基因個體化治療

1、個體化藥學服務與基因相關概念人類基因組計劃人類基因組計劃n1990年正式啟動人類基因組測序計劃年正式啟動人類基因組測序計劃, 2003年年完成。完成。 識別人類基因組的所有大約識別人類基因組的所有大約3萬個萬個DNA測定組成人類基因組測定組成人類基因組DNA的約的約30億對核苷酸億對核苷酸的序列的序列 個體化用藥個體化用藥主要潮流，大勢所趨主要潮流，大勢所趨 WHO：2000年提出，21世紀步入“3P”時代預防（preventive），預測（predictable)和個體化（personal） 美國FDA：2006全美3600萬份用藥記錄中，880萬份（24.3%）使用了說明書中有基因組生物標

2、記信息的藥物。 FDA：2013.12，已經(jīng)批準超過200個需要患者基因信息指導才能準確治療的藥物，涉及約40%的患者。 三甲評審標準要求：進行個體化給藥方案的研究與監(jiān)測We wouldnt think of buying shoes in a single size我們不會愿意買只有一個尺碼的皮鞋So why should we be satisfied with one-size-fits-all medicine?那為什么我們就滿足于千人一方呢？ 據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，各國住院病人發(fā)生藥品不良反應的比率在10%10%至20%20%，其中5%5%的患者會因為嚴重的藥品不良反應而死亡。

3、目前全世界死亡的病人中，約有1/31/3的患者死于用藥不當，藥品不良反應致死占社會人口死因的第4 4位。 藥物毒性或不良反應的發(fā)生往往是因為藥物反應的個體差異所致；個體差異使藥品的效果差異顯著。個體化藥學臨床應用的意義個體化藥學臨床應用的意義降低醫(yī)療事故發(fā)生率縮短平均住院日提高醫(yī)院收入為臨床用藥提供更精確的指導（精準劑量,減少不良反應，藥物相互作用等）療效好療效好療效不好或無療效療效不好或無療效毒副反應毒副反應藥物反應的個體差異藥物反應的個體差異相同藥物治療的一組人群相同藥物治療的一組人群基因基因? 環(huán)境環(huán)境?藥物不良藥物不良反應反應藥物效應 據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，各國住院病人發(fā)生藥品不良

4、反應的比率在10%10%至20%20%，其中5%5%的患者會因為嚴重的藥品不良反應而死亡。 目前全世界死亡的病人中，約有1/31/3的患者死于用藥不當，藥品不良反應致死占社會人口死因的第4 4位。 藥物毒性或不良反應的發(fā)生往往是因為藥物反應的個體差異所致；個體差異使藥品的效果差異顯著。藥物有效率三環(huán)類抗抑郁藥50-80 %50-80 % 阻滯藥65-85 %65-85 %ACEACE抑制藥70-90 %70-90 %5-HT5-HT1 1 抑制藥55-80 %55-80 %HMG CoA HMG CoA 還原酶抑制藥70-90 %70-90 %干擾素30-70 %30-70 %抗惡性腫瘤藥30

5、-80 %30-80 % 藥物劑量（mgmg）氯氮卓1515 - - 6060 氯氮平2525 - - 600600 奧氮平5 5 - - 2020普萘洛爾10 - 240 10 - 240 美托洛爾12.5 - 200 12.5 - 200 卡托普利6.25 - 25 6.25 - 25 奈法唑酮5050 - - 300300 纈沙坦80 - 32080 - 320維拉帕米80 - 48080 - 480利血平0.125 -1 0.125 -1 相關藥物的劑量范圍相關藥物的劑量范圍各類常用藥物的有效率各類常用藥物的有效率0%0%10%10%20%20%30%30%40%40%50%50% 6

