瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)PPT課件

1、 什么是電泳？ 帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。 生物大分子如蛋白質(zhì),核酸,多糖等大多都有陽離子和陰離子基團(tuán),稱為兩性離子在電場(chǎng)中,帶電顆粒向正極或負(fù)極遷移,遷移的方向取決于它們帶電的符號(hào)。第1頁/共27頁按分離原理的不同，電泳分為4類: 移動(dòng)界面電泳 區(qū)帶電泳 等電聚焦電泳 等速電泳電泳有幾類？電泳有幾類？第2頁/共27頁瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳原理第3頁/共27頁 瓊脂糖凝膠電泳的操作操作步驟 配膠

2、 點(diǎn)樣 電泳 成像拍照 EB染色 膠圖分析第4頁/共27頁1、配膠 按所要分離的DNA分子的大小，稱取適量的瓊脂糖粉末，放入錐形瓶，加適量1TAE電泳緩沖液; 然后置微波爐內(nèi)加熱搖勻至完全溶化呈透明狀，適當(dāng)冷卻后倒入膠托; 膠完全冷凝后放入電泳槽，電泳槽里的緩沖液必須沒過膠面。第5頁/共27頁第6頁/共27頁2、點(diǎn)樣！根據(jù)樣品不同可分兩種點(diǎn)樣體系：A、樣品+6Xloading bufferB、樣品可直接點(diǎn)樣（如ssp）最后記得點(diǎn)marker，并擺正膠的位置第7頁/共27頁點(diǎn)樣第8頁/共27頁3、電泳！ 點(diǎn)完樣后連接電源，設(shè)置好電源的參數(shù)，開始電泳。當(dāng)溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動(dòng)至一定長度即可停止電

3、泳。 電壓要求：20V/CM膠，在樣品出孔用低壓（3V/CM，15min），然后調(diào)回標(biāo)準(zhǔn)電壓，跑出的條帶較好。第9頁/共27頁電泳槽第10頁/共27頁4、EB染色 溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間。在紫外線照射EB-DNA復(fù)合物時(shí)，出現(xiàn)不同的效應(yīng)。注意：嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)和非污染區(qū)，不把污染區(qū)的物品拿到非污染區(qū)，碰過EB的手套要及時(shí)丟棄！第11頁/共27頁EB染膠區(qū)第12頁/共27頁5、成像拍照 Tanon-2500數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)把圖像攝錄、處理、打印一體化。采用高分辨率CCD，高質(zhì)量、高清晰度，保證攝錄凝膠圖像在低照度下的靈敏 度、不掉失條帶。第13頁/共27頁 Ta

4、non-2500數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)第14頁/共27頁6、膠圖分析 以SBT-PCR為例，主要做A、B、DR三個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)條帶大小不同.第15頁/共27頁第16頁/共27頁一、配膠 1.電子稱的使用，要時(shí)刻注意保持電子稱的精確性，保持清潔，根據(jù)不同的濃度的膠稱瓊脂糖。 2.加TAE的量要適當(dāng)，以免配出來的膠太薄導(dǎo)致膠孔太淺或濃度太低。 3.倒膠前膠托一定要洗干凈，并擦干；倒膠時(shí)要待膠冷到一定溫度搖勻盡量不要產(chǎn)生氣泡。若膠液的溫度太高要頂在膠托防止膠托變形。第17頁/共27頁二、點(diǎn)樣電泳 1.96孔塑料板要干凈，loading要點(diǎn)均勻，控制在12ul的量，并做好對(duì)應(yīng)標(biāo)記。 2.加樣時(shí)，槍頭要

5、上緊，吸樣均一準(zhǔn)確，排液時(shí)吸頭不要有殘留。 3.點(diǎn)完樣后及時(shí)蓋上膠墊，注意不要蓋反。 4.點(diǎn)電泳前最好檢查待用膠是否合格；點(diǎn)電泳時(shí)要對(duì)準(zhǔn)膠孔，盡量點(diǎn)完所有的樣。 5.點(diǎn)完樣勿忘點(diǎn)marker并擺正膠位，電泳儀正負(fù)極不要插反，電泳槽的蓋子要蓋緊。第18頁/共27頁三、EB染色 1.切膠要準(zhǔn)，取膠要穩(wěn)，泡膠要慎，避免EB濺起。 2.碰到EB的手套要及時(shí)丟棄。 3.EB液要適時(shí)跟換，盤子要清洗。 4.抹布要嚴(yán)格區(qū)分，不可交叉使用。第19頁/共27頁四、Tanon Tanon-2500 數(shù)碼凝膠圖像分析儀的使用 1.使用前要注意清潔，以免影響膠圖的清晰度。 2.照膠時(shí)盡量減少開紫外燈的時(shí)間。 3.拍照時(shí)先關(guān)攝像頭再關(guān)紫外燈，不可顛倒，嚴(yán)格按照照膠的流程進(jìn)行。 4.照好的膠及時(shí)丟棄。第