生產(chǎn)用種細(xì)胞鑒定的相關(guān)93

1、生產(chǎn)用種細(xì)胞鑒定的相關(guān)檢測技術(shù)摸索與掌握1、前言 在歷史上，由于細(xì)胞源性的生物制品存在外來的污染物或出于對用于制備產(chǎn)品的細(xì)胞性質(zhì)方面的考慮，引發(fā)了一些對產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)切。重組 DNA(rDNA)制品的質(zhì)量也與細(xì)胞基質(zhì)中構(gòu)建的表達(dá)載體有關(guān)：由此，人們達(dá)成共識，認(rèn)為細(xì)胞基質(zhì)的特性以及與之相聯(lián)系的事件將影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性，為有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，需對操作細(xì)胞基質(zhì)的各方面進(jìn)行嚴(yán)格控制。 用連續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生產(chǎn)生物技術(shù)產(chǎn)品及生物制品的最大優(yōu)點是使每批產(chǎn)品都有一個經(jīng)檢定過的共同起源，即細(xì)胞的儲備庫。要避免被污染的細(xì)胞基質(zhì)(或細(xì)胞庫)用于生產(chǎn)，摸索與掌握生產(chǎn)用種細(xì)胞鑒定的相關(guān)檢測技術(shù)并對被污染細(xì)胞進(jìn)行排除

2、是十分重要的，否則，由于受污染的細(xì)胞庫不能使用，必須重新建立細(xì)胞庫，這將延誤產(chǎn)品上市或開發(fā)的時機。 2、目前的生產(chǎn)用種細(xì)胞庫及其檢測技術(shù)現(xiàn)狀分析 生產(chǎn)部門各車間雖儲備了一些細(xì)胞資源，有細(xì)胞庫的存在，但不完 善，比如一些細(xì)胞只有粗略簡單的記錄（凍存人和日期），對于其傳代的穩(wěn)定性、產(chǎn)毒效果、及其相應(yīng)支原體檢測、外源病毒和細(xì)胞的檢測等都未涉及。而在實際生產(chǎn)中，由于生產(chǎn)用細(xì)胞存在外來污染物給生產(chǎn)帶來了不小的影響，使生產(chǎn)質(zhì)量不夠穩(wěn)定，抗原毒價難以提高，而表現(xiàn)最為明顯的是支原體的污染。 支原體污染細(xì)胞后，存在于細(xì)胞間隙或依附于細(xì)胞膜上生長，對培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生各種各樣的惡果：多數(shù)細(xì)胞感染后，細(xì)胞形態(tài)并無明顯變化

3、，特別是一些腫瘤細(xì)胞系株，雖然有支原體污染，細(xì)胞仍然生長迅速，培養(yǎng)上清液仍然清亮。一般情況不會引起明顯的細(xì)胞病變，所以不易察覺，但隨時間延長，由于競爭營養(yǎng)成分及支原體代謝產(chǎn)物的毒性作用，細(xì)胞生長活性受到影響，可顯著影響生產(chǎn)用細(xì)胞的培養(yǎng)及相應(yīng)生物活性的發(fā)揮，并影響病毒培養(yǎng)的產(chǎn)量。改變各種代謝活動致使不能進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的正常生化研究；有的細(xì)胞污染后可有明顯的改變，如生長速度減慢甚至停止、細(xì)胞體積增大，細(xì)胞碎片越來越多，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞與細(xì)胞間隙出現(xiàn)膜狀沉積，細(xì)胞無法傳代、部分細(xì)胞變圓并從培養(yǎng)瓶壁上脫落等，很大程度上影響生產(chǎn)以及苗毒質(zhì)量的提高。例如08年的藍(lán)耳生產(chǎn)，由于組織了相關(guān)提高藍(lán)耳毒價系列實驗，對其