6、0%60%70%70%80%80%90%90% 100%100%基因基因環(huán)境因素環(huán)境因素IIII糖尿病糖尿病乳腺癌乳腺癌男性心肌梗死男性心肌梗死原發(fā)性高血壓病原發(fā)性高血壓病冠心病冠心病I I糖尿病糖尿病苯妥英苯妥英鋰鋰水揚酸水揚酸異戊巴比妥異戊巴比妥雙香豆素雙香豆素阿司匹林阿司匹林安替匹林安替匹林保泰松保泰松遺傳和非遺傳因素在藥物代謝中的作用遺傳和非遺傳因素在藥物代謝中的作用新的醫(yī)學模式新的醫(yī)學模式:個體化治療（個體化治療（Personalized Therapy）根據(jù)分子診斷提出治療方案根據(jù)分子診斷提出治療方案診斷診斷分子診斷分子診斷- -預測反應預測反應 治療治療理想反應理想反應藥理學藥理

7、學 + 基因組學基因組學基因是載有特定生物遺傳信息的基因是載有特定生物遺傳信息的DNADNA分子片斷，人類基因包括兩大分子片斷，人類基因包括兩大區(qū)域區(qū)域:1.:1.編碼區(qū)編碼區(qū)( (占占5%);2.5%);2.側翼序列側翼序列 DNADNA分子是由由腺嘌呤（腺嘌呤（A A） 、胞嘧啶、胞嘧啶(C(C）、鳥嘌呤（）、鳥嘌呤（G G）、胸腺嘧啶）、胸腺嘧啶（T T，DNADNA專有）和專有）和尿嘧啶（尿嘧啶（U U，RNARNA專有）堿基排列組成專有）堿基排列組成, ,每個人都存每個人都存在差異，將其稱為多態(tài)性。在差異，將其稱為多態(tài)性。 人類的基因發(fā)現(xiàn)幾百萬由單一的堿基變換而形成的位點既人類的基因

8、發(fā)現(xiàn)幾百萬由單一的堿基變換而形成的位點既SNPSNP，它意，它意味著個人間最小的遺傳差異。味著個人間最小的遺傳差異。 A:腺嘌呤腺嘌呤T:T:胸嘧啶胸嘧啶G:G:鳥嘌呤鳥嘌呤C:C:胞嘧啶胞嘧啶CGTTCTCTATTAACACGTTCTCTATTAACAGCAAGAGATAATTGTGCAAGAGATAATTGTCGTCGTG GCTCTATTAACACTCTATTAACAGCAGCAC CGAGATAATTGTGAGATAATTGT10q24.2Chromosome 10CYP2C9 genen9 Exonn55kbn490 AA10q24.2C CGGT TA ASNPCYP2C9*1No

9、rmal enzymatic activityG A G G A C C G T G T T C A AGluAspArgValGln53CYP2C9*2No enzymatic activityT430CT (Arg144Cys)Cys單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性 （SNP）n導致人類遺傳易感性的重要因素導致人類遺傳易感性的重要因素n導致人類藥物代謝和反應差異的重要因素導致人類藥物代謝和反應差異的重要因素GT突變突變野生型野生型 突變型突變型18變態(tài)反應變態(tài)反應 藥動學藥動學 代謝代謝 吸收、分布、排泄吸收、分布、排泄藥效學藥效學靶向結合作用靶向結合作用免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)毒副作用毒副作用治療作

10、用治療作用藥物耐受藥物耐受藥物代謝酶藥物代謝酶藥物轉運蛋白藥物轉運蛋白 藥物靶蛋白、受體藥物靶蛋白、受體人類白血球抗原人類白血球抗原藥物作用藥物作用基因與藥物作用的關系原理基因與藥物作用的關系原理基基因因 蛋白合成蛋白合成舉例舉例：抗癲癇藥丙戊酸鈉的相關代謝酶抗癲癇藥丙戊酸鈉的相關代謝酶CYP2C19其基因最主要的兩個突變位點其基因最主要的兩個突變位點 CYP2C19*2:第第5外顯子外顯子681位位 GA CYP2C19*3:第第4外顯子外顯子636位位 GA產(chǎn)生終止密碼，過早終產(chǎn)生終止密碼，過早終止蛋白合成，產(chǎn)生無活止蛋白合成，產(chǎn)生無活性性CYP2C19CYP2C19酶，降低對酶，降低對丙

