組培設(shè)備與條件概述

1、組培設(shè)備與條件開展植物組織培養(yǎng)工作需要一個(gè)比較合理實(shí)用的場(chǎng)所，一套適宜的設(shè)備和提供必要的實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件，這是首先要考慮到的。根據(jù)科學(xué)、合理的原則，一個(gè)較為理想的配置應(yīng)該包括： 1、化學(xué)藥品室 2、配培養(yǎng)基室 3、滅菌室 4、接種室 5、無菌培養(yǎng)室 基本儀器設(shè)備與用品 1、儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋（手提式、立式或臥式）、小推車（可選）、精密電子天平（至少千分之一）、電子天平或托盤天平、酸度計(jì)、普通冰箱、烘箱、解剖鏡、光照培養(yǎng)箱（選購(gòu)）、電爐、微量可調(diào)移液器及配套吸嘴、移液管架、磁力攪拌器（可選）、不銹鋼托盤、灌裝機(jī)（可選）、培養(yǎng)架、定時(shí)器（控制光照時(shí)間）、紫外線殺菌燈、照度計(jì)（可選）、溫濕

2、度計(jì)（可選）蒸餾水器、搖床（可選）、針頭濾器及配套濾膜2、小型用品 槍鑷，彎剪、解剖刀、接種盤3、玻璃器皿 組培瓶（玻璃或塑料）、燒杯、量筒、移液管、試劑瓶、移液管架、容量瓶、試管、酒精、玻璃棒、滴瓶4、組培藥品 （詳細(xì)藥品請(qǐng)見常用配方）5、其他 吸耳球、刷子、記號(hào)筆、定時(shí)鐘、手套、封口膜、衛(wèi)生藥棉、拖鞋、口罩、白大褂、濾紙、洗瓶培養(yǎng)條件 在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、 PH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都回影響組織培養(yǎng)育苗的生長(zhǎng)和發(fā)育。 一、溫度（temperature） 因?yàn)闇囟仁侵参锝M織培養(yǎng)中的重要因素，所以植物組織培養(yǎng)在最適宜的溫度下生長(zhǎng)分化才能表現(xiàn)良好，大

3、多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在 2327 之間進(jìn)行，一般采用 25±2。低于15時(shí)培養(yǎng)，植物組織會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)停止，高于35時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)不利。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同。白鶴非的最適溫度是20、月季是2527、番茄是28。溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長(zhǎng)速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以28為最好，在12以下，33以上形成率皆最低。 不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在30以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率比在25%以下的高。桃胚在2條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用35處理草莓的莖尖分生組織3d，可得到無病毒苗。 二、光照（light

4、） 組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面： 1、光照強(qiáng)度（light intensity） 光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植物體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。 2、光質(zhì)（light wave） 光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。 3、光周期

5、（light period） 試管苗培養(yǎng)時(shí)要選用一定的光暗周期來進(jìn)行組織培養(yǎng)，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，對(duì)短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長(zhǎng)日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時(shí)需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗培養(yǎng)下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。 三、濕度（humidity） 濕度的影響包括培養(yǎng)容器保持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)當(dāng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉性較高的封口材料易引起透氣性

6、受阻，也會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受影響。 環(huán)境的相對(duì)濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求70%-80%的相對(duì)濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。濕度過低會(huì)使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行。濕度過高時(shí)，易引起棉塞長(zhǎng)霉，造成污染。 四、滲透壓（penetrating pressure） 培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1-2個(gè)大氣壓對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上就對(duì)植物生長(zhǎng)有阻礙作用，而5-6個(gè)大氣壓植物生長(zhǎng)就會(huì)完全停止，6個(gè)大氣壓植物細(xì)胞就不能生存。 五、PH值 不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適P

7、H值的要求也是不同的（見表），大多在5-6.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多數(shù)植物培養(yǎng)的需要。不同植物的最適PH值 種類 最適 PH 值 種類 最適 PH 值 杜鵑4.0月季5.8越橘4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄、葡萄5.7 PH值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣，后者較高一些。一般來說PH值高于6.5時(shí)，培養(yǎng)基全變硬；低于5時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。因?yàn)楦邷販缇鷷?huì)降低PH值（約0.2-0.3個(gè)PH值）因此在配制時(shí)常提高PH值0.2-0.3單位。PH值大小調(diào)節(jié)可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl來調(diào)整。1ml的

8、NaOH可使PH值升高0.2單位，1ml的HCl可使PH值降低0.2單位。調(diào)節(jié)時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉?六、氣體（gas） 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時(shí)，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時(shí)要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。 培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的“血液”，血液的成分及其供應(yīng)狀況直接關(guān)系到培養(yǎng)物的生長(zhǎng)與分化，因此了解培養(yǎng)基的成分、特點(diǎn)及其配制至關(guān)重要。自然狀態(tài)下生長(zhǎng)的綠色植物由于

9、自身能進(jìn)行光合作用，并且能合成植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的幾乎所有有機(jī)成分，加上土壤中含有較全面的無機(jī)和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，所以只需在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候施加少量的無機(jī)和有機(jī)肥（復(fù)合成分），植物就可良好的生長(zhǎng)。但是，在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，只是切取植物體的一小部分，它們無法合成生長(zhǎng)發(fā)育所需要的全部物質(zhì)，加上人們對(duì)植物體的各種組織和器官所需營(yíng)養(yǎng)成分了解甚少，因此對(duì)培養(yǎng)基的組成成分的探索走過了一條十分艱苦而漫長(zhǎng)的道路，至今人們還不能完全達(dá)到自主的階段。在所報(bào)道的培養(yǎng)基中，沒有任何一種培養(yǎng)基能夠適合所有類型的植物組織和器官，也沒有實(shí)現(xiàn)對(duì)所有的植物都能通過組織培養(yǎng)使其再生的目的。由于植物的多樣性和生長(zhǎng)環(huán)境的復(fù)雜性與多變性，也不可

