基因轉(zhuǎn)移基因治療

1、 基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移與與 基因治療基因治療復(fù)旦大學(xué)復(fù)旦大學(xué) 遺傳學(xué)研究所遺傳學(xué)研究所薛京倫薛京倫20032003，10 10基因：染色體上的基因：染色體上的dna片段，是片段，是遺傳信息結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。遺傳信息結(jié)構(gòu)和功能的基本單位?；蚧?決定決定 生老病死生老病死 控制控制 高矮胖瘦高矮胖瘦 影響影響 喜怒哀樂喜怒哀樂基因組：某一生物的細(xì)胞中所帶有基因組：某一生物的細(xì)胞中所帶有的全部遺傳信息。的全部遺傳信息。一、基因治療概念一、基因治療概念 基因治療基因治療(gene therapy) (gene therapy) 指將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕笇⒄；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式

2、導(dǎo)入靶細(xì)胞因通過一定方式導(dǎo)入靶細(xì)胞, ,糾正糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)。學(xué)高技術(shù)。understanding of the disease process structure/function of gene to be introduced efficient delivery of gene control of gene expression prevention/control of immune responsesanimal model and assessment of functi

3、on clinical trial體細(xì)胞基因治療體細(xì)胞基因治療將基因作為一種特殊將基因作為一種特殊“藥物藥物”，通過，通過體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移治療疾病體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移治療疾病 慢性治療慢性治療急性治療急性治療預(yù)防預(yù)防遺傳性疾病遺傳性疾病獲得性疾病獲得性疾病功能喪失功能喪失功能獲得功能獲得二、基因治療和傳統(tǒng)的基因工程的區(qū)別二、基因治療和傳統(tǒng)的基因工程的區(qū)別二者都著眼于尋找可治病或有其他應(yīng)二者都著眼于尋找可治病或有其他應(yīng)用價(jià)值的用價(jià)值的“目的基因目的基因”。 基因工程：基因工程： 目的基因目的基因載體載體導(dǎo)入大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外表達(dá)所需要的蛋白體外表達(dá)所需要的蛋

4、白經(jīng)過分離經(jīng)過分離純化獲得能用于治療或其他用途的蛋白純化獲得能用于治療或其他用途的蛋白純品純品, 最終是制造出一種蛋白類的藥物。最終是制造出一種蛋白類的藥物。 基因治療基因治療目的基因目的基因載載體體導(dǎo)入人體，目的基因在人體內(nèi)導(dǎo)入人體，目的基因在人體內(nèi)的細(xì)胞中制造所需要的蛋白的細(xì)胞中制造所需要的蛋白達(dá)到達(dá)到治病的目的。治病的目的。 基因治療在技術(shù)上一旦成功基因治療在技術(shù)上一旦成功, 其優(yōu)其優(yōu)勢(shì)：勢(shì)：制品為基因及其載體，非基因制品為基因及其載體，非基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物表達(dá)蛋白產(chǎn)物,不需復(fù)雜的蛋白產(chǎn)物分不需復(fù)雜的蛋白產(chǎn)物分離和純化工藝離和純化工藝生產(chǎn)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于基生產(chǎn)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于基因工程產(chǎn)品因工程產(chǎn)品

5、從理論上講從理論上講,凡能治病的凡能治病的基因，都有可能開發(fā)成為基因，都有可能開發(fā)成為“藥物藥物” 半衰期半衰期 但基因治療難度高，技術(shù)要求極為但基因治療難度高，技術(shù)要求極為苛刻。例如，針對(duì)各種疾病，必須具有苛刻。例如，針對(duì)各種疾病，必須具有能夠達(dá)到治病目的的基因。在此基礎(chǔ)上，能夠達(dá)到治病目的的基因。在此基礎(chǔ)上，還必須具有能有效地將基因?qū)肴梭w的還必須具有能有效地將基因?qū)肴梭w的載體系統(tǒng)，這種系統(tǒng)要求高效，而且能載體系統(tǒng)，這種系統(tǒng)要求高效，而且能定向地導(dǎo)入人體某種細(xì)胞?；?qū)肴硕ㄏ虻貙?dǎo)入人體某種細(xì)胞。基因?qū)肴梭w后，必須能夠控制它的表達(dá)。體后，必須能夠控制它的表達(dá)。 因此，基因治療是生物高技