11、戊酸代謝，使其在體丙戊酸代謝，使其在體內蓄積，發(fā)生毒副反應內蓄積，發(fā)生毒副反應.C C A T T G A C.C C A T T G A C.G G T A A C T G.G G T A A C T G.C C A T T G A C.C C G T T G A C.G G T A A C T G.G G C A A C T G.C C G T T G A C.C C G T T G A C.G G C A A C T G.G G C A A C T G.A/A野生型純野生型純合子合子單核苷酸多態(tài)性形成三種基因型和表型單核苷酸多態(tài)性形成三種基因型和表型XXXA/a野生型雜合野生型雜合子子a

12、/a突變純合子突變純合子高活性高活性中活性中活性低活性低活性GCCCGCCCA ACCTCCTC CGCCCGCCCG GCCTCCTC C甲病人甲病人乙病人乙病人Wild typeMutationWild typeWild typeConcentrationMutationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450CYP450CYP450 相同的劑量不同的血漿濃度相同的劑量不同的血漿濃度吸收吸收 - - 慢慢 - - 快快受體受體 - - 缺失缺失 - - 豐富豐富代謝代謝 - - 慢速慢速 - - 中等中等 - - 快速快速 - - 超快速超快速排泄

13、排泄 - - 緩慢緩慢 - - 正常正常藥物體內過程藥物體內過程) )吸收吸收藥物代謝酶藥物代謝酶藥物轉運藥物轉運分布分布藥物轉運藥物轉運代謝代謝藥物代謝藥物代謝酶酶排泄排泄藥物轉運藥物轉運CYP 450CYP 450 主要存在于肝微粒體中, , 它的活性決定藥物的代謝速率, ,與藥物的清除率有著直接關系。CYP 450CYP 450酶系的基因主要有CYP1 ,CYP2 ,CYP3 CYP1 ,CYP2 ,CYP3 三家族, ,有以下幾種重要的P450 P450 酶: CYP 1A2: CYP 1A2、CYP2A6CYP2A6、CYP2C9CYP2C9、CYP2C19CYP2C19、CYP2D

14、6CYP2D6、CYP2E1CYP2E1、CYP3A4CYP3A4。根據(jù)根據(jù)CYP2D6CYP2D6基因型調整抗抑郁藥劑量基因型調整抗抑郁藥劑量38383939米帕明多慮平馬普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕羅西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM182182132132174174808030 0128128818138381741741291299292818113213217917941418181125125989811911915215292921181181381387474757593931151151351359494116116132132707084841101

15、10130130646411511593936060148148170170525238383838% 平均劑量關于CYP2D6的表型判斷舉例：關于舉例：關于CYP2D6的表型判斷，的表型判斷，CYP2D6屬于細胞色素屬于細胞色素P450酶酶常見藥物代謝酶基因型及表型判斷常見藥物代謝酶基因型及表型判斷1 1受體基因突變藥物計量調整受體基因突變藥物計量調整1 1受體野生純合子高敏感性美托洛爾25mg/25mg/次，bidbid100%100%阿替洛爾50mg/50mg/次，qdqd100%100%比索洛爾5mg/5mg/次， qdqd100%100%雜合子中度敏感性美托洛爾25mg/25mg/次

16、，bidbid150%150%阿替洛爾50mg/50mg/次，qdqd150%150%比索洛爾5mg/5mg/次，qdqd150%150%突變純合子低敏感性美托洛爾25mg/25mg/次，bidbid建議改用其他藥物阿替洛爾50mg/50mg/次，qdqd建議改用其他藥物比索洛爾5mg/5mg/次，qdqd建議改用其他藥物26 美托洛爾，美托洛爾， 根據(jù)根據(jù)CYP2D6基因調整劑量基因調整劑量CYP 2D6(Genotype) 美托洛爾劑量調整原則美托洛爾劑量調整原則PM 弱代謝型弱代謝型1.心力衰竭：換藥，用比索洛爾或卡維地洛。心力衰竭：換藥，用比索洛爾或卡維地洛。或減少或減少75%劑量。劑