10、能有一種萬能的培養(yǎng)基。目前所使用的培養(yǎng)基有10余種之多，大部分都是在前人研究的基礎(chǔ)上經(jīng)過分析綜合和改進(jìn)而成的。例如，White培養(yǎng)基是Uspenski和Uspenskaia（1925）的藻類培養(yǎng)基演化的結(jié)果，被廣泛用于根的培養(yǎng)；Cautheret培養(yǎng)基是建立在Knop營(yíng)養(yǎng)液（1865）基礎(chǔ)上的。以后的培養(yǎng)基大部分是在White和Cautheret培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成。 就目前所使用的各種培養(yǎng)基而言，可將它們的成分劃分為幾大類， 1、 水 水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動(dòng)過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止

11、儲(chǔ)藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。 2、 無機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分（包括大量元素，微量元素和鐵鹽） 3、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分（包括維生素，氨基酸及其微生物等） 4、碳水化合物 5、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（常稱為激素） 6、 瓊脂或其他支持物 7、 其他添加劑 （含天然提取物、抗生素等） ·維生素B1（鹽酸硫胺素）·維生素 B2（核黃素）·維生素 B6（吡多辛）·維生素 C（抗壞血酸）·維生素 E（生育酚）·維生素 A（維生素甲、視黃醇）·維生素 AD（魚肝；由丸）·阿發(fā)骨化醇&

12、#183;蘆丁 （維生素P）蘆?。ňS生素P）維生素 B6，鹽酸吡哆醇 用途： 主要用于防治皮膚粗糙、粉刺、日光曬傷、止癢。也適用于防治脂溢性脫發(fā)、皮膚炎癥、一般性痤瘡，脂溢性濕疹和落屑性皮膚等化妝品制劑。可制成膏霜、乳液和醇溶液。一般與其他維生素配合使用。技術(shù)指標(biāo)： 中文名稱： 維生素 B6，鹽酸吡哆醇 英文名稱： Vitamin B6，Pyridoxin 化學(xué)名稱： 6甲基5羥基3，4吡啶二甲醇鹽酸鹽質(zhì)量指標(biāo)：熔 點(diǎn)：205209鑒 別：本品的紅外吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照的圖譜一致。酸 度：PH值應(yīng)為2.43.0產(chǎn)品說明： 性 狀： 白色或類白色的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末；無臭，味酸苦；遇光漸變質(zhì)。在水中易

13、溶，在乙醇中微溶，在氯仿或乙醚中不溶。水溶液呈微酸性反應(yīng)。吡哆醇是醇式維生素B6，是較穩(wěn)定的一種結(jié)構(gòu)，在酸性或堿性溶液中可耐熱維生素 B1（鹽酸硫胺素） 作 用 主要用於防治缺乏維生素B1所致的腳氣病。也用於神經(jīng)炎、心肌炎、消化不良輔助治療。甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)患者，妊娠或高熱患者，可適當(dāng)補(bǔ)充維生素B1，以改善癥狀。 羅納普朗克動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)公司的鹽酸硫胺素（維生素B1）是鹽酸銨素粉狀產(chǎn)品，符合美國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。組成: 化學(xué)式 C12H17C1N4OL HCI維生素B4 Vitamin B4（腺嘌呤，氨基嘌呤，Adeninephosphate）【性狀】常用其磷酸鹽，為白色針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。易溶于水，微溶于

14、乙醇，不溶于乙醚或氯仿。其飽和水溶液呈中性?！舅幚砑皯?yīng)用】本品是核酸的組成成分，在體內(nèi)參與RNA和DNA合成。當(dāng)白細(xì)胞缺乏時(shí)，它能促進(jìn)白細(xì)胞增生，一般用藥24周左右，白細(xì)胞數(shù)目可增加。用于各種原因如放射治療、苯中毒、抗腫瘤藥和抗甲狀腺藥等引起的白細(xì)胞減少癥，也用于急性粒細(xì)胞減少癥。葉酸（維生素BC，維生素M）水溶性；維生素B族中的一種，亦稱為維生素BC或維生素M； 計(jì)量單位是微克（mcg）； 是制造紅血球不可缺少的物質(zhì)； 幫助蛋白質(zhì)的代謝。-生物素（d-biotin, 1）又名維生素H，屬水溶性維生素B族。 d-生物素是轉(zhuǎn)化酶的輔酶R，也是蛋白質(zhì)和脂肪中間代謝中的一個(gè)重要輔酶，在維持人和動(dòng)物正

15、常生長(zhǎng)發(fā)育，保護(hù)皮膚，羽毛和骨髓健康起著必不可少的作用。因而為醫(yī)療，多維制劑和飼料行業(yè)等方面得以廣泛應(yīng)用。生物素的補(bǔ)充物為右旋生物素（ D-生物素）制劑，純品一般含 D-生物素98以上，是一種近白色結(jié)晶性粉末，在冷水中溶解度低，隨水溫升高其溶解度增加，但高溫時(shí)穩(wěn)定性受到影響，配制生物素溶液時(shí)，最適溫度為50左右。生物素是穩(wěn)定性較好的一種維生素，對(duì)氧化、還原、微量元素都很穩(wěn)定，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、紫外線對(duì)生物素稍有影響，生物素對(duì)熱敏感。D-生物素（維生素H）化學(xué)名稱： D-Biotin（VITAMIN H）標(biāo)準(zhǔn)： USP24/BP98規(guī)格：醫(yī)藥級(jí)（ 99.0%）飼料級(jí)（2%）二四滴（ 2，4-dichl

16、orophenoxyaceticacid，2，4-D） 一種人工合成的具有與生長(zhǎng)素類似生理效應(yīng)的有機(jī)物。化學(xué)名稱為2，4-二氯苯氧乙酸，合成過程簡(jiǎn)單，可以大量生產(chǎn)，在農(nóng)業(yè)及園藝生產(chǎn)上已廣泛應(yīng)用。低濃度具有促進(jìn)插枝生根，阻止器官脫落，形成無子果實(shí)等作用，如1015ppm（1ppm=10-6）溶液蘸花或噴灑花簇，即可得到無子果實(shí)；高濃度可殺死雙子葉植物，作為單子葉植物小麥、玉米、高梁等田間的除草劑。吲哚丁酸 （IBA）和一種植物細(xì)胞分裂素：6芐基腺嘌吟（6BA）D-生物素/VH葉酸 /VBc萘乙酸簡(jiǎn)稱，是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，近年來在果樹生產(chǎn)上應(yīng)用十分廣泛 .培養(yǎng)基的種類 培養(yǎng)基有許多種類，根據(jù)不同

