蛋白質(zhì)及氨基酸分析

1、3.5 蛋白質(zhì)及氨基酸分析蛋白質(zhì)及氨基酸分析一、 概述 蛋白質(zhì)是一類存在于所有細(xì)胞中含量豐富的成分，除了儲(chǔ)備蛋白質(zhì)外，幾乎所有的蛋白質(zhì)對(duì)生物功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)都非常重要。 食品中的蛋白質(zhì)種類非常復(fù)雜，其中很多已經(jīng)被純化和定性。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的變化范圍通常為50001000000u，它們包括氫、碳、氮、氧和硫等元素，20種常見-氨基酸是蛋白質(zhì)的主要構(gòu)成。 蛋白質(zhì)可以按照它的成分、結(jié)構(gòu)、生物功能或者溶解特性來分類。如水解簡單蛋白質(zhì)只得到氨基酸，但結(jié)合類蛋白質(zhì)還含有非氨基酸成分。 蛋白質(zhì)有非常獨(dú)特的構(gòu)型，它可被各種變性因素，如熱、酸、堿、8molL尿素、6mol/L鹽酸胍、有機(jī)溶劑和去垢劑所改變，其溶解

2、性及功能性也可被變性劑所改變。 1.蛋白質(zhì)分析的重要性蛋白質(zhì)分析的重要性 (1)生物活性測定 一些蛋白質(zhì)包括酶或酶抑制因子和食品科學(xué)與營養(yǎng)有關(guān)，例如肉類嫩化中的蛋白酶、水果成熟中的果膠酶以及豆類中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白質(zhì)。 (2)功能性質(zhì)調(diào)查 不同種類食品中的蛋白質(zhì)都有其獨(dú)特的食品功能性質(zhì)，例如小麥面粉中的麥醇溶蛋白和麥谷蛋白具有成面團(tuán)性，牛乳中的酪蛋白在干酪制作中具有凝結(jié)作用，而雞蛋卵清蛋白具有起泡能力。 (3)營養(yǎng)標(biāo)簽 總蛋白質(zhì)含量； 氨基酸組成； 混合物中的特定蛋白質(zhì)的含量； 蛋白質(zhì)分離純化過程中的蛋白質(zhì)含量； 非蛋白氮； 蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值(消化率、蛋白質(zhì)功效比或 氮平衡)。 2.食

3、品中的蛋白質(zhì)含量食品中的蛋白質(zhì)含量 在各種不同的食品中蛋白質(zhì)的含量各不相同，一般說來動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉中為9.5%，兔肉為21%，雞肉為20%，牛乳為3.5%，黃魚為17.0%，帶魚為18.0%，大豆為40%，稻米為8.5%，面粉為9.9%，菠菜為2.4%，黃瓜為1.0%，桃為0.8%，柑橘為0.9%，蘋果為0.4%和油菜為1.5%左右。 測定食品中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極重要的意義。 3.蛋白質(zhì)水解 4.蛋白質(zhì)測定方法蛋白質(zhì)測定方法

4、測定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類： 一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量 、肽鍵和折射率測定蛋白質(zhì)含量 ； 另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團(tuán)以及芳香基團(tuán)等測定蛋白質(zhì)含量。 二、蛋白質(zhì)的含量測定- 凱氏定氮法 凱氏定氮法是測定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測定多個(gè)樣品，故國內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，至今仍 被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 (1) 原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)

5、準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。，將有機(jī)物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。 蒸餾蒸餾在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應(yīng)方程式如下：a：加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k5.810-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反應(yīng)方程式如下： (2)(2)適用

6、范圍適用范圍：此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定 (3)(3)儀器儀器:500ml凱氏燒瓶；定氮蒸餾裝置 (4)(4)試劑試劑:硫酸銅； 硫酸鉀； 硫酸； 40gL硼酸溶液； 混合指示劑； 400gL氫氧化鈉；0.1molL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 (5) 操作步驟： 樣品消化：樣品消化：準(zhǔn)確稱取均勻的固體樣品0.53g,或半固體樣品25g,或吸取溶液樣品1525ml。小心移入干燥的凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.51g硫酸銅、10g硫酸鉀及25ml濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口置一小漏斗，瓶頸45角傾斜置電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化（若無通風(fēng)櫥可于瓶口倒插入一口徑適宜的干燥管，用膠管與水力真空管相連接