4、工藝關(guān)鍵控制點進(jìn)行了進(jìn)一步的準(zhǔn)確把握，使生產(chǎn)的前期毒價得到明顯提高，但后期毒價又回落下來。同樣在開展利用抗體血清提高藍(lán)耳毒價實驗時，使用了含抗體血清的比不含的毒價明顯高一個滴度，但其最終收獲的毒價卻遠(yuǎn)低于接種時的種毒毒價，達(dá)不到理想效果。而這兩種情況有一個共同點：細(xì)胞狀態(tài)不好，病毒繁殖不理想。后取細(xì)胞樣送檢，均支原體陽性，足見其對生產(chǎn)造成的影響是不容忽視的。 而我中間監(jiān)測組雖向質(zhì)檢和產(chǎn)品技術(shù)部取得支持，通過摸索掌握了支原體檢測的基本方法，可利用產(chǎn)品技術(shù)部提供的液體培養(yǎng)基進(jìn)行檢測。但光從支原體液體培養(yǎng)基的顏色變化來判定陽性不夠嚴(yán)謹(jǐn)，因為假陽性的可能性較大。按照規(guī)程上的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法是要通過固體培養(yǎng)

5、基培養(yǎng)獲得典型菌落并鑒別才能確切判定，而質(zhì)檢和產(chǎn)品技術(shù)部目前在這一檢測方面，液體培養(yǎng)基的檢測技術(shù)比較成熟，其缺陷在于存在的假陽性或假陰性的可能性較大，根據(jù)國際通行的標(biāo)準(zhǔn)，必須根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序中的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出支原體菌落才能最終定論，而我公司在固體培養(yǎng)基的支原體檢測技術(shù)方面不太成熟。 細(xì)胞系鑒定和檢測的一般原則 ：對建系細(xì)胞基質(zhì)的鑒定和檢測是生物技術(shù)產(chǎn)品及生物制品質(zhì)量控制的重要組成部分。通過對主細(xì)胞庫的鑒定，可對是否存在來自其他細(xì)胞系的細(xì)胞、外來和內(nèi)在因子以及其他污染物(如來自于宿主的毒素或抗生素)進(jìn)行評估。檢測的目的是為了證實用于生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)的特性、純度和可用性。在有些情況下，其他方面如致癌

6、性或胞核學(xué)的檢測也是有用的。對某一細(xì)胞基質(zhì)選擇何種檢測方案要根據(jù)細(xì)胞的生物學(xué)特性(如生長的需求)、它的培養(yǎng)歷史(如人源和動物源性的生物試劑的使用)和可應(yīng)用的試驗方法而定。細(xì)胞基質(zhì)的鑒定程度將影響以后的生產(chǎn)階段所需的常規(guī)試驗的類型或水平。生產(chǎn)廠家應(yīng)對每個主細(xì)胞庫作一次純度試驗和鑒別實驗，對將要注冊的每一產(chǎn)品在細(xì)胞培養(yǎng)期間作一次穩(wěn)定性試驗。此外，還要對每一個工作細(xì)胞庫作純度和有限的鑒別試驗,而我們在這一塊存在檢測漏洞, 故在此對相關(guān)檢測技術(shù)進(jìn)行開展和完善.3、目的與意義 對細(xì)胞系鑒定和檢測一般從鑒別試驗、純度試驗、穩(wěn)定性試驗、胞核學(xué)和致瘤性試驗來開展和完善，本試驗致力于開展各種細(xì)胞鑒定和檢測的相關(guān)

7、方法和技術(shù)，具體重點學(xué)習(xí)與掌握細(xì)胞的支原體、外源病毒污染檢測、核型分析等技術(shù)。有利于整理手上現(xiàn)有細(xì)胞資源，建立完善生產(chǎn)用種細(xì)胞庫，對細(xì)胞用于生產(chǎn)的可適性進(jìn)行掌握，以滿足生產(chǎn)需求，為保證生產(chǎn)、提高產(chǎn)品質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。4、實驗方案4、1方案一 支原體培養(yǎng)基的配制及其檢測實驗4.1.1實驗?zāi)康?尋找一種方便實用、檢出率高的支原體培養(yǎng)基，并能運用其檢測生產(chǎn)用種細(xì)胞是否受支原體污染，以能觀測到典型支原體菌落為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。4.1.2實驗人員： 實驗時間：9月1日12月30日4.1.3實驗方法4.1.3.1檢測方法一 直接購買豬鼻支原體合成培養(yǎng)基按其使用方法進(jìn)行檢測4.1.3.2檢測方法二 按照中華人民共和