6、術(shù)的高因此，基因治療是生物高技術(shù)的高度集成，是遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞度集成，是遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子病毒學(xué)等多種學(xué)科知識(shí)和生物學(xué)、分子病毒學(xué)等多種學(xué)科知識(shí)和技術(shù)的高度綜合。技術(shù)的高度綜合。gene replacementgene augmentation therapy (gat)gene correction (chimeraplasty)targeted killing of specific cellstargeted inhibition of gene expression (gene ablation)gene correction - chimeraplastyt

7、umour celltkthymidine kinasegeneviral vectorganciclovirganciclovir phosphatetargeted killing genetic pro-drug activation therapy四、基因轉(zhuǎn)移的主要方法：四、基因轉(zhuǎn)移的主要方法：dna transfer 轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移：基因?qū)牖蜣D(zhuǎn)移廣義的概念?；?qū)牖蜣D(zhuǎn)移廣義的概念。transduction 轉(zhuǎn)導(dǎo)：轉(zhuǎn)導(dǎo)：噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌之間的基噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌之間的基 因因 轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。transformation 轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化：將裸將裸dna或質(zhì)粒導(dǎo)入原核或質(zhì)粒導(dǎo)入原核 和真核細(xì)胞。和

8、真核細(xì)胞。ex-vivoin-vivotopical deliveryin-vivosystemic deliveryvexamples:- bone marrow- liver cells- skin cellsexamples:- brain- muscle- eye- joints- tumorsexamples:- intravenous- intra-arterial- intra-peritoneal1、病毒載體類型、病毒載體類型反轉(zhuǎn)錄病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒（rv）載體）載體腺病毒（腺病毒（av）載體）載體腺相關(guān)病毒（腺相關(guān)病毒（aav）載體）載體單純皰疹病毒（單純皰疹病毒（hsv）載體

9、）載體慢病毒（慢病毒（lentivirus)載體等載體等載體特征載體特征： reproducibility stable propagated purified to high titers mediated targeted delivery基因治療病毒載體比較基因治療病毒載體比較 rv av aav hsv lvrv av aav hsv lv基因組成基因組成 ssrna dsdna ssdna dsdna dsrnassrna dsdna ssdna dsdna dsrna基因組長度基因組長度 10 10kb 36kb 5kb 152kb 10kbkb 36kb 5kb 152kb 10

10、kb裝載容量裝載容量 8 30 kb capacity generation iiiadeno can be grown at very high titers, however do not integrate can contain rcas are toxic /immunogenicexamplesotc deficiency (clin, -)cystic fibrosis (clin, - )oncolytic viruses (clin, +)腺病毒載體研究進(jìn)展與展望腺病毒載體研究進(jìn)展與展望 進(jìn)展進(jìn)展 展望展望ad載體用于治療性的載體用于治療性的angiogenesis 降低毒性

11、的方法將繼續(xù)獲得進(jìn)展降低毒性的方法將繼續(xù)獲得進(jìn)展,取得進(jìn)展取得進(jìn)展 最終將提供安全的最終將提供安全的ad載體系統(tǒng)載體系統(tǒng).ad引起的毒性問題得到進(jìn)一步認(rèn)識(shí)引起的毒性問題得到進(jìn)一步認(rèn)識(shí) 靶向方法的應(yīng)用將進(jìn)一步改進(jìn)靶向方法的應(yīng)用將進(jìn)一步改進(jìn).提高提高ad載體的靶向性，改善療效載體的靶向性，改善療效 缺陷型的缺陷型的ad載體生產(chǎn)將不斷進(jìn)展載體生產(chǎn)將不斷進(jìn)展.新一代新一代ad載體能降低毒性，改善表達(dá)載體能降低毒性，改善表達(dá) 將面臨再次注射的挑戰(zhàn)將面臨再次注射的挑戰(zhàn)2 2 ，pa317pa317，cripcrip） 缺陷型的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的缺陷型的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的rna進(jìn)入靶細(xì)胞后，變成前病毒并整合到進(jìn)

12、入靶細(xì)胞后，變成前病毒并整合到宿主細(xì)胞的染色體上，可穩(wěn)定表達(dá)外宿主細(xì)胞的染色體上，可穩(wěn)定表達(dá)外源基因。源基因。 反轉(zhuǎn)錄病毒只能感染處于增殖期反轉(zhuǎn)錄病毒只能感染處于增殖期的細(xì)胞。的細(xì)胞。approachesmurine retrovirusesvsv-pseudotyped rvlentiviruses self-inactivating rvcombination virusesadvantages / limitations9 kb capacity + integration throughtransposition also in quiescent cells(hiv), permit

