PCR儀原理及其應(yīng)用

1、pcr儀原理及其應(yīng)用 pcr儀的原理及其操作應(yīng)用 1. pcr儀的技術(shù)原理 2. pcr儀的分類與應(yīng)用 3. pcr儀的操作步驟輕紡與食品學(xué)院 報(bào)告人：裴樂樂 指導(dǎo)老師：林教授 1.pcr原理簡介pcr(polymerase chain reaction)即聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，主要用于dna片段的體外 擴(kuò)增，基本原理類似于dna的自然復(fù)制過 程 ，其特異性依靠于與靶序列兩端互補(bǔ)的 寡核苷酸引物。pcr由變性-退火-延長三 個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。 pcr原理示意圖 pcr cycle - step 1 - denaturation template dna by heat (94oc)target

2、sequence target sequence 模板dna的變性：模板dna經(jīng)加熱至94左右肯定時 間后，使模板dna雙鏈或經(jīng)pcr擴(kuò)增形成的雙鏈dna解 離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn) 備； pcr cycle - step 2 temperature is lowered (tm ) and primers anneal to target sequences 模板dna與引物的退火(復(fù)性):模板dna經(jīng)加熱變性成單 鏈后，溫度降至55左右，引物與模板dna單鏈的互補(bǔ)序列 配對結(jié)合； pcr cycle - step 3 - at 72 o c taq dna pol

3、ymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated引物的延長： dna模板-引物 結(jié)合物在 taqdna聚合酶 的作用下，以 dntp為反應(yīng)原 料，靶序列為模 板，按堿基配對 與半保留復(fù)制原 理，合成一條新 的dna 鏈。 end of the 1st pcr cycle results in two copies of target sequence每完成一 個循環(huán)需 24分鐘， 23小時 就能將待 擴(kuò)目的基 因擴(kuò)增放 大幾百萬 倍。 target amplificationno.

4、of1 cycle = 2 amplicon no. amplicon copies of target cycles 2 cycle = 4 amplicon 1 2 3 4 5 2 4 8 16 32 64 1,048,576 3 cycle = 8 amplicon 4 cycle = 16 amplicon 5 cycle = 32 amplicon 6 cycle = 64 amplicon6 20 7 cycle = 128 amplicon 30 1,073,741,824 2.pcr儀的分類與應(yīng)用 一般pcr儀：一次pcr擴(kuò)增只能運(yùn)行一個特定退 火溫度的pcr儀，假如要做不同的

5、退火溫度需要 多次運(yùn)行。 梯度pcr儀：一次性pcr擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不 同的退火溫度條件(溫度梯度),由于被擴(kuò)增的 不同dna片段，其最適退火溫度不同，通過設(shè)置 一系列的梯度退火溫度迚行擴(kuò)增，從而一次性 pcr擴(kuò)增，就可以篩選出表達(dá)量高的最適退火溫 度，迚行有效的擴(kuò)增。主要用于討論未知dna退 火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)省成本的同時也節(jié)省了時 間。 原位pcr儀：用于從細(xì)胞內(nèi)靶dna的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基 因擴(kuò)增儀，如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi) 的作用位置等。是保持細(xì)胞或組織的完整性，使pcr反應(yīng) 體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶dna所在的位置上 迚行基因擴(kuò)增。 實(shí)時熒光定量pcr儀

6、：在一般pcr儀的基礎(chǔ)上增加一個熒 光信號采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 pcr儀。其pcr擴(kuò)增 原理和一般pcr儀擴(kuò)增原理相同，只 是pcr擴(kuò)增時加入的引物是利用同位素、熒光素等迚行標(biāo) 記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò) 增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實(shí)時采集信號連接輸送到 計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時結(jié)果輸出。 四種pcr儀示意圖 一般pcr 梯度pcr 原位pcr 熒光定量pcr 3. pcr的操作步驟 1.配置反應(yīng)體系：引物、模板、buffer,dntps, 酶，mg2+,(假如是熒光定量pcr,則還有染料或 探針)。 2.在pcr儀上設(shè)置程序：一般是9

7、4變性5min使 模板充分變性,之后“94變性、退火(不同引物 溫度不同)、72延長”共30-35個循環(huán)，再72 延長10min, 使產(chǎn)物延長完整，設(shè)置完程序后啟 動機(jī)器運(yùn)行。 3.假如是常規(guī)pcr,則后面還有電泳試驗(yàn)，假如 是熒光定量pcr則可以實(shí)時觀看試驗(yàn)過程。 pcr反應(yīng) pcr反應(yīng)條件 pcr過程 pcr的特點(diǎn) pcr反應(yīng)高溫變性 低溫退火 適溫延長 溫 度 72 () pcr反應(yīng)條件 pcr過程 pcr的特點(diǎn) 1 2 3 94 重復(fù)13步 2530輪 目的dna片段 擴(kuò)增100萬倍以上 形 成 dna 2 55 22 條變 單性 鏈 子鏈延長 dna加倍 dna單鏈 與引物復(fù)性 dn

8、a雙螺旋 1 2 3時間(min) 4 5 95 模板dna pcr的基本原理 pcr反應(yīng)條件 pcr過程 pcr的特點(diǎn) 50 引物1 dna引物 引物2 pcr的基本原理taq酶 pcr反應(yīng)條件 pcr過程 pcr的特點(diǎn) 72 引物1 dna引物 引物2taq酶 pcr的基本原理 pcr反應(yīng)條件 pcr過程 pcr的特點(diǎn) 72 第1輪結(jié)束 第2輪開頭 pcr的基本原理 taq pcr反應(yīng)條件 pcr過程 pcr的特點(diǎn) 95 taq 50taq 72taq pcr的基本原理 pcr反應(yīng)條件 pcr過程 pcr的特點(diǎn) 72 第2輪結(jié)束 模板dna pcr的基本原理 第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增 pcr反應(yīng)條件 第3輪擴(kuò)增 pcr過程 pcr的特點(diǎn) 抱負(fù)拷貝數(shù)=2nn 循環(huán)次數(shù) 重復(fù)30輪后 第4輪擴(kuò)增 第5輪擴(kuò)增 第6輪擴(kuò)增 30=1,073,741,824 2 實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n x 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 最近自己做的pcr擴(kuò)增試驗(yàn)1.提取樣品中酵母菌的dna 2.配置好體系后用