17、量。2.其他適應癥，警惕不良事件，如心動過緩、四肢冰冷。其他適應癥，警惕不良事件，如心動過緩、四肢冰冷?；驌Q或換藥，用阿替洛爾或比索洛爾藥，用阿替洛爾或比索洛爾。 IM 中間代謝型中間代謝型1.心力衰竭：換藥，用比索洛爾或卡維地洛。心力衰竭：換藥，用比索洛爾或卡維地洛?；驕p少或減少50%劑量。劑量。2.其他適應癥，警惕不良事件，如心動過緩、四肢冰冷。或換其他適應癥，警惕不良事件，如心動過緩、四肢冰冷?；驌Q藥，用阿替洛爾或比索洛爾。藥，用阿替洛爾或比索洛爾。UM 超快代謝型超快代謝型1.心力衰竭：換藥，用比索洛爾或卡維地洛。或在評估療效和心力衰竭：換藥，用比索洛爾或卡維地洛?；蛟谠u估療效和副作用

18、的前提下，副作用的前提下，可將劑量滴定到正常劑量的可將劑量滴定到正常劑量的250%。2.其他適應癥，換藥，其他適應癥，換藥，用阿替洛爾或比索洛爾用阿替洛爾或比索洛爾。或在評估療效。或在評估療效和副作用的前提下，可將劑量滴定到正常劑量的和副作用的前提下，可將劑量滴定到正常劑量的250%。 項目類別檢測基因相關藥物檢測意義高血脂用藥基因檢測 有機陰離子轉運蛋白基因(SLCO1B1)(SLCO1B1)、ABCB1 ABCB1 他汀類降脂藥 基因突變者降低總膽固醇作用顯著減弱。 硝酸甘油用藥基因檢測 ALDH2 ALDH2 硝酸甘油 基因突變導致硝酸甘油難以發(fā)揮有效作用。故基因有缺陷的患者，不能完全把

19、硝酸甘油片當作救命之舉。另外酒精的代謝能另外酒精的代謝能力也與該基因息息力也與該基因息息相關。相關。 高血脂藥物及硝酸甘油高血脂藥物及硝酸甘油項目類別檢測基因相關藥物檢測意義雌激素代謝酶雌激素代謝酶 SULT1A1SULT1A1磺基轉移酶雌醇類藥物 該基因確實導致雌該基因確實導致雌激素在卵巢等靶器激素在卵巢等靶器官暴露值升高造成官暴露值升高造成癌變。癌變。兒童智商基因兒童智商基因 DIO2DIO2 突變兒童應補突變兒童應補充充T4T4基因確實可造成智基因確實可造成智商低下，切商低下，切8 8歲后歲后無法治愈。無法治愈。 雌激素與兒童智商相關基因雌激素與兒童智商相關基因【英國每日郵報網(wǎng)站3 3月

20、2323日報道】科學家發(fā)現(xiàn)了一種會增加兒童智商低下風險的基因。這個發(fā)現(xiàn)意味著，在新生兒出生后不久對其進行一項基因檢測，可能會有助于發(fā)現(xiàn)存在上述問題的嬰兒，甚至為應對這一問題確定治療方案做好準備。 科學家認識到，如果7 7歲以下兒童在體內出現(xiàn)一種常見基因變異體的同時，甲狀腺激素水平也出現(xiàn)下降，那么他們的智商變得異常低下的可能性將為其他兒童的4 4倍。 每年約有4%4%的新生兒帶有這種基因，而且體內的甲狀腺激素水平較低。 給這些兒童服用含有甲狀腺激素的藥片，或許可以幫助其大腦正常發(fā)育并達到正常水平的智商。每年將會有3 3萬名兒童因此受益。 這項新研究的關注重點是與細胞內甲狀腺激素的產(chǎn)生有關的型脫碘

21、酶。 研究人員此前已將這種酶的基因突變與包括糖尿病和高血壓在內的其他健康問題聯(lián)系在一起。 在上述新研究中，加的夫大學和布里斯托爾大學的科學家對31233123名7 7歲以下兒童的基因數(shù)據(jù)進行了分析。這些兒童也接受了智商測試。 體內甲狀腺激素水平較低且存在型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于8585的可能性是其他兒童的4 4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問題的兒童不會面臨更多智商低下的風險。 加的夫大學的皮特泰勒博士說：“如果其他研究證實了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時進行針對這種基因變異體的測試，將有助于識別出今后最有可能變得智商低下的那些兒童?！?相關研究結果是在