17、的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Sacks（1680）和Knop（1681），他們對(duì)綠色植物的成分進(jìn)行了分析研究，根據(jù)植物從土中主要是吸收無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無機(jī)鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。以后根據(jù)不同目的進(jìn)行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基，White培養(yǎng)基在40年代用得較多，現(xiàn)在還常用。而到60和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，可以保證培養(yǎng)材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要，并能生長(zhǎng)快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。 培養(yǎng)基的名稱，一直根據(jù)沿用的習(xí)慣。多數(shù)以發(fā)明人的名

18、字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱MS培養(yǎng)基），也有對(duì)某些成分進(jìn)行改良稱作改良培養(yǎng)基。 目前國(guó)際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn)如下： （1）MS培養(yǎng)基 它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。 （2）B5培養(yǎng)基 是1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能

19、對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。 （3）White培養(yǎng)基 是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO 4 的濃度和增加了鵬素。其特點(diǎn)是無機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。 （4）N6培養(yǎng)基 是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是成分較簡(jiǎn)單，KNO 3 和（NH 4 ）2SO 4 含量高。在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。 （5）KM-80培養(yǎng)基 它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，它

20、包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。 培養(yǎng)基的選擇 1、選擇合適的培養(yǎng)基 選擇合適的培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)。選擇合適的培養(yǎng)基主要從以下兩個(gè)方面考慮：一是基本培養(yǎng)基；二是各種激素的濃度及相對(duì)比例。MS培養(yǎng)基適合于大多數(shù)雙子葉植物，B5和N6培養(yǎng)基適合與許多單子葉植物，特別是N6培養(yǎng)基對(duì)禾本科植物小麥、水稻等很有效，White培養(yǎng)基適合于根的培養(yǎng)。首先試用這些培養(yǎng)基進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)，可以少走彎路，大大；減少時(shí)間、人力和物力的消耗。當(dāng)通過一系列初試之后，可再根據(jù)實(shí)際情況對(duì)其中的某些成分做小范圍調(diào)整。在進(jìn)行調(diào)整時(shí)，以下情況可供參考。一是當(dāng)用一種化合物作為氮源時(shí)，硝酸鹽的作用比銨鹽好

21、，但單獨(dú)使用硝酸鹽會(huì)使培養(yǎng)基的PH向堿性方向漂移，若同時(shí)加入硝酸鹽和少量銨鹽，會(huì)使這種漂移得到克服。二是當(dāng)某些元素供應(yīng)不足時(shí)，培養(yǎng)的植物會(huì)表現(xiàn)出一些癥狀，可根據(jù)癥狀加以調(diào)整，如氮不足時(shí)，培養(yǎng)的組織常表現(xiàn)出花色苷的顏色（紅、紫紅色），愈傷組織內(nèi)部很難看到導(dǎo)管分子的分化；當(dāng)?shù)?、鉀或磷不足時(shí)，細(xì)胞會(huì)明顯過度生長(zhǎng)，形成一些十分蓬松，甚至呈透明狀的愈傷組織；鐵、硫缺少時(shí)組織會(huì)失綠，細(xì)胞分裂停滯，愈傷組織出現(xiàn)褐色衰老癥狀；缺硼時(shí)細(xì)胞分裂趨勢(shì)緩慢，過度伸長(zhǎng)；缺少錳或鉬時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受到影響。培養(yǎng)基外源激素的作用也會(huì)使培養(yǎng)物出現(xiàn)上述一些類似的情況，所以應(yīng)仔細(xì)分析，不可輕易下結(jié)論。2、激素濃度和相對(duì)比例的確定 組織

22、培養(yǎng)中對(duì)培養(yǎng)物影響最大的是外源激素，在基本培養(yǎng)基確定之后，實(shí)驗(yàn)中要大量進(jìn)行的工作是用不同種類的激素進(jìn)行濃度和各種激素間相互比例的配合試驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，首先應(yīng)參考已有的報(bào)道，看是否有用相同植物、相同組織或相近者做過成功或失敗的試驗(yàn)，如果有則可直接作為參考；如果沒有，則在建立激素配比中，將每一種擬使用的激素選擇3-5個(gè)水平，再按隨機(jī)組合的方式建立起如下的實(shí)驗(yàn)方案。 這樣就設(shè)計(jì)出了16種激素配比的實(shí)驗(yàn)方案，即16種不同的培養(yǎng)基。用著16種培養(yǎng)基進(jìn)行初試之后，你會(huì)找到1種或幾種是比較好的。再在這些比較好的組合的基礎(chǔ)上進(jìn)行小范圍的調(diào)整，設(shè)計(jì)出一組新的配方。如在表一中，您認(rèn)為6號(hào)培養(yǎng)基較有希望，就可以在此基

23、礎(chǔ)上做出如表二的一組新的設(shè)計(jì)。表一 兩種激素4種濃度的組合試驗(yàn) 濃度為 mg ? L -1細(xì)胞分裂素 0.51.5 3 4.5 生長(zhǎng)素0 123 4 0.5 56 7 8 1.0 9 101112 2.013 141516有 16種不同的培養(yǎng)基 表二 第二次激素配比實(shí)驗(yàn) 濃度為 mg ? L -1細(xì)胞分裂素 1.01.25 1.50 1.75 生長(zhǎng)素0.251 234 0.55 678 0.75 9101112 有16種不同的培養(yǎng)基 一般來說，經(jīng)過這次實(shí)驗(yàn)就可能選出一種適合于你的實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)基，或許不是最好的，但結(jié)果是可靠的。在此基礎(chǔ)上可進(jìn)行培養(yǎng)基中其他成分的變動(dòng)實(shí)驗(yàn)，如可變動(dòng)蔗糖濃度、瓊脂