7、，利用水力抽除消化過程所產(chǎn)生的煙氣）。先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈藍(lán)綠色。取下漏斗，繼續(xù)加熱0.5h，冷卻至室溫。 滴定滴定：將接受瓶內(nèi)的硼酸液用將接受瓶內(nèi)的硼酸液用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。相同）。 (6) 結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算三、蛋白質(zhì)的快速測定法三、蛋白質(zhì)的快速測定法-雙縮脲法雙縮脲法 1.原理：脲（尿素）脲（尿素）NH2CONH2加熱至加熱至150160時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。 雙縮脲能

8、和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色絡(luò)和物，此反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲絡(luò)和物，此反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）反應(yīng)） 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵（蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵（ CONH），），與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測其白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測其吸光度，確定含量。（吸光度，確定含量。（560nm） 2.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、

9、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。 3.主要儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000 r/min） 4.試劑： (1) 堿性硫酸銅溶液 甘油作為穩(wěn)定劑：取10ml10mol/L KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈攪拌，同時(shí)慢慢加入50ml4%CuSO4。 酒石酸鈉作穩(wěn)定劑：吸10ml10mol/L KOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中，激烈攪拌，同時(shí)慢慢加入4%CuSO4液40ml。 配制以上兩種溶液、試劑，必須澄清，無氫氧化銅生成，否則重配。 (2) 四氯化碳 5.操作方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱0.6g樣品使用試劑 準(zhǔn)確稱0.5g樣品使用試劑 假如用試劑

10、（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 按凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量的樣品為標(biāo)樣，根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)含量，取離心澄清液0.0，2.0，4.0，8.0，10.0ml于10ml容量瓶中分別加水定容，在560nm波長下測定其吸光度。 以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以上述吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （2）準(zhǔn)確稱樣0.5g于80ml離心管加1mlClC4混合加50ml酒石酸鉀鈉穩(wěn)定劑蓋上蓋子離心10min（4000轉(zhuǎn)/分）放置1小時(shí)吸混合液15ml于20ml離心管中離心到完全透明取上清夜5ml于10ml容量瓶加水定容于560nm處測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白質(zhì)含量。 6 計(jì)算： 蛋白質(zhì)%=（C/W）100 C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得

11、蛋白質(zhì)含（mg） W-測定樣液時(shí)相當(dāng)于樣品重量（mg） 7.雙縮脲法優(yōu)點(diǎn) 該方法比凱氏定氮法費(fèi)用低，速度快(可在不到30min的時(shí)間內(nèi)完成)，是分析蛋白質(zhì)最簡單的方法； 比福林酚法、紫外吸收法或比濁法更少發(fā)生顏色偏離； 幾乎沒有物質(zhì)干擾食品中蛋白質(zhì)的雙縮脲反應(yīng)； 不需要測定非多肽或非蛋白質(zhì)來源的氮。 8.缺點(diǎn) 不如福林酚法靈敏，分析時(shí)至少需要24mg蛋白質(zhì)； 如果存在膽汁素，則吸光度會(huì)虛假增加； 高濃度的胺鹽會(huì)干擾反應(yīng)； 不同蛋白質(zhì)其最終反應(yīng)產(chǎn)物的顏色不同，如明膠的雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色； 如果有高濃度的脂或碳水化合物存在時(shí)，最終的反應(yīng)溶液中可能會(huì)呈乳白色； 此方法不是一個(gè)測量絕對(duì)值的方法，必須

12、用已知濃度的蛋白質(zhì)(如BSA)或經(jīng)凱氏定氮法校正。其他測定方法 考馬斯亮藍(lán)G250染色比色法（Bradford法) 福林-酚比色法（洛里法）四、氨基酸總量測定氨基酸總量測定 隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營養(yǎng)知識(shí)的普及，食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的構(gòu)成，愈來愈得到人們的重視。為提高蛋白質(zhì)的生理效價(jià)而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的理論，對(duì)食品加工工藝的改革，對(duì)保健食品的開發(fā)及合理配膳等工作都具有積極的指導(dǎo)作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。 氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸（儀器價(jià)格昂貴，不能普遍使用），對(duì)于食品來說有時(shí)有很多