22、于利物浦召開的英國內分泌協(xié)會大會上發(fā)布的。 兒童兒童DIO2DIO2基因突變導致智商低下的研究基因突變導致智商低下的研究在上述新研究中，加的夫大學和布里斯托爾大學的科學家對31233123名7 7歲以下兒童的基因數(shù)據(jù)進行了分析。這些兒童也接受了智商測試。 體內甲狀腺激素水平較低且存在型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于8585的可能性是其他兒童的4 4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問題的兒童不會面臨更多智商低下的風險。 加的夫大學的皮特泰勒博士說：“如果其他研究證實了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時進行針對這種基因變異體的測試，將有助于識別出今后最有可能變得智商低下的

23、那些兒童?！?相關研究結果是在于利物浦召開的英國內分泌協(xié)會大會上發(fā)布的。 兒童兒童DIO2DIO2基因突變導致智商低下的研究基因突變導致智商低下的研究本世紀，腫瘤的藥物治療取得了巨大成就。但腫瘤細胞的多藥耐藥性和腫瘤藥物治療的個體差異常造成腫瘤化療的失敗，且引起嚴重的毒副反應。個體藥物治療的藥效和毒性的差異在很大程度上受到遺傳因素如藥物代謝酶、藥物轉運蛋白和藥物作用靶點等藥物相關基因的遺傳多態(tài)性的影響。所以抗惡性腫瘤藥臨床有效率為30-80 %30-80 %腫瘤個體化治療與腫瘤個體化治療與基因檢測基因檢測 根據(jù)病人的遺傳特征, ,選擇最有效的疾病治療方法，更好地控制疾病的進展甚至預防疾病的發(fā)生

24、，實現(xiàn)最佳的醫(yī)學治療效果。 在合適的時間(Right Time)(Right Time)給合適的病人(Right Patient)(Right Patient)施行合適的治療(Right (Right Treatment),Treatment),達到腫瘤個體化治療腫瘤個體化治療與腫瘤個體化治療與基因檢測基因檢測 腫瘤個體化治療包括靶向治療和化療兩部分: : 靶向治療: :通過實時定量、基因測序、FISHFISH等技術檢測腫瘤患者基因拷貝及基因突變信息，根據(jù)檢測結果進行靶向治療。 個體化化療：通過實時定量、基因分型、mRNAmRNA定量等技術，檢測患者腫瘤標本或血液標本的mRNAmRNA表達、D

25、NADNA的SNPSNP分型，確定患者對化療藥物的敏感性和毒性反應并確定化療劑量。腫瘤個體化治療與腫瘤個體化治療與基因檢測基因檢測類型藥物檢測基因相關病癥適用樣本判斷標準基因多基因多態(tài)性檢態(tài)性檢測測卡鉑（碳鉑、卡波鉑）順鉑（順氯氨鉑，順式鉑）奧沙利鉑（樂沙定、奧正南、草鉑等）ABCB1XRCC1GSTP1非小細胞肺癌小細胞肺癌乳腺癌結直腸癌肝癌卵巢癌等石蠟、手術/穿刺樣本、全血（抗凝）等AA基因型，出現(xiàn)毒副作用的風險最高，生存率降低，其次是AG型；GG型毒副作用風險最低，生存率較高。氟尿嘧啶GSTP1非小細胞肺癌小細胞肺癌乳腺癌卵巢癌等AA基因型，毒性風險最高，其次是AG型，GG型毒性風險最低