8、國獸用生物制品規(guī)程進(jìn)行檢測4.1.3.2.1材料與器材 材料: 豬鼻支原體菌種、制備培養(yǎng)基相關(guān)藥品 器材: 小試管、長吸管、錐形瓶、玻璃棒、天平、量筒、燒杯、平皿、 正壓不銹鋼濾器、除菌濾膜、高壓滅菌鍋、pH計、顯微鏡、移液槍、 二氧化碳培養(yǎng)箱4.1.3.2.2培養(yǎng)基的制備 液體培養(yǎng)基 PPLO肉湯粉 21g 葡萄糖 5g 10%精氨酸溶液 10ml 1%醋酸鉈溶液 10ml 25%酵母浸出液 100ml 10倍MEM 10ml 8萬單位/ml青霉素溶液 10ml 豬（馬）血清 100ml 1%酚紅溶液 1ml 雙蒸水 加至1000ml 用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.8，過濾除菌，定

9、量分裝，置 -20保存?zhèn)溆谩?固體培養(yǎng)基 PPLO肉湯粉 21g 葡萄糖 5g 1%醋酸鉈溶液 10ml 25%酵母浸出液 100ml 瓊脂粉 15 雙蒸水 加至1000ml 上述成分混合后加熱溶解，定量分裝，116高壓滅菌20min，置2-8 保存?zhèn)溆谩?添加成分 固體培養(yǎng)基 100ml 血清 10ml 8萬單位/ml青霉素溶液 1ml 10%精氨酸溶液 2ml 10倍MEM 1ml 使用前將瓊脂培養(yǎng)基加熱溶解，當(dāng)溫度降到60左右添加輔助成分。4.1.3.2.3檢測方法 液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 取待檢樣5ml，接種小瓶液體培養(yǎng)基中，再從小瓶中取0.2ml移植接種于一小管液體培養(yǎng)基中，將小瓶與小管放3

10、7培養(yǎng)，分別于接種后5日、10日、15日從培養(yǎng)瓶中取0.2ml 培養(yǎng)物移植到小管液體培養(yǎng)基內(nèi)，每日觀察培養(yǎng)物有無顏色變化，若無變化，則在最后一次移植小管觀察14日后，停止觀察。在觀察期內(nèi)，如果發(fā)現(xiàn)小瓶或任何一支小管培養(yǎng)物顏色出現(xiàn)明顯變化，在原pH值變化達(dá)±0.5時，應(yīng)立即移植于小管液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，觀察液體培養(yǎng)基中是否出現(xiàn)恒定的pH變化，及固體上有無典型的煎蛋狀支原體菌落。 固體培養(yǎng)基培養(yǎng) 在每次液體培養(yǎng)物移植小管培養(yǎng)的同時，取培養(yǎng)物0.1ml到0.2ml接種于瓊脂平板，置含5%-10%二氧化碳潮濕的環(huán)境、37培養(yǎng)。此外，在液體培養(yǎng)基顏色出現(xiàn)變化，在原值變化達(dá)±0.5

11、時也同時接種瓊脂平板。每5-7日，在低倍顯微鏡下觀察，檢查各瓊脂平板有無支原體菌落出現(xiàn)，經(jīng)14日觀察，仍無菌落者停止觀察。每次檢查時需設(shè)陰、陽性對照，在同條件下培養(yǎng)觀察。結(jié)果判定 被接種物的任何一個瓊脂平板上出現(xiàn)支原體菌落，判陽性。 若陽性對照中至少一個平板出現(xiàn)支原體菌落，而陰性對照中無支原體生長，則檢驗有效。 備用檢測方法一1.配方 KM2液體培養(yǎng)基 Eagles MEM 450 mLL 1醋酸鉈 125 mlML 酵母浸出粉 10 gL 04酚紅 175 mLL 用 1 molL的 NaOH調(diào) pH 7678，分裝 ，高壓滅菌 (121)15 min，然后置 4保存。使用前加青霉素 20萬