13、 in principle long-termtreatments, however disturbed by:insertional mutagenesisgene silencinghigh mutation ratelow titer of productionexamplesscid (il2r defect, paris) (clin, +)adenosine deaminase deficiency (clin, +!)parkinson (preclin, +)anti cancer (clin +/-)aav） 載體：載體：4.7kb單鏈單鏈dna，結(jié)構(gòu)為結(jié)構(gòu)為 itr-rep

14、-cap-itr ，病毒基因組簡(jiǎn)單，病毒基因組簡(jiǎn)單，易于消除，可降低細(xì)胞毒性和易于消除，可降低細(xì)胞毒性和t-淋巴細(xì)胞反淋巴細(xì)胞反應(yīng)的危險(xiǎn)性；病毒應(yīng)的危險(xiǎn)性；病毒dna可在人可在人19號(hào)染色體上號(hào)染色體上進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合，需要輔助因子出現(xiàn)才進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合，需要輔助因子出現(xiàn)才復(fù)制；其復(fù)制；其rep蛋白可能介導(dǎo)這種定向整合宿蛋白可能介導(dǎo)這種定向整合宿主范圍寬，易感染造血干細(xì)胞，能潛伏感染主范圍寬，易感染造血干細(xì)胞，能潛伏感染非分裂期細(xì)胞；在動(dòng)物模型中表達(dá)可持續(xù)半非分裂期細(xì)胞；在動(dòng)物模型中表達(dá)可持續(xù)半年以上。年以上。 但但aav載體接納的外源載體接納的外源dna小于小于4.5kb，載體整合效率較

15、低，制備困難載體整合效率較低，制備困難approacheshelper-dependent productionhelper independent productioncis-complementing vectorsco-infectionadvantages / limitationspersistence in the genome permits long-term expression, high titers are easily obtained, immunogenicity is very low,howeversmall capacity (4.5 kb) which d

16、oes not allow to accommodate large genes or gene clusters.exampleshemophilia b (clin, animal, +)gaucher (clin, animal, +)brain ischemia (animal, +)cystic fibrosis (animal, +/-)lentivirus（慢病毒載體）（慢病毒載體）優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 感染非分裂細(xì)胞感染非分裂細(xì)胞 ，有，有rv優(yōu)優(yōu)勢(shì)勢(shì)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu): ltr- gag- pol - env-ltr tar tat, rev, tev應(yīng)用應(yīng)用: 宿主廣泛宿主廣泛; 艾滋病基因治

17、療艾滋病基因治療問題問題: 安全性安全性adenovirus- no persistence- limited packaging-toxicity, -immunogenicityretrovirus (incl. hiv)- limited packaging- random insertion- unstable genomegeneral- antibody response- limited packaging- gene silencingsolutions:- synthetic viruses (“virosomes”)biolistic bombardmentor local

18、 direct injection - limited areaelectroporation- limited organ accessliposomes, gene correction & co.- very inefficient transfergeneral- low transfer efficiency- no or little genomic integrationsolutions:- improved liposomes with viral properties (“virosomes”)mw 50- 500 daltonssynthetically prep

19、aredrapid diffusion/actionoral delivery possiblecellular delivery: - act at cell surface - permeate cell membrane - imported through channelscan be delivered as soluble moleculesngstrom/nm sizerapidly reversible treatmentmw 20,000- 100,000 dabiologically preparedslower diffusion/actionoral delivery

20、not possiblecellular delivery - act extracellularlycan be delivered as soluble moleculesnm sizerapidly reversible treatmentmw n x 1,000,000 dabiologically preparedslow diffusionoral delivery inconceivablecellular delivery: - no membrane translocation - no nuclear translocation - no biological import

21、must be delivered as complex carrier particles50-200 nm sizeslowly or not reversibletherapy with nucleic acidsrequires particulated formulationis much more complex than previous drug deliverieshas a different degree of reversibility (dosage problem)2 2、非病毒及物理方法、非病毒及物理方法脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法磷酸鈣轉(zhuǎn)染法磷酸鈣轉(zhuǎn)染法機(jī)械法（顯微