26、。伊立替康伊立替康UGT1A1*28非小細胞肺癌等TA7突變者毒副作用增加，建議降低用藥量；劑量250mg/m2 時，起始劑量減少30%。腫瘤細胞基因表達與化療藥物腫瘤細胞基因表達與化療藥物類型藥物檢測基因基因相關病癥適用樣本判斷標準基因多態(tài)性檢測阿那曲唑（艾達、瑞斯意、瑞婷、瑞寧得）/來曲唑（芙瑞）CYP19A1乳腺癌等全血、血漿、血清、石蠟、手術/穿刺樣本等突變用藥顯著（純合/雜合）伊立替康（開普拓）UGT1大腸癌等野生型純合子用藥顯著SLCOIB1氟尿嘧啶氟尿嘧啶DPYD直腸直腸癌等野生純合子用藥顯著5FU藥物（5氟尿嘧啶等）ABCB1胃腸道乳腺癌等突變純合用藥顯著乳腺癌胃癌腸癌等野生純

27、合用藥顯著順鉑（順氯氨鉑，順式鉑）奧沙利鉑（樂沙定、奧正南、草鉑等）ABCB1肺癌胃癌腸癌等野生純合用藥顯著突變用藥顯著（純合/雜合）突變用藥顯著（純合/雜合）突變基因與化療藥物突變基因與化療藥物腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測項目類別檢測基因相關藥物檢測意義腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測GSTM1GSTM1、GSTP1GSTP1、MTHFRMTHFR、XRCC1XRCC1、XPDXPD、XPGXPG、ERCC1ERCC1、TPMTTPMT、CYP 2E1CYP 2E1、CYP2C9CYP2C9、ABCB1ABCB1鉑類藥物：順氯氨鉑( (順鉑) )；草酸鉑；奧沙利

28、鉑等、紫杉醇、5-5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤、6-6-硫鳥嘌呤（6-TG6-TG），6-6-巰基嘌呤（6-MP6-MP）、硫唑嘌呤（AZAAZA）、環(huán)磷酰胺、長春堿、FK506FK506、依托泊苷1. GSTM11. GSTM1突變型在紫杉醇和順氯氨鉑治療后有較好的生存時間，降低急性粒系白血病治療時的復發(fā)。 2. GSTP12. GSTP1突變型有利患者在化療中的生存。3. MTHFR3. MTHFR突變的白血病患兒對于MTXMTX的毒副反應發(fā)生風險為未突變者的11.311.3倍。4. XRCC14. XRCC1突變型對5-5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑不敏感。5. XPG5. XPG突變者用草酸鉑，客觀

29、緩解率低。6. ERCC16. ERCC1突變型對含有鉑類藥物化療的敏感性高。原 位 雜 交 技 術 2014-03-19原 位 雜 交 技 術原位雜交技術的歷史發(fā)展二原位雜交技術的原理及分類三原位雜交技術的一般過程四原位雜交技術的應用一、原位雜交技術的歷史發(fā)展 原位雜交技術原位雜交技術(In situ hybridization(In situ hybridization，ISH)ISH)是分子生物學、是分子生物學、組織化學及細胞學相結合而產(chǎn)生的一門新興技術，始于組織化學及細胞學相結合而產(chǎn)生的一門新興技術，始于2020世紀世紀6060年代。年代。19691969年美國耶魯大學的年美國耶魯大學

30、的GallGall等首先用爪蟾核糖體基因等首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，將該基因進行定位，與此同時探針與其卵母細胞雜交，將該基因進行定位，與此同時 BuongiornoNardelliBuongiornoNardelli和和AmaldiAmaldi等等(1970)(1970)相繼利用同位素標記相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發(fā)展，特別是技術。自此以后，由于分子生物學技術的迅猛發(fā)展，特別是2020世紀世紀7070年代末到年代末到8080年代初，分子克隆

31、、質粒和噬菌體年代初，分子克隆、質粒和噬菌體DNADNA的構的構建成功，為原位雜交技術的發(fā)展奠定了深厚的技術基礎。建成功，為原位雜交技術的發(fā)展奠定了深厚的技術基礎。 二、原位雜交技術的原理及分類 概念： 原位雜交技術(In situ hybridization，ISH)是用標記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織，細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段。原理：利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即 探針)與組織、細胞或染色體上待測 DNA或 RNA互補配對，結合成專一 的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段 將待測核酸在組織、細胞或