12、單位L、3谷氨酰胺 10 mLL、滅菌健康豬血清 200 mL/L2.方法2.1培養(yǎng) 取05 mL菌液，加入含 45 mL KM2液體培養(yǎng)基 的小瓶 中，37培養(yǎng)。每 日觀察其顏色變化，并與 陰性對照進(jìn)行 比較。每 3天傳代 1次 ，3- 4代后 ，離心 (15 000 rrain)收集菌體，懸浮于 02 molL的 PBS緩沖液中。 2.2姬姆薩氏染色法 取滅菌潔凈載玻片 ，滴加菌體懸浮液 2滴 ，自然干燥后 ，經(jīng)甲醇固定，然后用姬姆薩氏染色法染色 30 mJn，水漂洗干燥后 ，100 X倍顯微鏡下觀察。3 . 鑒定試驗 3.1 染色鏡檢 挑取傳代的單菌落液體培養(yǎng)物，分別用瑞士染色和革蘭氏染

13、色，油鏡鏡檢。 3.2 普通培養(yǎng)基生長 將傳代的單菌落液體培養(yǎng)基接種普通肉湯瓊酯板，濕盒 37培養(yǎng)。 3.3 兔血培養(yǎng)基生長 無菌采鮮兔血制成兔血瓊酯板 ，同樣接種傳代的單菌落液體培養(yǎng)物 ，濕盒 37培養(yǎng) 3.4 吸附紅細(xì)胞 在指數(shù)生長期的選擇培養(yǎng)基瓊酯板上緩緩加入025的兔向紅細(xì)胞懸液，作用20 rnin，用生理鹽水洗滌 23次。 3.5 生化試驗 用傳代的單菌落液體培養(yǎng)物接種尿素、七葉苷、甘露糖、精氨酸雙水解、葡萄糖細(xì)菌微量發(fā)酵生化鑒定管(北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，37 培養(yǎng)。備用檢測方法二1.配方 一種高效支原體培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 蛋白胨 9.0-11.0 新鮮牛肉提取純粉 氯化鈉

14、磷酸二氫鉀 蒸餾水 液體培養(yǎng)基內(nèi)還加有： 新生牛血清 新鮮酵母浸液 尿素溶液或精氨酸溶液 酚紅溶液 青霉素 固體培養(yǎng)基內(nèi)還加有： 瓊脂 2.方法 略備用檢測方法三1、 配方： （1）支原體肉湯培養(yǎng)基 成分 加量 豬胃消化液 500ml 牛肉浸（粉）液 500ml 酵母浸液 5.0g 氯化鈉 2.5g 葡萄糖 5.0g 酚紅 0.02g 將上述成分混合溶解，分裝于玻璃管中，每支8ml，于121高壓滅菌15min備用。 （2）支原體半流體培養(yǎng)基：將（1）中酚紅去掉，加入3g瓊脂即為半固體培養(yǎng)基。 （3）支原體瓊脂培養(yǎng)基：將（1）中酚紅去掉，加入13.0-15.0g瓊脂即可。2、 檢查操作方法： （

15、1）按藥典要求，檢查支原體采用支原體半流體培養(yǎng)基及支原體肉湯培養(yǎng)基（或支原體固體培養(yǎng)基），每個樣品準(zhǔn)備上述培養(yǎng)基各10支。 （2）操作程序 a.配制12.5萬單位/青霉素及1.2%濃度的醋酸鉈儲備液，用0.22ul除菌濾膜濾后備用 b.將支原體半流體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基在使用前煮沸10-15min完全融化，冷卻至56 左右備用。 c.按無支原體滅活小牛血清：12.5萬單位/ml青霉素=20：1的比例混合（若是分離原體用，可按無支原體滅活小牛血清：1.2%醋酸鉈：12.5萬單位/ml青霉素=20：2：1），加入到支原體肉湯培養(yǎng)基及56左右支原體半流體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中（牛血清、醋酸鉈青霉素的使用