24、用量、培養(yǎng)基的 PH或添加某些氨基酸等。但必須掌握一個(gè)原則，就是要有理有據(jù)，特別是對(duì)一些寶貴的植物培養(yǎng)材料，更要慎之有慎。 如果上述試驗(yàn)失敗，那就要做一些更細(xì)致、更麻煩的實(shí)驗(yàn)，花費(fèi)更多的時(shí)間、人力和物力，而且最好在專業(yè)人員的指導(dǎo)下進(jìn)行，切莫根據(jù)想象來隨意設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，這樣成功的概率極小，使寶貴的植物材料丟失，或失去時(shí)機(jī)。 培養(yǎng)基的配制 配制培養(yǎng)基有兩種方法可以選擇，一是購(gòu)買培養(yǎng)基中所有化學(xué)藥品，按照需要自己配制；二是購(gòu)買商品的混合好的培養(yǎng)基基本成分粉劑，如 MS、B5等。 自己配制可以節(jié)約費(fèi)用，但浪費(fèi)時(shí)間、人力、且有時(shí)由于藥品的質(zhì)量問題，給實(shí)驗(yàn)帶來麻煩。就目前國(guó)內(nèi)的情況看，大部分還是自己配制。為

25、了方便起見，現(xiàn)以MS培養(yǎng)基為例介紹配置培養(yǎng)基的主要過程。1、配制幾種母液 （1）配制MS大量元素母液 一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時(shí)再分別稀釋100倍。 分別稱取 NH 4 NO 3 165g KH 2 PO4 17g KNO 3 190g CaCl 2 ·2H 2 O 44g MgSO 4 ·7H 2 O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。 （2）配制MS微量元素母液 一般將微量元素配制成100倍母液。 依次稱取 KI 0.083g Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 0.025g H 3 BO 3 0.62g CuS

26、O 4 ·5H 2 O 0.0025g MnSO 4 ·H 2 O 1.69g CoCl 2 ·6H 2 O 0.0025g ZnSO 4 ·7H 2 O 0.86g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。 CuSO 4 ·5H 2 O和CoCl 2 ·6H 2 O 由于稱取量很小，如果天平精確度沒有達(dá)到萬分之一，可先配成調(diào)整液。 分別稱取 CuSO 4 ·5H 2 O 0.05g CoCl 2 ·6H2O 0.05g 各自配成100ml的調(diào)整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。 （3）配制MS有機(jī)母

27、液 一般配制成100倍MS有機(jī)母液。 依次稱取 肌醇 10g 鹽酸硫胺素（VB1） 0.01g 煙酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 鹽酸吡哆醇（VB6） 0.05g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。 （4）配制MS鐵鹽母液 一般配制成100倍MS鐵鹽母液。 依次稱取 EDTA二鈉 3.73g FeSO4·7H2O 2.78g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。 所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機(jī)母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。激素母液的配制 各種生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素要單獨(dú)配制，不能混合在一起，生長(zhǎng)素類一般要先用少量95%的酒精或1當(dāng)

28、量的NaOH溶解，細(xì)胞分裂素一般要先用1當(dāng)量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。2、配制培養(yǎng)基 以配置1L MS培養(yǎng)基為例，按順序進(jìn)行如下操作： （1）先在燒杯中放入一些蒸餾水。 （2）分別取上面八種母液10ml倒入。 （3）一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。 （4）加蒸餾水用量筒定溶至1L。 （5）按設(shè)計(jì)好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對(duì)組培植物的生長(zhǎng)至關(guān)重要。所以有條件的話最好用微量可調(diào)移液器吸取，減少誤差。 （6）用精密試紙或酸度計(jì)調(diào)整PH至5.7-5.8。（有條件的話使用酸度計(jì)，比較精確） 可配1當(dāng)量的HCL和1當(dāng)量的NaOH用來調(diào)溶液

29、PH值。 1當(dāng)量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。 1當(dāng)量NaOH配制：稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。 （7）稱取5g左右瓊脂粉（質(zhì)量好的瓊脂粉）,倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。 （8）稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。 （9）放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。 （10）滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上令其冷卻凝固。 有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分 有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分包括維生素、氨基酸或某些有機(jī)混合物。維生素在某些酶系統(tǒng)中有催化作用，加速酶功能的發(fā)揮。硫氨素（維生素 B1）可能是幾乎所有植物都

30、需要的一種維生素，缺少維生素B1時(shí)離體培養(yǎng)的根就不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)十分緩慢。維生素B1常常以鹽酸鹽的形式即鹽酸硫胺素加入培養(yǎng)基中。鹽酸吡哆醇（維生素B6）和煙酸可能有刺激生長(zhǎng)的作用。在細(xì)胞分裂素濃度低于0.1mg/L的情況下特別需要添加維生素B1，在細(xì)胞分裂素濃度高于0.1mg/L時(shí)，煙草細(xì)胞在沒有維生素B1的培養(yǎng)基上亦可緩慢生長(zhǎng)，這表明細(xì)胞分裂素可能有誘導(dǎo)植物合成維生素B1的作用。除維生素B1、維生素B6之外，在部分培養(yǎng)基中還添加維生素BX（氨酰苯甲酸）、維生素C（抗壞血酸）、維生素E（生育酚）、維生素H（生物素）、維生素B12（氰鈷胺酸）、維生素BC（葉酸）、維生素B2（核黃素）、泛酸鈣和氯化

31、膽堿等維生素。除葉酸外各種維生素都溶于水，葉酸需要先用少量稀氨水溶解，再加蒸餾水定容。甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（環(huán)己六醇）也是一些培養(yǎng)基的添加成分。另外，在某些植物或某些組織的培養(yǎng)中還加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麥芽浸出物、西紅柿汁和酵母浸出物等。這些可能對(duì)某些植物或植物的某些代謝過程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式參與由Ca介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。無機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分 無機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分就是人們平常所說的礦物質(zhì)、無機(jī)鹽或無機(jī)元素。它們?cè)谥参锷钪芯哂蟹浅Ｖ匾淖饔?，如氮?N）、硫（S）、磷（P）是蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸和許多生物催化劑即酶的主要或重要組分。它們與蛋白質(zhì)、氨基酸、