32、染色體上 的位置顯示出來。原位雜交法分類1、 基因組原位雜交技術基因組原位雜交技術基因組原位雜交基因組原位雜交(GISH)(GISH)技術是技術是2020世紀世紀8080年代末發(fā)展起來的一種原位雜交技術。它主要是利年代末發(fā)展起來的一種原位雜交技術。它主要是利用物種之間用物種之間DNADNA同源性的差異，用另一物種的基因組同源性的差異，用另一物種的基因組DNADNA以適當?shù)臐舛茸鞣庾?，在靶染色體以適當?shù)臐舛茸鞣庾?，在靶染色體上進行原位雜交。上進行原位雜交。 2 2、熒光原位雜交技術、熒光原位雜交技術熒光原位雜交熒光原位雜交(FISH)(FISH)技術是在已有的放射性技術是在已有的放射性 原位雜交

33、技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放 射性射性DNADNA分子原位雜交技術。它利用熒光標記分子原位雜交技術。它利用熒光標記 的核酸片段為探針，與染色體上或的核酸片段為探針，與染色體上或DNADNA顯微切顯微切 片上的特異性雜交，通過熒光檢測系片上的特異性雜交，通過熒光檢測系 統(tǒng)統(tǒng)( (熒光顯微鏡熒光顯微鏡) )檢測信號檢測信號DNADNA序列在染色體或序列在染色體或 DNA DNA顯微切片上的目的顯微切片上的目的DNADNA序列，進而確定其雜序列，進而確定其雜 交位點。交位點。3 、多彩色熒光原位雜交技術多彩色熒光原位雜交技術多彩色熒光原位雜交(mFISH)是在

34、熒 光原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的 一種新技術，它用幾種不同顏色的熒 光素單獨或混合標記的探針進行原位 雜交，能同時檢測多個靶位，各靶位 在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同， 呈現(xiàn)多種色彩。4、原位原位PCRPCR原位PCR技術是常規(guī)的原位雜交技術與PCR技術的有機結合，即通過PCR技術對靶核酸序列在染色體上或組織細胞內進行原位擴增使其拷貝數(shù)增加，然后通過原位雜交技術進行檢測，從而對靶核酸序列進行定性、定位和定量分析。原位雜交法分類三、原位雜交技術的一般過程以經(jīng)過標記的已知核酸分子為探針以細胞內與探針序列互補的特異核酸分子為靶分子在一定條件下使探針與靶核酸分子在原位發(fā)生雜交再對其探測探針探針標

35、記標記靶核酸靶核酸分子分子雜交雜交檢測檢測一）、探針 是含有互補順序的外源性被標記的DNA或RNA片段，是在原位雜交中用于檢測細胞內特定DNA或RNA順序定位的特殊試劑，探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結合上1、cDNA2、RNA 3、寡核苷酸 1、cDNA (complementary DNA)互補于mRNA的DNA分子（長度為數(shù)百-數(shù)千堿基對） 克隆于質粒中，可以無限繁殖，取之不盡 較穩(wěn)定，不易被降解 標記方法可靠易行優(yōu)點優(yōu)點： 雜交效率比DNA探針高 在檢測mRNA時所形成的RNA-mRNA雜交體 比DNA-mRNA雜交體穩(wěn)定 可以同時得到同義RNA鏈和反義RNA鏈 缺點：

36、2、RNA RNA是單鏈分子（探針長度50-300堿基對） 這類探針是根據(jù)靶分子而設計序列 在DNA合成儀上用化學方法合成 優(yōu)點：形成雜交體快速 （序列短鏈，雜交時易于穿透） 缺點：特異性較低（短鏈和簡單） 短鏈探針 (長度10-50個核苷酸) 3、寡核苷酸 二）、探針標記1、標記物 （1）放射性標記物 （2）非放射性標記物2、標記方法 （1）DNA探針標記 （2）RNA探針標記 （3）寡核苷酸探針標記 1、標記物高度靈敏性；高度靈敏性；標記物與核酸探針結合，應絕對不能影響核酸探針與標記物與核酸探針結合，應絕對不能影響核酸探針與模板的結合能力及結合的特異性；模板的結合能力及結合的特異性；當用酶

