南方醫(yī)科大學(xué)-血清分離和提純-級(jí)臨床醫(yī)學(xué)二-第7實(shí)驗(yàn)室

1、南方醫(yī)科大學(xué)-血清分離和提純-2015級(jí)臨床醫(yī)學(xué)二-第7實(shí)驗(yàn)室南方雇耕大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓 名:學(xué) 號(hào)專(zhuān)業(yè)年級(jí)生物化學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心6 / 14實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)血清清蛋白、丫-球蛋白的分離純化及定量實(shí)驗(yàn)日期2016年11月17日 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn) 第7實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)老師尹紅評(píng)分教師簽名批改日期一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握凝膠層析法、鹽析法、離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法；掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基礎(chǔ)方法；3. 了解柱層析技術(shù)的原理和相應(yīng)操作二、實(shí)驗(yàn)原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成，各行使其重要的功能。本實(shí)驗(yàn)利用鹽析方法將血清中的清蛋白和球蛋白分離，并用電泳技 術(shù)觀察蛋白質(zhì)分離1 .鹽析蛋

2、白質(zhì)分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因?yàn)橛袃蓚€(gè)穩(wěn)定因素即表面的電 荷和水化膜。當(dāng)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時(shí)，蛋白質(zhì)分子可相互聚 集沉淀而析出，蛋白質(zhì)分子沉淀析出的方法很多，根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定 因素破壞的不同有中性鹽析法、有機(jī)溶溶劑法、重金屬鹽法以及生物 堿試劑法等。鹽析法的原理是：中性鹽如硫酸鏤（NHJ2SOJ等對(duì)蛋白 質(zhì)作用破壞了蛋白質(zhì)表面水化膜，并且中和了部分電荷，從而使蛋白 質(zhì)相互聚集而析出。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電 荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同，因此調(diào)節(jié)鹽 的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達(dá)到分離的目的。血清球蛋白在半 飽和狀態(tài)下發(fā)生沉淀，而血清清蛋白在完全

3、飽和狀態(tài)下沉淀，利用此 特性可把蛋白質(zhì)分段沉淀下來(lái)，即在半飽和的中，血清蛋白不沉淀， 而血球蛋白沉淀，離心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸 鐳水即可溶解，由此達(dá)到分離清蛋白和白蛋白的目的。2 .脫鹽鹽析得到的蛋白質(zhì)含有高濃度中性鹽，需要有脫鹽過(guò)程去除蛋白質(zhì) 遺留的中性鹽常用方法有：透析法脫鹽和凝膠層析法脫鹽。本實(shí)驗(yàn)采用凝膠層析法 脫鹽，在葡聚糖凝膠柱中，蛋白質(zhì)及鹽的分子量不同，當(dāng)樣品通過(guò)層 析柱時(shí)，分子量較大的蛋白質(zhì)因?yàn)椴荒芡ㄟ^(guò)網(wǎng)孔而進(jìn)入凝膠顆粒，沿 著凝膠顆粒間的間隙流動(dòng)，所以流程較短，向前移動(dòng)速度較快，最先 流出層析柱；反之，鹽的分子量較小，可通過(guò)網(wǎng)孔而進(jìn)入凝膠顆粒， 所以流程長(zhǎng)，

4、向前移動(dòng)速度較慢，流出層析柱的時(shí)間較后。分段收集 蛋白質(zhì)洗脫液，即可得到脫鹽的蛋白質(zhì)。3 .純化（離子交換層析）離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進(jìn)行可逆的的交換過(guò) 程。帶正電荷的交換劑稱(chēng)為陰離子交換劑；帶負(fù)電荷的交換劑稱(chēng)為陽(yáng) 離子交換劑。本實(shí)驗(yàn)采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，溶液中帶負(fù)電荷 的離子可及其進(jìn)行交換結(jié)合，帶正電荷的點(diǎn)正電荷的離子則不能，這 樣便可達(dá)到分離純化的目的。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白，利用它們的等電點(diǎn)的不同可 進(jìn)行分離。血清中各種蛋白質(zhì)的pl各不相同，因此，在同一醋酸鏤緩 沖液中，各蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，可以通過(guò)DEAE離子交換層析將血 清清蛋白和伽馬