13、種氨基酸可以同時(shí)存在于一種食品中，所以需要測定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸態(tài)氮）的百分率表示，當(dāng)然，如果食品中只含有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含氮量計(jì)算出氨基酸的含量。 （一）雙指示劑甲醛滴定法（一）雙指示劑甲醛滴定法 1. 原理：氨基酸本身有堿性 NH2 基，又有酸性 COOH 基，它們相互作用而生成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與 NH2 結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定 COOH 基。 2特點(diǎn)：此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǚ治鼋Y(jié)果相近。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情

14、況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。（適于食品中游離氨基酸的測定） 3雙指示劑： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用 氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液，（9.410.6） 0.1%中性紅50%乙醇溶液，（6.88.0） 0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。 4操作： 取相同兩份樣品2030mg分別于250ml三角瓶各加50ml蒸餾水一份加中性紅3滴用0.1mol/L NaOH滴定終點(diǎn)（由紅變琥珀色），記錄用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml搖勻用0.1mol/L NaOH 滴至淡蘭色。分別記錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。 5.計(jì)算： 氨基酸態(tài)氮

15、= c（V2-V1）0.014100） /W100 V1用中性紅為指示劑時(shí)，堿液所消耗的體積 V2用百里酚酞乙醇液為指示劑時(shí)標(biāo)液消耗量 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。 （二）茚三酮的比色法（二）茚三酮的比色法 1. 原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng)，原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng)， 生成藍(lán)紫色化合物，可比色定量。（生成藍(lán)紫色化合物，可比色定量。（570nm） 2. 試劑：試劑： （1）磷酸緩沖液（）磷酸緩沖液（pH.8.04）制備方法如下：）制備方法如下： 稱磷酸二氫鉀稱磷酸二氫鉀4.5350g。溶解定容至。溶解定容至500ml 稱稱NaH2PO412H2O 11.93

16、80g，溶解定容至，溶解定容至500ml 取上述配好的磷酸二氫鉀取上述配好的磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉與磷酸氫二鈉190ml混合即為混合即為pH8.04的緩沖液。的緩沖液。 （2）2%茚三酮溶液： 稱茚三酮1g溶于35ml熱水加入40mg氯化亞錫（SnCl2H2O）攪拌過濾（作防腐劑）于冷暗處過夜定容50ml （3）氨基酸標(biāo)液 稱干燥氨基酸（如異亮氨酸）0.2000g溶解定容100ml搖勻吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200g/ml標(biāo)液 3 操作方法： （1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線： 取7個(gè)25ml容量瓶，吸取標(biāo)液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于7個(gè)25

17、ml容量瓶，加水補(bǔ)充至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置15分鐘，在570nm下測消光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （2）樣品測定： 取樣品5.0010.0g（液體樣5-10ml）于燒杯中加50ml水和活性碳約5g加熱過濾用3040ml熱水洗滌活性炭吸澄清樣液14ml加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測定消光值，按下式計(jì)算氨基酸含量。 4 4 計(jì)算計(jì)算 氨基酸含量（毫克氨基酸含量（毫克/100/100克）克）=C=C100/100/（m m10001000） C C從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得氨基酸的量從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查

18、得得氨基酸的量（g g） m m 測定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量測定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量（g g） 5 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進(jìn)行易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進(jìn)行純化，方法如下：取純化，方法如下：取10g10g茚三酮容于茚三酮容于40ml40ml熱熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置水中，加一克活性炭，搖勻靜置3030分鐘，分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中過濾，即出現(xiàn)蘭過濾，將濾液放入冰箱中過濾，即出現(xiàn)蘭色結(jié)晶，過濾，用色結(jié)晶，過濾，用2ml2ml冷水洗滌結(jié)晶，置干冷水洗滌結(jié)晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。燥皿中干燥，裝瓶備用。 （三）氨基酸自動(dòng)分析儀 樣品處理：稱取試樣0.2 g 于10 mL具塞試管中，加入6 mol / L鹽酸10 mL，氮吹儀吹氮?dú)?5分鐘后，試管塞處墊以可拉伸生物薄膜后旋緊塞子，封管，110 烘箱水解24 h。水解后冷卻至室溫，將水解液過濾到50 mL小容量瓶中，水解管用去離子水洗滌三次，洗滌液過濾到容