22、注射、基因槍等）機(jī)械法（顯微注射、基因槍等）deae-葡聚糖和葡聚糖和polybrene轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染法電穿孔法電穿孔法超聲波輔助法超聲波輔助法納米材料等納米材料等中性脂質(zhì)體中性脂質(zhì)體 由脂類形成的可高效包裝由脂類形成的可高效包裝dna的人造的人造單層膜，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與細(xì)胞膜極為相似，單層膜，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與細(xì)胞膜極為相似，二者易于融合，細(xì)胞的內(nèi)吞作用使其進(jìn)入二者易于融合，細(xì)胞的內(nèi)吞作用使其進(jìn)入細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單 ，轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)，轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)50%，可用于體內(nèi)試驗(yàn)，但目的基因表達(dá)不穩(wěn)定可用于體內(nèi)試驗(yàn)，但目的基因表達(dá)不穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體：陽離子脂質(zhì)體：陽離子脂質(zhì)體在水中可陽離子脂質(zhì)體在水中

23、可形成大小約形成大小約100-400nm單層脂質(zhì)體。其單層脂質(zhì)體。其帶正電，帶負(fù)電的帶正電，帶負(fù)電的dna可自動(dòng)結(jié)合到帶可自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體正電的脂質(zhì)體上，形成上，形成dna-dna-陽離子脂質(zhì)陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，與細(xì)胞膜作用使體復(fù)合物，與細(xì)胞膜作用使dna進(jìn)入細(xì)進(jìn)入細(xì)胞。在該系統(tǒng)胞。在該系統(tǒng)體內(nèi)基因?qū)胄实停殷w內(nèi)基因?qū)胄实?，且無靶向性。在體內(nèi)應(yīng)用，除腫瘤瘤內(nèi)注無靶向性。在體內(nèi)應(yīng)用，除腫瘤瘤內(nèi)注射外，其前景仍存在問題。射外，其前景仍存在問題。 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染法：將氯化鈣、目的將氯化鈣、目的dna和磷酸緩沖液混合，沉淀形成含有和磷酸緩沖液混合，沉淀形成含有dna的極小的不

24、溶性磷酸鈣顆粒。磷的極小的不溶性磷酸鈣顆粒。磷酸鈣酸鈣-dna復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜，通過復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜，通過胞飲進(jìn)入受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)染過胞飲進(jìn)入受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)染過程簡(jiǎn)單有效程簡(jiǎn)單有效 ，適用于貼壁、非貼壁細(xì)，適用于貼壁、非貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)胞，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)20%左右，但目的左右，但目的基因表達(dá)不穩(wěn)定基因表達(dá)不穩(wěn)定基因槍工作原理基因槍工作原理顯微注射顯微注射approachesantisenseribozymes/dnazymestriple helixdecoy / competitorsgene-correcting oligosadvantages / limitation

25、sthese procedures may be suitable for :handling dominant defectstransient treatments (gene modulation)permanent treatments (gene correction)examplesanti cancer (clin,preclin., +/-)restenosis (clin, +)muscular distrophy (animal, +)電穿孔法電穿孔法通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)目的中轉(zhuǎn)導(dǎo)目的dna。細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)。細(xì)胞懸浮

26、液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，這種電中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。一般，壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。或更高）的毒性。deae-葡聚糖和葡聚糖和polybrene轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染法 帶正電的帶正電的deae-葡聚糖或葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的外源多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的外源dna分子分子作用，使得作用，使得dna可以結(jié)合在細(xì)胞表面?？梢越Y(jié)合在細(xì)胞表面。通過使用通過使用dmso或甘油獲得的滲透休克或甘油獲得的滲透休克將外源將外源dna導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用

27、導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。于轉(zhuǎn)染。deae-葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。approachesnaked dna injection /biolisticnaked dna + pressurenaked dna + electroporationliposomal formulationscombinationsadvantages / limitationsunlimited size capacity + lowerimmunogenicity and lower bio-riskof non viral formulations isdisturbed bylow

28、efficiency of gene transfereven lower stable integrationexamplescritical limb ischemia (clin, +)cardiac ischemia (clin, +/-)vaccination (clin, +/-)anti restenosis (preclin. +/-)stabilityparticle should resist serum inactivationparticle should be inert to immune inactivationaddressabilityparticle sho

29、uld possess a vascular addressing signatureparticle should bear a tissue-docking specificitydna construct should include tissue-specific regulatory elementsefficiencycargo should be protected from cytoplasmic inactivation (ex. lysosomes)cargo should contain nuclear-translocating signalsdna cargo sho

