SILAC定量蛋白質組學技術簡介

1、silac定量蛋白質組學 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-1663silac定量蛋白質組學o 1：silac定量蛋白質組學原理o 2: 應用 2.1：silac定量蛋白質組學 2.2: silac研究蛋白質相互作用 2.3：silac研究蛋白質與dna相互作用 2.4：silac研究蛋白質與rna相互作用 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16631 1：silacsilac定量蛋白質組學原理定量蛋白質組學原理o 1.11.1：silacsilac定量蛋白質組學的原理定量蛋白質組學的原理o 1.21.2：

2、silacsilac技術流程技術流程 .1：培養(yǎng)基準備：培養(yǎng)基準備 .2：細胞標記與測試：細胞標記與測試 1.2.3: 1.2.3: 實驗處理實驗處理 .3：蛋白質分離與質譜分析：蛋白質分離與質譜分析 .4：結果形式：結果形式 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-1663 silac法。 1、標記：在缺乏lys和arg的培養(yǎng)基中添加lys和arg的同位素lys(d4或13c6 15n4)、arg(13c6,或13c6 15n4)等培養(yǎng)細胞，使蛋白質被標記成“中型”或“重型”； 2、細胞處理

3、，如藥物處理； 3、細胞裂解、提取蛋白質； 4、等量混合對照與處理組蛋白質、sds-page電泳、染色； 5、割取蛋白質條帶，胰蛋白酶消化，質譜分析。1.11.1：silacsilac定量蛋白質組學原理定量蛋白質組學原理1.11.1：silacsilac定量蛋白質組學原理定量蛋白質組學原理 技術優(yōu)勢技術優(yōu)勢目前比較蛋白質組學最先進方法目前比較蛋白質組學最先進方法 （1）高效性：）高效性：silac是體內標記技術，標記效率可高達100%； （2）定量精確：）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實驗內差異； （3）高通量、靈敏度高：）高通量、靈敏度高：可同時鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白

4、質，且檢可測測到納克級水平； （4）相容性：）相容性：可以對多種在dmem或rpmi 1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細胞或細菌中表達的蛋白進行標記； （5）靈活性：）靈活性：在缺乏l-賴氨酸和l-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標記的這兩種氨基酸，操作方便。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-166.1：培養(yǎng)基準備：培養(yǎng)基準備材料：材料： （1）：lys或（和）arg缺陷型1640培養(yǎng)基， lys或（和）arg缺陷型dmem培養(yǎng)基。 （2）：透析fbs。 （3）：穩(wěn)定同位素標記的lys和arg。l-lysine(13c6), l-lysine

5、 (13c6,15n2), l-lysine(13c6,15n2), l-lysine(15n2,d9), l-lysine(4,4,5,5-d4) ,l-arginine(13c6), l-arginine (13c6, 15n4), l-arginine(13c6,15n4)。培養(yǎng)基制備：培養(yǎng)基制備： 取相應量的穩(wěn)定同位素氨基酸lys和arg各50mg,添加到500ml培養(yǎng)基中，同時添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um濾膜過濾，4度保存?zhèn)溆?。根據實驗的需要，可以配制“中”型和“重”型培養(yǎng)基。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-1663

6、.2：細胞標記與測試：細胞標記與測試標記：標記： 一般細胞經過添加同位素的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5-6代后，一天或2天傳代一次，細胞中蛋白質的lys和arg將被同位素氨基酸取代。添加了穩(wěn)定同位素（“中”或“重”型）的細胞與“輕”型細胞相比細胞生長速度可能偏慢，這是由于透析血清與中缺乏一些鹽成分，可以讓透析血清在pbs里面透析，透析膜的孔徑一般為10kda.標記測試：標記測試： 在進行正式實驗之前，需要對細胞進行標記測試，測試細胞中蛋白質的lys和（或）arg是否被相應的同位素氨基酸取代。收取 蛋白質后，等量混合，sds-page分離，lc-ms/ms檢測。 輝駿生物：輝駿生物：http

7、:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-166.2：細胞標記與測試：細胞標記與測試細胞經過傳代培養(yǎng)細胞經過傳代培養(yǎng)7 7天后，同一肽段被天后，同一肽段被“重重”型肽段取代型肽段取代 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16631.2.3: 1.2.3: 實驗處理實驗處理 當標記測試檢測到蛋白質已被同位素氨基酸標記后，可以進行細胞處理，如藥物處理，病毒處理等。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-166.3：蛋白質分離與質譜分析：蛋白質分離與質譜分析o（1）：提取“輕

8、”型”，“中”型，“重”型細胞蛋白質，等量混合，sds-page分離，染色。o（2）：割取蛋白質條帶，胰蛋白酶酶切。o（3）：lc-ms/ms（儀器：ltq orbitrap xl)分析，數(shù)據檢索。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-166.4：結果形式：結果形式 lc-ms/ms分析結果，將會給出每個肽段的質譜峰圖及定量信息。結果將會已excel表格呈現(xiàn)。 肽段質譜峰圖及表達量：2: silac2: silac應用應用o 2.1 2.1：silacsilac定量蛋白質組學實例定量蛋白質組學實例o 2.2: silac2.2: si

9、lac研究蛋白質相互作用研究蛋白質相互作用o 2.32.3：silacsilac研究蛋白質與研究蛋白質與dnadna相互作用相互作用o 2.42.4：silacsilac研究蛋白質與研究蛋白質與rnarna相互作用相互作用 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16632.12.1：silacsilac定量蛋白質組學實例定量蛋白質組學實例 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16632.1 schematic for silacsilac實驗流程圖2.1 ms spectra showing the four m

10、ajor patterns of phosphorylation observed 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-1663silac定量結果圖例，質譜峰的高度表示蛋白表達的相對強度. summary of fold change with her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. proteins with a ratio1.5(upperred line) are consideredas increased in their tyrosi

11、ne phosphorylation level,and those with ratios0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. in3t3-her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,and 81 proteins showed a significant decrease 2.1 quantification of phosphorylation by silac 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16632.1 conclusion 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16632.2 silac2.2 silac研究蛋白質與蛋白質相互作用研究蛋白質與蛋白質相互作用j. cell biol. vol. 183 no