16、終濃度分別為17%、0.1%、2000U/ml)每支2.0ml. d.將待檢cell加入到上述準(zhǔn)備好培養(yǎng)基中，每份樣品接種支原體半流體培養(yǎng)基及支原體肉湯培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基）各4支，每支接種0.5-1.0ml,置（36±0.5）培養(yǎng)21天，每三天觀察一次，留兩支對照同等條件下培養(yǎng)。 e.于接種后第7天取出上述4支接種樣品培養(yǎng)基中的2支進(jìn)行傳代培養(yǎng)（另2支繼續(xù)培養(yǎng)），每支接種半流體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基（或固體培養(yǎng)基）各2支，每只接種1.0ml,置（36±0.5）培養(yǎng)21天，每三天觀察一次。 （3）結(jié)果判定 a.試驗成立。培養(yǎng)基對照陰性，試驗成立，結(jié)果有效。 b.陰性。試驗到期接種

17、樣品的初種及轉(zhuǎn)種培養(yǎng)基（每支培養(yǎng)基共8支）均無支原體生長。 c. 復(fù)試。如疑有支原體生長，應(yīng)取加倍量供試品在上述2種培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)試（每支接種待測樣品1.0-2.0ml)經(jīng)復(fù)試后無支原體生長則判合格。 d.陽性。試驗到期接種供試品的初種或轉(zhuǎn)種培養(yǎng)基有支原體生長或結(jié)果可疑經(jīng)復(fù)試后仍有支原體生長，則為陽性結(jié)果，判定供試品被支原體污染。 支原體在半固體培養(yǎng)基的典型菌落如“彗星”狀。備用檢測方法四1、 配方（1）液體培養(yǎng)基1L PPLO肉湯粉 21g 酚紅 0.02g 馬血清 200ml 15%酵母浸出液 100ml 10×MEN 培養(yǎng)液 100ml 稱取21g PPLO肉湯粉、0.02g酚

18、紅 于600ml蒸餾水中加熱攪拌溶解，12115min滅菌，待溫度降至室溫后，于凈化工作臺中加入200ml馬血清100ml 15%酵母浸出液，100ml解凍10×MEN 培養(yǎng)液，混勻分裝至無菌有蓋螺旋試管10ml/管，保存4一個月。（2）固體培養(yǎng)基 1L PPLO肉湯粉 21g 酚紅 0.02g 細(xì)菌瓊脂 15g 蒸餾水 600ml 馬血清 200ml 15%酵母浸出液 100ml 10×原液 100ml 稱取21g PPLO肉湯粉、0.02g酚紅，15g細(xì)菌瓊脂于600ml蒸餾水中加熱溶解，12115min滅菌，放入50水浴待溫度降至50時于無菌操作臺中加200ml馬血清

19、，100ml 15%酵母浸出液及100ml解凍的10×原液，混勻后倒入培養(yǎng)皿中5ml/培養(yǎng)皿，4，1個月。2、 操作步驟 （1）取1ml cell培養(yǎng)液或0.2ml cell懸液接種于液體培養(yǎng)基中37培養(yǎng)2周，觀察是否渾濁或PH是否改變，1-2周后分別取0.1ml液體培養(yǎng)液涂在固體培養(yǎng)基上，倒放置于37厭氧缸培養(yǎng)至少3周，持續(xù)觀察有無菌落出現(xiàn)。 （2）另取取1ml cell培養(yǎng)液或0.2ml cell懸液涂抹于固體培養(yǎng)基上37厭氧培養(yǎng)3周，持續(xù)觀察有無菌落出現(xiàn)。 （3）另做正負(fù)反應(yīng)對照組，負(fù)反應(yīng)組為待測cell的新鮮培養(yǎng)基。4、2方案二 細(xì)胞核型分析4、2、1目的與意義 在部分滅活疫

20、苗的生產(chǎn)中使用細(xì)胞系,將特定的細(xì)胞系用于疫苗生產(chǎn)前,必須對細(xì)胞進(jìn)行全面的鑒定,其中細(xì)胞的核型分析是鑒定的重要組成部分,因核型能反映物種的種質(zhì)特性,是再現(xiàn)性很高的細(xì)胞遺傳學(xué)信息,為物種所特有。本實驗對生產(chǎn)豬細(xì)小病毒滅活苗的IBRS-2細(xì)胞不同代次的染色體核型進(jìn)行比較分析，以確定生產(chǎn)該病毒細(xì)胞的最高限制代次。成功的進(jìn)行了該細(xì)胞的核型分析，將意味著掌握這一檢測技術(shù)，實現(xiàn)對生產(chǎn)用細(xì)胞進(jìn)行代次使用情況的監(jiān)控與把握。4、2、2 實驗時間：10月1日10月31日 實驗人員:4.2. 3試驗材料細(xì)胞: 試驗所使用的IBRS-2原始細(xì)胞來源于生產(chǎn)細(xì)胞庫，基礎(chǔ)細(xì)胞、工作細(xì)胞、最高限制代次細(xì)胞、高于最高代次10代細(xì)