30、uld include genome-integration functionsdna element must be guaranteed to function after genomic integration (no silencing)other propertiesparticle should not include immunogenic/toxic surfacescargo should not encode immunogenic/toxic productscargo should include anti-apoptotic functionsseveral inde

31、pendent problems must be solved for a nonviral formulation to be suitable for clinical treatment and for industrial productionmost viral vectors include many, if not all those properties裸裸dna基因轉(zhuǎn)移和治療基因轉(zhuǎn)移和治療 進(jìn)展進(jìn)展展望展望裸裸dna肌肉注射，活體轉(zhuǎn)移肌肉注射，活體轉(zhuǎn)移非病毒基因轉(zhuǎn)移越來越重要非病毒基因轉(zhuǎn)移越來越重要電擊促進(jìn)質(zhì)粒電擊促進(jìn)質(zhì)粒dna進(jìn)入肌肉皮膚進(jìn)入肌肉皮膚未來幾年遺傳病臨床試驗(yàn)將

32、首選血友病未來幾年遺傳病臨床試驗(yàn)將首選血友病血管內(nèi)導(dǎo)入質(zhì)粒血管內(nèi)導(dǎo)入質(zhì)粒dna，肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移，肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移duchenne 肌營養(yǎng)不良，關(guān)節(jié)炎等肌營養(yǎng)不良，關(guān)節(jié)炎等尾靜脈導(dǎo)入尾靜脈導(dǎo)入pdna，簡(jiǎn)單有效，轉(zhuǎn)染大、，簡(jiǎn)單有效，轉(zhuǎn)染大、 嚙齒類的尾靜脈注射作為快速檢測(cè)表嚙齒類的尾靜脈注射作為快速檢測(cè)表小鼠肝細(xì)胞小鼠肝細(xì)胞 達(dá)狀況和基因治療方法廣泛應(yīng)用達(dá)狀況和基因治療方法廣泛應(yīng)用pdna表達(dá)載體可高水平持續(xù)表達(dá)表達(dá)載體可高水平持續(xù)表達(dá)血管內(nèi)裸血管內(nèi)裸dna導(dǎo)入為細(xì)胞有效涉入導(dǎo)入為細(xì)胞有效涉入pdnarnai將在基因治療領(lǐng)域中成為重要手將在基因治療領(lǐng)域中成為重要手裸裸dna導(dǎo)入法已經(jīng)在臨床研究（導(dǎo)

33、入法已經(jīng)在臨床研究（paod， 段段外周動(dòng)脈閉鎖癥）外周動(dòng)脈閉鎖癥）sirna可通過血管內(nèi)基因轉(zhuǎn)移法有效導(dǎo)入可通過血管內(nèi)基因轉(zhuǎn)移法有效導(dǎo)入knockout 小鼠小鼠 problems that must be solved to be suitable for clinical treatment and for industrial production are different between viral and non-viral vectorswhen ignoring their low efficiency, nonviral vectors appears largely su

34、periorviral vectorspackaging capacity from 4 to 30 kb problem for some large genes (ex. dystrophin gene or cftr gene)important toxic load: ratio infectious/non-infectious particles from 1/10 to 1/100strong immunogenicity: capsid and envelope proteins, residual viral genescontaminants: replication-co

35、mpetent viruses (ex. wild type revertant viruses)viral amount (titre) obtainable with recombinants (ex. 10exp5 = poor, 10exp10=excellent)complexity of production (existence or not of packaging cell systems)emotional problems linked to pathogenicity of donor vectors (ex. lentiviruses)nonviral vectors

36、packaging capacity not an issue, even very large constructs can be used (example entire loci up to 150 kb)minor toxic load: small percentage of non relevant adventitious materialsmoderate immunogenicity: methylation status of dna (example cpg motifs)contaminants: adventitious pathogens from poor dna

37、 purification (ex endotoxins)amount of dna molecules is usually not a problem, the other components depends on chemical synthesisno particular complexity, except for specially formulated liposomes no particular emotional problems linked to the nature of the reagentsrandom integrating vectorslr-lentiviruseslr-retroviruseslr-aavlplasmids (low frequency)lplasmids + transposase (eg sleeping beauty)transient, non integrating vectorsladenoviruslplasmidlrna virus basedloligonucl