，即得感受態(tài)細胞。四、實驗結(jié)果與分析獲得了良好的大腸桿菌感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素：1. 細胞的生長狀態(tài)和密度最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，

54、及貯存在4的培養(yǎng)菌液。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)在5×107個左右為佳。即應用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制。對TG1菌株，OD600為05時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應注意OD600值與細胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細胞一般應是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細胞還應與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。2. 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細胞達到飽和。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實驗證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進行轉(zhuǎn)化。此外