21、胞均由本組自行傳代培養(yǎng)。藥品:甲醇,分析純,天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心產(chǎn)品; 冰醋酸,分析純,沈陽市欣西試劑廠; Giemsa,BIO BASIC公司產(chǎn)品。 器材:離心機、離心管、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等4、2、4試驗方法4241染色體標(biāo)本的制備取對數(shù)生長期細(xì)胞(大約80%匯合) ,加入秋水仙素至終濃度為0. 2g/mL,繼續(xù)置于37 溫室中培養(yǎng)23 h。培養(yǎng)結(jié)束后, 用常規(guī)方法消化, 轉(zhuǎn)入離心管中, 離心8 min,棄上清液。用0. 5% KCl溶液懸浮細(xì)胞,在37 低滲處理20 min,加入新鮮固定液(甲醇冰醋酸= 31) 1 mL,混勻,固定2 min,離心8 min,棄上清液。加入新鮮

22、固定液2 mL,混勻,固定30 min,離心8 min,棄上清液。加4 mL 新鮮固定液,固定20 min,離心8 min,小心吸棄上清,據(jù)懸液中細(xì)胞密度大小,留取適量固定液,吸打均勻,制成濁度適中的細(xì)胞懸浮液。將預(yù)冷的干凈載玻片成45°傾斜,用吸管滴上23滴細(xì)胞懸液,將載玻片掠過酒精燈幾次,室溫下干燥。在顯微鏡下觀察,如果細(xì)胞能均勻的鋪展,中期相不重疊,則用同樣細(xì)胞濃度樣品多制備幾份樣品。否則要進(jìn)一步稀釋細(xì)胞懸液,或者調(diào)整滴片高度,以達(dá)到滿意的鋪片效果。用Giemsa染色,取Giemsa原液一份加9份PBS(pH = 6. 8)混合配成染色液(現(xiàn)用現(xiàn)配) 。染片1530 min,流

23、水沖冼(沖片子的背面) ,水漂洗,晾干。Giemsa 染色法：染液制備（1）稱Giemse 粉0.5g、甘油22ml，在研缽內(nèi)先用少量甘油與Giemsa 充分混合，研磨至無顆粒；（2）再將剩余甘油混在一起；56保溫2 小時后，加入33ml 純甲醇，保存于棕色瓶內(nèi)。染色步驟(以蓋片培養(yǎng)法或涂片法為例)（1）用pH6.8PBS緩沖液，按1：9 比例取Giemsa 染液和PBS 緩沖液混合配成染色液；（2）細(xì)胞標(biāo)本用甲醇固定10 分鐘，或1：3 醋酸/甲醇固定30 分鐘，用滴管把染色液布滿玻片上(注意不要有氣泡，用染色缸染色亦可)；（3）染1015 分鐘后，用自來水沖去玻片上多余的染料，空氣干燥、二甲苯透明、（溶于70ml 蒸餾水中）光學(xué)樹脂膠封固。結(jié)果 胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色，胞漿染成粉紅色。注意事項：染色液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時間最好不超過48 小時，舊染液染色效果不好。另外Giemsa 對pH 極敏感，緩沖液pH 值要調(diào)準(zhǔn)確，否則染色效果不好。如用染色缸染色時，隨染色時間的延長，在染液表面常形成一層氧化膜(發(fā)亮)，這層氧化膜易附在片上形成污穢，且不易除掉。因此在用染色缸染色，尤其用的不是現(xiàn)配者時，染色前應(yīng)先用小片濾紙刮除液面的氧化層再進(jìn)行染色。染色完畢，應(yīng)把標(biāo)本浸入水中洗除染液，或用自來水直接沖掉多余染液。4242染色體分析方法每代細(xì)胞選50個鋪展良好,周緣清晰的