5、球蛋白分離出來(lái)。4 .純度鑒定（電泳）血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，一般都低于PH7.4。它們?cè)?PH8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于血漿 中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維 素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白 （Albumin） a 1-球蛋白、a 2-球蛋白、B-球蛋白、丫-球蛋白5條 區(qū)帶。三、材料及方法：（一）材料人血清試劑飽和硫酸核溶液0. 02mol/l pH值為6. 5的醋酸鏤緩沖液0. 06mol/l的PH值為6. 5醋酸鏤緩沖液南方醫(yī)科大學(xué)-血清分離和提純-2015級(jí)臨床醫(yī)學(xué)二-第7實(shí)驗(yàn)室0. 3mol/l的

6、PH值為6. 5醋酸鏤緩沖液1. 5mol/l 的 NaCl-0. Smol/NHAc 溶液20%磺基水楊酸l%BaC1溶液儀器和器材二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素離子交換層析柱和葡聚糖凝膠 G-25(Sephadex G-25)層析柱燒杯、1ml和10ml的吸管、滴管、試管、 黑色反應(yīng)板、鐵固定架、螺旋夾電泳槽和電泳儀除去鹽離子后收集的球蛋白過(guò)DEAE-纖維素層析柱 （lcmX6cm）用 3 毫升 0.02mol/l pH=6.5、 的醋酸鐵緩沖液洗脫，流出液量2毫升,用 3 毫升 0.02mol/l pH=6.5、 的醋酸鉉緩沖液洗月感 流出液量2毫升收集含有蛋白的洗脫液每、 管10滴，

7、連續(xù)收集三管DEAE-纖維素柱不用再生，可直1”除去鹽離子后收集的球蛋白過(guò)DEAE-纖維素層析柱（IcmX 6cm）用1毫升0.06mol/l醋酸鏤緩沖 液（2毫升）洗脫，流出液量2 毫升（用5毫升0.06mol/l醋酸核緩沖 液流洗，除掉a球蛋白、B球蛋6 / 14 1）（南方醫(yī)科大學(xué)-血清分離和提純-2015級(jí)臨床醫(yī)學(xué)二-第7實(shí)驗(yàn)室步驟操作現(xiàn)象(1)鹽析取離心管一個(gè)，加入0. 8mol人或動(dòng)物血清， 邊搖邊緩慢滴入飽和硫酸鍍?nèi)芤?. 8ml,混勻 后室溫下放置lOmin ,離心lOmin (4000r/min) o用滴管小心吸出上清液置于試管中，作為純化清蛋白之用溶液由淡黃 色透明狀轉(zhuǎn) 變

8、為白色濁 液，離心后 溶液分層， 上層澄清， 下層為白色 沉淀(2)溶向離心管的沉淀加入0. 6mol蒸鐳水，振搖使白色沉淀完解沉淀之溶解，作為純化y球蛋白用全溶解，液 面有泡沫產(chǎn) 生步驟操作現(xiàn)象(1)調(diào)節(jié)層析 柱液面葡萄糖凝膠G-25層析柱經(jīng)0. 02mol/L .PH6. 5 NH4AC緩沖液流洗平衡后，取下恒壓 儲(chǔ)液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夾，使層 析柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床液面液體緩慢低 落，約每三 秒鐘兩滴(2)加樣品用細(xì)長(zhǎng)滴管吸取上述經(jīng)鹽析所得的粗制蛋白 質(zhì)溶液，小心而緩慢的加入凝膠床上面，柱 下端用10ml刻度離心管接液，擰松柱下螺旋 夾，調(diào)節(jié)適當(dāng)流速，使樣品進(jìn)入凝膠床，

9、至 液面降到凝膠床表面為止3 )洗層析柱小心用 0. 02mol/L> pH6. 5 NH4AC 緩沖液 洗滌層析柱內(nèi)壁，以洗滌粘在柱壁上的蛋白 質(zhì)樣品液(4)洗脫待樣品液進(jìn)入凝膠床內(nèi)，繼續(xù)用0. 02U1O1/L、PH6.5 NH4AC緩沖液流洗，同時(shí)注意流出液11(5)檢測(cè)及收在黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi)加2滴0. 92mol/L磺 基水楊酸，隨時(shí)檢查流出液是否含有蛋白質(zhì)，磺基水楊酸在接受層析集蛋白質(zhì)滴流出液1滴黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi)接觸到磺 基水楊酸溶液，若出先白色混濁或沉淀，表 示已有蛋白質(zhì)流出(當(dāng)凝膠床體積為5. 5ml 時(shí)，流出的液體量約為2ml就可能有蛋白質(zhì) 流出)，立即收集流出的蛋白質(zhì)溶