37、促方法進行標記時，應對酶促活性（當用酶促方法進行標記時，應對酶促活性（KmKm值）無值）無多大影響，以保證標記反應的效率和標記產(chǎn)物的比活性多大影響，以保證標記反應的效率和標記產(chǎn)物的比活性；高度特異性；高度特異性；較高的化學穩(wěn)定性，保存時間長，標記及檢測方法簡較高的化學穩(wěn)定性，保存時間長，標記及檢測方法簡單；單；對環(huán)境無污染，對人體無損傷；對環(huán)境無污染，對人體無損傷；價格低廉等。價格低廉等。標記物分類放射性標記物：同位素 5 5S S、3333P P、3232P P 和和 3 3H H等等非放射性標記物：熒光素熒光素 生物素生物素 地高辛地高辛 溴脫氧尿嘧啶等溴脫氧尿嘧啶等某種單核苷酸某種單核苷

38、酸 在單核苷酸分子中導入某個原子、在單核苷酸分子中導入某個原子、 功能基團或側鏈分子作為標記物，功能基團或側鏈分子作為標記物， 對堿基配對不造成影響對堿基配對不造成影響 35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP32P-dATP等等等等四甲基羅達明-UTP 生物素-UTP (Bio-UTP) 地高辛-dUTP (Dig-dUTP) 溴脫氧尿嘧啶本身為標記分子2、標記方法（1）DNADNA探針標記探針標記 切口移位法切口移位法 隨機引物法隨機引物法（2）RNARNA探針標記探針標記在體外轉錄技術中與探針制備同時完成在體外轉錄技術中與探針制備同時完成（3）寡核苷酸探針標記寡

39、核苷酸探針標記末端轉移法末端轉移法切口平移法隨機引物法 三）、靶核酸分子或靶序列）：或靶序列）： 指所要探測的核酸分子或核苷酸序列指所要探測的核酸分子或核苷酸序列 （DNA 或或RNA）可以是中期染色體上的或是間期細可以是中期染色體上的或是間期細 胞核內的，也可以是線粒體胞核內的，也可以是線粒體DNA或或 病毒病毒DNA可以是編碼細胞合成的任何蛋白質分子可以是編碼細胞合成的任何蛋白質分子 的的mRNA，也可以是核糖體，也可以是核糖體rRNA 線粒體或病毒線粒體或病毒RNA 四）、雜交1、雜交體 hybrids DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子2、雜交條件（1 1）雜交液）雜交液 （2 2

40、）探針濃度（）探針濃度（3 3）溫度（）溫度（4 4）pH pH （5 5）時間）時間（1 1）、雜交液）、雜交液 鈉鹽（雜交效率鈉鹽（雜交效率 非特異反應非特異反應） 甲酰胺（使雜交所需溫度降低裂解紅細胞）甲酰胺（使雜交所需溫度降低裂解紅細胞） 硫酸葡聚糖（提高探針濃度）硫酸葡聚糖（提高探針濃度） 牛血清白蛋白和載體牛血清白蛋白和載體DNADNA等等 （阻斷探針與組織非特異結合，（阻斷探針與組織非特異結合， 背景）背景）雜交條件（2）、探針濃度探針濃度影響雜交反應的速度 放射性標記探針0.5g/ml 非放射性為2g/ml 最適宜的探針濃度要經(jīng)實驗摸索得到確定（1 1）雜交液）雜交液 （2 2）探針濃度（）探針濃度（3 3）溫度（）溫度（4 4）pH pH （5 5）時間）時間雜交條件（3）、溫度雜交時溫度一般低于相應雜交體的雜交時溫度一般低于相應雜交體的TmTm值值2525TmTm值：是核酸的融解溫度，是一半雙鏈分子解鏈時的溫度）值：是核酸的融解溫度，是一半雙鏈分子解鏈時的溫度） 當雜交液含當雜交液含50%50%甲酰胺、鹽濃度甲酰胺、鹽濃度0.75mol/L0.75mol/L左右時左右時 雜交溫度：雜交溫度： 對對DNADNA探針是探針是4242 對對RNARNA探針是探針是50-5