32、核酸和酶的結(jié)構(gòu)、功能、活性等有直接的不可缺少的關(guān)系。氮占蛋白質(zhì)含量的16%-18%，在植物生命活動(dòng)中占有首要的地位，故又稱為生命元素。磷是能量貨幣腺苷三磷酸（ATP）的主要成分之一，與全部生命活動(dòng)緊密相連，在糖代謝、氮代謝、脂肪轉(zhuǎn)變等過程中不可缺少。鉀對(duì)于參與活體內(nèi)各種重要反應(yīng)的酶起著活化劑的作用，鉀供應(yīng)充分時(shí)糖類合成加強(qiáng)，纖維素和木質(zhì)素含量提高，莖稈堅(jiān)韌，植株健壯。胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸中都含有硫，這些氨基酸幾乎是所有蛋白質(zhì)的構(gòu)成分子。鎂離子（Mg 2+ ）是葉綠素分子結(jié)構(gòu)的一部分，缺少鎂，葉綠素就不能形成，葉子就會(huì)失綠，就不能進(jìn)行光合作用。鎂也是染色體的組成成分，在細(xì)胞分裂過程中

33、起作用。鈣是細(xì)胞壁的組分之一，果膠酸鈣是植物細(xì)胞胞間層的主要成分，缺鈣時(shí)細(xì)胞分裂受到影響，細(xì)胞壁形成受阻，嚴(yán)重時(shí)幼芽、幼根會(huì)潰爛壞死。現(xiàn)代生物學(xué)研究還證明鈣是植物體內(nèi)的信號(hào)分子（信使）之一，在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成的Ca2+·CaM復(fù)合體，能活化各種酶，調(diào)節(jié)植物對(duì)外界環(huán)境的反應(yīng)與應(yīng)答過程。 根據(jù)植物對(duì)這些元素要量的不同或者根據(jù)目前植物培養(yǎng)基中添加的這些元素量的大小，可將它們分成大量元素和微量元素。大量元素一般指在培養(yǎng)基中的濃度大于0.5mmol/L的元素，微量元素指小于0.5mmol/L的元素。1、大量元素 主要包括氮、磷、鉀、鈣、鎂和硫六種。其中，氮常

34、以硝態(tài)氮（NO 3- ）或氨態(tài)氮（NH 4+ ），或兩者相互配合的形式存在。缺氮時(shí)某些植物的愈傷組織會(huì)出現(xiàn)一種很引人注目的花色素苷的顏色，愈傷組織內(nèi)部不能形成導(dǎo)管。鎂常MgSO 4 ·7H 2 O的形式，既提供了鎂也提供了硫。硫還有用Na2SO4的形式提供，不過其中的鈉（Na）對(duì)植物并不是必需的，或者說常常是不利的。磷常以NaH 2 PO 4 ·H 2 O,KH 2 PO 4 或（NH 4 ）H 2 PO 4 的形式提供。鉀常以KCl、KNO 3 或KH 2 PO 4 形式。鈣常以CaCl 2 ·2H 2 O、Ca（NO 3 ） 2 ·4H 2 O或其無

35、水形式提供。缺硫時(shí)培養(yǎng)的植物組織會(huì)明顯的退綠；缺磷或鉀時(shí)細(xì)胞會(huì)過度生長(zhǎng)，愈傷組織表現(xiàn)出極其蓬松狀態(tài)。 （1）N 是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，是生命不可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時(shí)以硝態(tài)氮（NO 3- ）或氨態(tài)氮（NH 4+ ）兩種形式供應(yīng)。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有硝態(tài)氮（NO 3- ）又含有氨態(tài)氮（NH 4+ ）。氨態(tài)氮（NH 4+ ）對(duì)植物生長(zhǎng)較為有利。供應(yīng)的物質(zhì)有KNO 3 、NH 4 NO 3 等。有時(shí)，也添加氨基酸來補(bǔ)充氮素。 （2）P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)

36、添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對(duì)N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH 2 PO 4 或NaH 2 PO 4 等。 （3）K 對(duì)碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。K增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對(duì)胚的分化有促進(jìn)作用。但濃度不易過大，一般為1-3mg/L為好。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCl、KNO3等鹽類提供。 （4）Mg、S和Ca、Mg 是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO 4 .7H 2 O提供。用量為1-3mg/L較為適宜；Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ca對(duì)細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯

37、著作用，常以CaCl 2 .2H 2 9提供。2、微量元素 培養(yǎng)基的微量元素主要包括鐵（Fe）、錳（Mn）、銅（Cu）、鋅（Zn）、氯（Cl）、硼（B）和鉬（Mo）等。這些元素有的對(duì)生命活動(dòng)的某個(gè)過程十分有用，有的對(duì)蛋白質(zhì)或酶的生物活性十分重要，有的是參與某些生物過程的調(diào)節(jié)。Fe有兩個(gè)重要功能，作為酶的重要組成成分和合成葉綠素所必需，缺鐵時(shí)細(xì)胞分裂停止。Mn對(duì)糖酵解中的某些酶有活化作用，是三羧酸循環(huán)中某些酶和硝酸還原酶的活化劑。B能促進(jìn)糖的過膜運(yùn)輸，影響植物的有性生殖如花器官的發(fā)育和受精作用。B還具有抑制有毒的酚類化合物的形成的作用，改善某些植物組織的培養(yǎng)狀況，缺硼時(shí)細(xì)胞分裂停滯，愈傷表現(xiàn)出老

38、化現(xiàn)象。Zn是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等的活化劑。Cu是細(xì)胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影響氧化還原過程。Mo是硝酸還原酶和鉬鐵蛋白的金屬成分。Cl在光合作用的水光解過程中起活化劑的作用，促進(jìn)氧的釋放和還原NADP（輔酶II）。為了某些植物組織培養(yǎng)的特殊需要有人還把鈉（Na）、鎳（Ni）、鈷（Co）、碘（I）等也加入微量元素的行列。Na對(duì)某些鹽生植物、C4植物和景天酸代謝植物是必需的。Ni對(duì)尿酸酶（urease）的結(jié)構(gòu)和功能是必需的。但是有些成分的作用至今還不十分清楚，可人們?nèi)匀话阉鼈兗尤肱囵B(yǎng)基中，如碘（I）和鈷（Co）等。鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶

39、、過氧化氫酶等的組成成分。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對(duì)胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。鐵作為一種微量元素，對(duì)植物也是必需的，但由于Fe的特殊性質(zhì)，即很不穩(wěn)定、易沉淀，需要在酸性條件下才能比較穩(wěn)定，故在培養(yǎng)基配制時(shí)常常把Fe鹽單獨(dú)配制，且常以螯合物的形式，把FeSO 4 和它的螯合劑乙二胺四乙酸鈉（Na 2 EDTA）先分別配成溶液，再相互混合使形成螯合鐵，以防沉淀和幫助被植物吸收。但EDTA可能對(duì)某些酶系統(tǒng)和培養(yǎng)物的形成發(fā)生有一定的作用，使用時(shí)應(yīng)慎重。 為了使用方便，無論是大量元素還是微量元素都常常是先配制成母液（即比實(shí)際培養(yǎng)基中的使用濃度高的儲(chǔ)存液），儲(chǔ)存在4度冰

40、箱內(nèi)或在室溫下短期存放。 總之，植物必需營(yíng)養(yǎng)元素可組成結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可是具有生理活性的物質(zhì)，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。此外，在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學(xué)方面起著重要作用。當(dāng)某些營(yíng)養(yǎng)元素供應(yīng)不足時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。如缺氮，會(huì)表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫，表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；卻錳或鉬，則影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)。 碳水化合物 所有的植物組織培養(yǎng)基都需要有碳水化合物作為能源，但當(dāng)培養(yǎng)物通過光合作用提供的CO2能足以維持生長(zhǎng)時(shí)可不在培養(yǎng)基上加碳源，這種情況是很少見的。用作碳源的碳水化合物通常為蔗糖或D-葡萄糖，用量通常為

41、2%-4%，高者可達(dá)5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般應(yīng)增加用量，而且最好用比較固定的廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。在改用一批新的市售白糖時(shí)最好先做預(yù)試，以防在大量使用時(shí)出現(xiàn)問題，傷害培養(yǎng)材料，造成不必要的損失，因?yàn)槭惺郯滋鞘且环N混合物，成分復(fù)雜且不穩(wěn)定。幾乎所有的培養(yǎng)物在蔗糖作為碳源時(shí)生長(zhǎng)都比較好，只有少數(shù)植物或組織在葡萄糖或果糖作為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更合適。也有用麥芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇和乳糖作為碳源的。蔗糖在經(jīng)高溫滅菌后，會(huì)發(fā)生部分降解，產(chǎn)生D-葡萄糖和D-果糖等，與用過濾法滅菌相比，可能會(huì)出現(xiàn)一些不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但這并不說明高溫滅菌與過濾滅菌哪一種方式更好。如果要進(jìn)行比較

42、嚴(yán)格、精確的實(shí)驗(yàn)，最好用過濾法滅菌蔗糖，除此之外在大部分情況下可與培養(yǎng)基一起進(jìn)行高溫滅菌。研究表明蔗糖不僅作為碳源影響到培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況，而且在某些情況下還會(huì)影響到細(xì)胞的分化，如在進(jìn)行葉用萵苣的髓細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，誘導(dǎo)木質(zhì)部分化的適宜濃度為2g/L，但要讓木質(zhì)部進(jìn)一步發(fā)育則最好再提高蔗糖濃度，這樣才能更有利于木質(zhì)部的形成。木質(zhì)部成分的分化，特別是管胞分子的分化形成，往往是器官發(fā)生的先決條件。 蔗糖、葡萄糖、白糖等的純度問題，現(xiàn)在也引起人們的注意，因?yàn)樵诮Y(jié)晶時(shí)，它們往往包藏有恒量的有機(jī)物如氨基酸等，這些雖然不會(huì)使實(shí)驗(yàn)受到很大影響，但有時(shí)可能影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，在使用時(shí)應(yīng)稍加留神。 糖的種類和用量是植

43、物組織培養(yǎng)能否成功的重要因素之一。蔗糖的作用具有普遍性和廣泛性，這一點(diǎn)已無人懷疑。近年來，其它糖類在植物組織培養(yǎng)中的作用引起很大關(guān)注。在淀粉作為凝固劑的培養(yǎng)基中加入12%蜜二糖，比只加8%蔗糖的大麥花粉培養(yǎng)基產(chǎn)生胚狀體的頻率高35倍，可高達(dá)40%。乳糖、麥芽糖、半乳糖和甘油均可顯著促進(jìn)培養(yǎng)的柑橘的胚狀體發(fā)生。麥芽糖、麥芽浸出物和果糖對(duì)苜蓿胚狀體發(fā)生的促進(jìn)作用均大于蔗糖。葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖和蔗糖對(duì)培養(yǎng)的煙草原生質(zhì)體再生都有促進(jìn)作用，半乳糖則有抑制作用。麥芽糖可明顯提高培養(yǎng)的大麥花藥的綠苗產(chǎn)率，而蔗糖、果糖和葡萄糖單獨(dú)或麥芽糖混合使用，均不利胚狀體的生長(zhǎng)。 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)

44、是一些調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)。植物生長(zhǎng)物質(zhì)可分為兩類：一類是植物激素；另一類是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。植物激素是指自然狀態(tài)下植物體內(nèi)合成，并從產(chǎn)生處運(yùn)送到別處，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生顯著作用的微量（1微摩爾/升以下）有機(jī)物；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是指一些具有植物激素活性的人工合成的物質(zhì)。但在平常工作中人們并沒有將它們嚴(yán)格區(qū)分開來，而籠統(tǒng)稱之為“激素”、“植物激素”或“植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)”。這類物質(zhì)既可以刺激植物生長(zhǎng)，也可以抑制植物的生長(zhǎng)，對(duì)植物的生命活動(dòng)真正起到調(diào)節(jié)作用。在植物組織培養(yǎng)中使用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類兩大類，少數(shù)培養(yǎng)基中還添加赤霉素GA3等。1、生長(zhǎng)素 生長(zhǎng)素在植物體中的合成部位是葉原基

45、、嫩葉和發(fā)育中的種子。成熟葉片和根尖也產(chǎn)生很微量的生長(zhǎng)素。在植物組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素主要被用做誘導(dǎo)刺激細(xì)胞分裂和根的分化。在植物組織培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)素有：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），P-CPA（對(duì)氯苯氧乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），2，4，5-T（2，4，5-三氯苯氧乙酸）等。NAA有 -和-兩種形式，是由人工合成的，培養(yǎng)基中總是用-型，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)總是說加-萘乙酸。與IBA相比，NAA誘發(fā)根的能力較弱，誘發(fā)的根少而粗，但對(duì)某些植物如楊樹等卻具有很好的效果，IBA在根的誘導(dǎo)與生長(zhǎng)上作用強(qiáng)烈，作用時(shí)間長(zhǎng)，誘發(fā)的根多而長(zhǎng)，特別有效