10、液。收 集約12滴后，滴流出液1滴于預(yù)先加有1滴 0. 05mol/L(l%)BaC12的黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi), 一旦見(jiàn)出現(xiàn)白色沉淀(表示有S042-),立即 停止收集收集的蛋白質(zhì)溶液即可分別過(guò) DEAE纖維素柱，進(jìn)行離子交換層析柱低落液前 兩次顯現(xiàn)澄 清，第三次 產(chǎn)生白色沉 淀，黑色板 孔氯化鋼部 分第一次即 出現(xiàn)白色沉 淀(6)層析柱再生平衡收集蛋白質(zhì)溶液后的凝膠層析柱繼續(xù)用 0. 02mol/L pH6. 5 NH4AC 緩沖液流洗，用 BaC12液檢測(cè)層析柱流出液，當(dāng)流出液用 BaC12檢查S042-為陰性后,繼續(xù)洗滌2、31nL 凝膠層析柱即可再生平衡，可再次使用氯化領(lǐng)部分 在連續(xù)接受

11、幾次滴入后 沉淀顏色變 淡，直至完 全無(wú)沉淀 球蛋白的純化：過(guò)DEAE纖維素陰離子交換層析柱步驟操作現(xiàn)象(1)調(diào) 節(jié)層析 柱換沖 液面經(jīng)處理再生好的DEAE纖維素層析柱，取下其恒 壓儲(chǔ)液瓶管塞。小心控制柱下端螺旋夾，使柱 上緩沖液面剛好下降到纖維素床表面。柱下端 用10ml刻度離心管收集液體，以便了解加樣后 液體的流出量。2）加樣ini將除除鹽后收集的球蛋白溶液緩慢加到纖維 素柱上，調(diào)節(jié)層析柱下端的螺旋夾使樣品進(jìn)入 纖維素柱床，至液面降到纖維素柱床表面為 止。(3)洗層析柱小心用1ml 0. 02mol/L PH 6. 5的醋酸鏤緩沖液洗滌沾在柱壁上的蛋白質(zhì)樣儲(chǔ)液。(4)洗脫待樣品進(jìn)入纖維素柱

12、床內(nèi)，繼續(xù)用0. 02mol/L PH 6. 5的醋酸鏤緩沖液流洗，同時(shí)注意流出液量(5)檢 測(cè)及收 集蛋白 質(zhì)流洗時(shí)，隨時(shí)用0. 92mol/L磺基水楊酸檢查 流出液中是否含蛋白質(zhì)(方法同前)當(dāng)有蛋白 質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，立即連續(xù)收集三管，每管10滴，此 不被DEAE纖維素吸附的蛋白質(zhì)即為純化的丫- 球蛋白，取其中蛋白質(zhì)濃度最高的一管留作鑒 定用?，F(xiàn)象同前注意：a.當(dāng)層析柱的緩沖液面或樣品液面剛好下降到纖維素床表面時(shí), 不要使液面低于纖維素膜表面，以免空氣進(jìn)入凝膠床。b.往層析住加13 / 14南方醫(yī)科大學(xué)-血清分離和提純-2015級(jí)臨床醫(yī)學(xué)二-第7實(shí)驗(yàn)室 樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢加入，不要將纖

13、維素沖起或破壞纖 維素床表面平整。C.切勿將檢測(cè)蛋白質(zhì)的磺基水楊酸及檢查硫酸根的 氯化鋼混淆，因?yàn)槎呦鄳?yīng)生成物的沉淀均為白色。d.洗脫是應(yīng)注意 及時(shí)收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失。e.葡萄糖凝膠價(jià)錢(qián)昂貴， 要回收再生避免損耗，嚴(yán)禁倒掉。步驟操作準(zhǔn)備電泳槽準(zhǔn)備：將電泳槽置于水平平臺(tái)上， 兩側(cè)注入等量的巴比妥緩沖溶液，使其在 同一水平a,頁(yè)面及支架距離2、2. 5cm,用 三層濾紙或雙層紗布搭橋薄膜準(zhǔn)備將醋酸纖維薄膜裁成2cm乘以8cm大小共 四段，在薄膜一段1. 5cm處用鉛筆輕輕畫(huà) 上一條橫線(xiàn)為點(diǎn)樣線(xiàn)，末端用鉛筆做記號(hào)。 進(jìn)入巴比妥溶液中直至浸潤(rùn)完全。用鑲子 青青取出，粗面朝上，平放在兩層