46、，但也不可一概而論。IBA是天然合成的生長(zhǎng)素，可被光迅速溶解或被酶所氧化，由于培養(yǎng)基中可能有氧化酶存在，所以在使用濃度上應(yīng)相對(duì)較高（1-30mg/L）。對(duì)愈傷組織增殖最有效的是2，4-D，特別是對(duì)單子葉植物，10-7-10-5mol/L即可以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷，常常不需再加細(xì)胞分裂素。但2，4-D是一種極有效的器官發(fā)生抑制劑，不能用于啟動(dòng)根和芽分化的培養(yǎng)基中。2、細(xì)胞分裂素 細(xì)胞分裂素是腺嘌呤（adnine,也叫6-氨基嘌呤的衍生物。腺嘌呤的第6為氨基、第2位碳原子和第9位氮原子上的氫原子可以被不同的基團(tuán)所取代，當(dāng)被取代時(shí)就會(huì)形成各種不同的細(xì)胞分裂素，因此，確切的講應(yīng)該叫細(xì)胞分裂素類物質(zhì)。植物和微生

47、物中都含有細(xì)胞分裂素。細(xì)胞分裂素在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均可表現(xiàn)出它的調(diào)節(jié)作用，由于它是一種腺嘌呤的衍生物，所以人們聯(lián)想到它的調(diào)節(jié)作用，由于它的調(diào)節(jié)作用可能對(duì)核酸的影響有關(guān)。它可以影響某些酶的活性，可以影響植物體內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸，可以調(diào)控細(xì)胞器的發(fā)生，還可以打破某些植物種子的休眠和延緩葉片的衰老。現(xiàn)代生物學(xué)研究初步證明，細(xì)胞分裂素可以結(jié)合到高等植物的核糖核蛋白體上，促進(jìn)核糖體與mRNA的結(jié)合，加快翻譯速度，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成。它還可以與細(xì)胞膜和細(xì)胞核結(jié)合，影響細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)與分化。在tRNA分子的反密碼子附近發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞分裂素的結(jié)合位點(diǎn)，這可能預(yù)示著細(xì)胞分裂素在基因表達(dá)的翻譯水平上具有調(diào)節(jié)作

48、用，其實(shí)，細(xì)胞分裂素本身就是rRNA的組成部分，植物tRNA中的細(xì)胞分裂素就有異戊烯基腺苷、反式玉米素核苷、甲硫基異戊烯基腺苷和甲硫基玉米素核苷等數(shù)種。 自然情況下，細(xì)胞分裂素主要在根中合成，但根并不是唯一的合成部位，莖端、萌發(fā)中的種子、發(fā)育中的果實(shí)和種子也能合成。 在組織培養(yǎng)中使用細(xì)胞分裂素的主要目的是刺激細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的分化、葉片擴(kuò)大和莖長(zhǎng)高，抑制根的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基中經(jīng)常使用的天然的細(xì)胞分裂素主要有：從甜玉米未成熟種子或其他植物中分離到的玉米素6-（4-羥基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基）嘌呤。人工合成的細(xì)胞分裂素主要有激動(dòng)素（KT，6-呋喃氨基嘌呤）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、2IP（

49、異戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。細(xì)胞分裂素常常與生長(zhǎng)素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長(zhǎng)，細(xì)胞分化和器官形成。3、赤霉素 主要是GA3，雖然已經(jīng)用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究，但在培養(yǎng)基中很少添加，因?yàn)樗淖饔猛秦?fù)面的。雖然也有赤霉素能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株的報(bào)道，但在使用中仍需慎重，不可輕易添加。如果想在實(shí)驗(yàn)中添加赤霉素，則必須先用一些不重要的材料做預(yù)試，待獲得肯定結(jié)果時(shí)再用于正式實(shí)驗(yàn)。4、乙烯 乙烯的作用逐漸引起重視，它在芽的誘導(dǎo)和管胞分化上具有一定作用，管胞分化往往又是器官發(fā)生的基礎(chǔ)。乙烯單獨(dú)地或與CO2共同加入瓶中以代替BA或BA+

50、2，4-D的作用，促進(jìn)水稻愈傷組織芽的生長(zhǎng)，CO2對(duì)乙烯促芽的促進(jìn)作用明顯，AgNO3可逆轉(zhuǎn)乙烯和2，4-D的抑制作用，促進(jìn)小麥愈傷組織生芽。在有IAA和KT時(shí)乙烯促進(jìn)Wigitalis obscura芽的形成。乙烯對(duì)芽形成的這種相對(duì)獨(dú)立的效果不只是因?yàn)榉N的差異，也與不同發(fā)育時(shí)期植物對(duì)乙烯的敏感性不同有關(guān)。如煙草的組織隨著培養(yǎng)時(shí)間而對(duì)乙烯的敏感性有變化，在培養(yǎng)早期促進(jìn)芽的發(fā)端，后期則起抑制作用。溫度可以影響乙烯的產(chǎn)生量，25-35下產(chǎn)生量較高，可促進(jìn)水稻培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生根，15或40下產(chǎn)生量降低，不生根。番茄葉圓片培養(yǎng)時(shí)，乙烯抑制IAA誘導(dǎo)的生根。一般說來，依稀抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，非胚性愈傷組織比

51、胚性愈傷組織產(chǎn)生更多的乙烯。在懸浮培養(yǎng)中，乙烯對(duì)細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期有雙向作用。由于乙烯是一種簡(jiǎn)單的不飽和碳?xì)浠衔?，在生理環(huán)境的溫度和壓力下，是一種氣體，比空氣輕，實(shí)驗(yàn)中很難掌握用量，所以一般不使用。高等植物各器官都能產(chǎn)生乙烯，但不同組織、不同器官和不同發(fā)育時(shí)期，乙烯的釋放量不同。在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)的植物組織也會(huì)產(chǎn)生乙烯，如果封口用的是不透氣的塑料膜，容器內(nèi)就會(huì)逐漸積累乙烯，嚴(yán)重時(shí)可引起培養(yǎng)物的死亡。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)乙烯的積累量因植物種類而不同，小麥的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物24H中每克干重可產(chǎn)生乙烯5nmol,水稻的為6nmol，亞麻的可高達(dá)900nmol。煙草的愈傷組織產(chǎn)生的乙烯量比胡蘿卜的高400倍。 瓊脂