14、干濾紙 中間，輕輕拭去多余的緩沖液。醋酸纖維膜有 光面和粗面兩 面，粗面呈現(xiàn)啞 光樣，在此面做 標(biāo)記點(diǎn)樣薄膜片置于干凈的玻璃或?yàn)V紙片上，粗 面朝上，用玻片或載玻片一段的截面在盛 有樣品的直接沾取2“3微升待測(cè)品，讓后 將樣品及薄膜點(diǎn)樣先輕輕接觸，均勻分布 在點(diǎn)樣線(xiàn)上，帶樣品滲入薄膜后移開(kāi)，四 種樣品分別點(diǎn)樣。接觸后無(wú)明顯現(xiàn)象電泳將已點(diǎn)好的樣品薄膜放在鋪有濾紙鹽橋的14 / 14南方醫(yī)科大學(xué)-血清分離和提純-2015級(jí)臨床醫(yī)學(xué)二-第7實(shí)驗(yàn)室電泳槽上，點(diǎn)樣面朝下，點(diǎn)樣端至陰極， 輕輕拉平薄膜。平衡約5min,使緩沖液滲 透大道平衡。接好電路，調(diào)節(jié)電壓開(kāi)始電 泳。待各個(gè)樣品沒(méi)有變化停止電泳，并輕 輕

15、取出。染色漂洗和鑒將染色液倒入大培養(yǎng)皿中，電泳完畢后用 鏡子取出薄膜，直接浸入染色約5min。后 將薄膜取出，漂洗至背景無(wú)色，觀察電泳 情況醋酸纖維膜洗 脫后表面呈現(xiàn) 出藍(lán)色條帶，條 帶樣見(jiàn)下文實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的現(xiàn)象已于上各表中列出 四、結(jié)果及討論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示：A根據(jù)相同類(lèi)型蛋白質(zhì)有相同電泳距離的規(guī)律，本組判定：圖中B組為 人血清的電泳結(jié)果，A, C, D三組及B組比較判定：圖中從左至右分別為丫-球蛋白、血清樣本、清蛋白2和清蛋白1的電 泳結(jié)果。對(duì)結(jié)果的討論：1、圖中可以看出清蛋白2的電泳調(diào)到在最深色條帶之前有少不明顯的 染色區(qū)段，該現(xiàn)象的原因可能為該條帶的點(diǎn)樣為首次分理出的清蛋白 還含有少數(shù)

16、球蛋白，故在電泳時(shí)停留在這些區(qū)段而顯色。2、圖中清蛋白1及血清樣的條帶有些許彎曲，該現(xiàn)象可能是由于點(diǎn)樣 是點(diǎn)樣用蓋玻片邊緣寬度過(guò)寬導(dǎo)致邊緣效應(yīng)的產(chǎn)生。還可能由于點(diǎn)樣 過(guò)多導(dǎo)致點(diǎn)樣區(qū)不均勻造成。3、有某些組的顯色結(jié)果不明顯或不顯色，這可能是由于點(diǎn)樣過(guò)少造成。思考題：1 .硫酸鍍鹽析一步,為什么是0. 8ml血清加0. 8ml飽和硫酸銹？半飽和狀態(tài)下的血清球蛋白在硫酸鐵溶液中將沉淀，血清清蛋白在不 飽和的硫酸鍍?nèi)芤褐腥芙猓瑢⒀搴惋柡土蛩徼F等體積混合后，配出 半飽和的硫酸鐵溶液，在此狀態(tài)下，球蛋白沉淀，而清蛋白不沉淀，16 / 14南方醫(yī)科大學(xué)-血清分離和提純-2015級(jí)臨床醫(yī)學(xué)二-第7實(shí)驗(yàn)室 因而可以將其分開(kāi)。2 .為什么實(shí)驗(yàn)中DEAE纖維素柱分離丫-球蛋白后不用再生，可直接用 于純化清蛋白？答：丫-球蛋白為帶正電荷蛋白，故不在DEAE中結(jié)合而直接從層析柱 中洗脫出來(lái)，造成兩種蛋白的流出速度不同所以分離丫-球蛋白后可直 接用于純化清蛋白。3 .應(yīng)用醋酸纖維素薄膜電泳鑒