52、或其他支持物 除液體懸浮培養(yǎng)外，所有的培養(yǎng)物都應(yīng)生長(zhǎng)在固定或半固定的培養(yǎng)基上以防止培養(yǎng)物沉入液體培養(yǎng)基，因缺氧而死亡。就目前情況而言，瓊脂是一種極為理想的支持物。它是由海藻得來的多糖類物質(zhì)，但并不是培養(yǎng)基中的必需成分，只是作為一種凝固膠黏劑使培養(yǎng)基變成固體或半固體狀態(tài)，以支撐培養(yǎng)物，雖然瓊脂只是作為一種膠連物，但由于其生產(chǎn)方式和廠家不同而可能含有數(shù)量和種類不等的雜質(zhì)，如Ca、Mg、Fe、硫酸鹽等，從而可能影響到培養(yǎng)效果或某些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在選擇瓊脂時(shí)，最好固定廠家，但國(guó)內(nèi)尚沒有一個(gè)比較穩(wěn)固的生產(chǎn)廠家提供優(yōu)質(zhì)瓊脂。雖然市售的瓊脂或瓊脂條價(jià)格便宜，可以使用，但其帶來的潛在副作用可能是組培失敗或中途夭

53、折的主要原因。建議在經(jīng)濟(jì)條件允許的情況下，建議買進(jìn)口、固定廠家的商品。瓊脂的使用濃度取決于培養(yǎng)目的，使用的瓊脂性能（胨力張度、灰分、熱水中不溶物、粗蛋白等）等因素，一般濃度為0.4%-1%，質(zhì)量越差的瓊脂用量越大。除瓊脂外，為了更好的調(diào)控培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，現(xiàn)在發(fā)展的趨勢(shì)是使用一種含有瓊脂的混合物作為固體膠連劑，如Sigma公司生產(chǎn)的Agargel就是用瓊脂和Phytagl混合在一起的一種新型膠連劑，可以用來控制培養(yǎng)物的玻璃化。 培養(yǎng)基中添加瓊脂使培養(yǎng)基呈固體或半固體狀態(tài)，使培養(yǎng)物能夠處于表面，既能吸收必需的養(yǎng)分、水分，又可不致因缺氧而死亡。但固體或半固體狀態(tài)，一方面限制了培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分和水的移動(dòng)

54、；另一方面也限制了培養(yǎng)的植物組織分泌物，特別是有毒代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散，使有培養(yǎng)物周圍的營(yíng)養(yǎng)成分逐漸匱乏，代謝產(chǎn)物逐漸積累，植物生長(zhǎng)受阻或受到毒害。為了解決這個(gè)問題，人們?cè)囼?yàn)使用其他支持物來代替瓊脂。濾紙橋法即是一種，該法是將一張較厚的濾紙折疊成M型，放入液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)的植物組織放在M的中間凹陷處，這樣培養(yǎng)物可通過濾紙的虹吸作用不斷吸收營(yíng)養(yǎng)和水分，又可保持有足夠的氧氣。在此基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了一種類似與“看護(hù)”培養(yǎng)的方法，即在濾紙橋的中間凹陷處加一種固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基中也可混有分散的植物細(xì)胞團(tuán)，將材料放在固體培養(yǎng)基上，再把濾紙放入另一種液體培養(yǎng)基中，用兩種不同的培養(yǎng)基同時(shí)培養(yǎng)材料，可收到較好

55、的效果?，F(xiàn)在也有用玻璃纖維濾器或人工合成的聚酯羊毛代替瓊脂的試驗(yàn)中人們或許能受到一些啟發(fā)，即培養(yǎng)基中添加瓊脂的目的主要是為了支持培養(yǎng)物，只要達(dá)到這個(gè)目的，可選用不同的材料和方法進(jìn)行代替瓊脂的試驗(yàn)。需要考慮的主要問題是，這種材料必須無毒害作用，且不被培養(yǎng)的植物組織所吸收，不與培養(yǎng)液成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 瓊脂作為支持物或凝固劑對(duì)絕大部分植物都是有利的或者說是無害的，但也有一些報(bào)道說瓊脂對(duì)某些培養(yǎng)物不利。在馬鈴薯、胡蘿卜、煙草、小麥等作物組培中，均發(fā)現(xiàn)以淀粉代替瓊脂更有利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和分化。但是，目前情況下還沒有哪種支持物比瓊脂更優(yōu)越。 其他添加劑 為了特殊的培養(yǎng)目的，在一部分培養(yǎng)基中還添加了一些特

56、殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，甲硫氨酸（蛋氨酸）， L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸等氨基酸，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西紅柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁，活性炭，滲透調(diào)節(jié)劑等。添加少量甲硫氨酸有促進(jìn)乙烯合成和刺激木質(zhì)部發(fā)生的作用，但添加多種氨基酸后往往有制止生長(zhǎng)的作用，這可能是由于各種氨基酸之間的相互競(jìng)爭(zhēng)而引起的。對(duì)天然提取物的應(yīng)用雖然有不同觀點(diǎn)，有的主張使用，有的主張不使用，因?yàn)槠錉I(yíng)養(yǎng)成分和作用無法弄明白，但在用已知化學(xué)物質(zhì)無法達(dá)到目的時(shí)，適當(dāng)使用一些天然混合物，的確使一些用常規(guī)培養(yǎng)方法沒有獲得愈傷或不能誘導(dǎo)再生的植物產(chǎn)生了愈傷和分化形成植株。1、活性炭 活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉末結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松、孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力。粒度越小，吸附能力越大。溫度低吸附能力強(qiáng)，溫度高吸附能力弱，甚至解吸附。通常使用濃度為0.5-10g/L。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5-羥甲基糖醛及激素等。 莖尖初代培養(yǎng)，假如適量活性炭，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，其效力優(yōu)于VC和半胱氨酸；在新梢增殖階段，活性炭可明顯促