Roche LightCycler 480 中文操作說明

1、LightCycler 480 中文操作說明LightCycler® 480 中文操作說明 羅氏醫(yī)學儀器公司 / 應用科學部門February 2008 目錄 一. 啟動機器與軟件3二. 軟件設定 - 開啟新實驗5三. 樣品編輯9四. 結果分析12五. 報告18六. 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計算機(數(shù)據(jù)輸出與輸入)19七. 使用者管理19一 啟動機器與軟件· 啟動機器1. 機器主開關位于機器右后方。 2. 機器正面兩個警示燈代表機器狀態(tài)。待警示燈 (右) 由閃爍橘色燈轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定橘色燈，警示燈 (左) 由橘色轉(zhuǎn)變成綠色 (約三分半鐘)，表示機器已經(jīng)啟動完成。左警示燈右警示燈機器狀態(tài)橘

2、*閃爍*橘 *閃爍*正在初始化綠橘機器啟動完成96/384孔盤還未放入綠橘 *閃爍*96/384 孔盤正在放入中綠綠機器啟動完成96/384 孔盤已經(jīng)放入綠 *閃爍*綠 *閃爍*實驗進行中3. 按壓機器正面上唯一的按鈕，放入已經(jīng)封膜完成之 96 或 384 孔盤。放置完成后，左右兩警示燈都呈現(xiàn)綠色。 · 啟動軟件1. 開啟計算機，并以正確的使用者名稱與密碼登入 Windows。User name: OPERATORPassword: LC4802. 開啟 LightCycler 480 軟件，并輸入正確的使用者與密碼。 二軟件設定- 開啟新實驗· 設定新實驗1. 軟件開啟后

3、，會進入主畫面。點選 “New Experiment”。2. 出現(xiàn)實驗設定窗口。任何時候需要回主畫面的話，點選畫面右邊的按鈕。· 設定實驗v 若要套用設定好的實驗步驟 (Template)，請?zhí)?6.。1. 在實驗設定畫面上方，先選擇適當?shù)?Detection Format。選項包含: 另外可再點選 “Customize” 勾選所需的濾片組合。2. 輸入反應體積: 96 well plate 范圍為 10-100 ul，而 384 well plate 范圍為 5-20 ul。3. 設定實驗步驟 (Program)· 設定 program，包含有 Pre-incubati

4、on, Amplification (PCR), Melting curve (optional) 與 Cooling。利用 +與 增加或刪除步驟。· 設定循環(huán)數(shù)目 (Cycle) 與分析模式。通常 Amplification (PCR) program設定成 Quantification，而 Melting Curve program 設定成Melting Curve。4. 設定詳細溫度變化 (依照不同實驗方法與設計而有所不同)· 點選各個 program 即可設定詳細溫度變化步驟，請根據(jù)產(chǎn)品說明書來設定，利用 +與 增加或刪除步驟。需要設定的參數(shù)包含 Target ()

5、 目標溫度，Acquisition Mode (熒光偵測模式)，Hold (hh:mm:ss) 停留時間。Ramp Rate (/s) 為升降溫速度，范圍如下：Ramp Rate (/s)Heating upCooling down96-well Block1.0 4.4 /s1.0 2.2 /s384-well Block1.0 4.8 /s1.0 2.5 /sv 若設定溫度低于 50，請把 Ramp Rate 調(diào)整成 1.5/s (96 well) 或 2.0/s (384 well)。5. 將實驗步驟儲存成 Template以便下次進行套用。點選左下角 “Save As Template

6、” 即可把此步驟儲存起來。6. 若要進行套用時，請直接點選窗口左下角 “Apply Template” ，選擇欲套用之實驗步驟即可。7. 設定完成后點選 “Start Run” 開始進行實驗。8. 跳出檔案儲存窗口，請輸入欲儲存之文件名稱。v 實驗進行中會進入另一個 Data窗口，窗口下方按鍵功能如下：ü End Program : 結束此 Program, 進入下一個 Program。ü + 10 Cycles : 實時增加循環(huán)數(shù)目。ü Abort Run: 馬上結束此實驗，請注意，若按此鍵，則此次實驗的結果將不儲存。三樣品編輯· 將樣品分群1. 點選

7、窗口左邊的 “Subset Editor”。2. 點選 “New” 新增新的群組，并將其命名。3. 利用鼠標選取此群組之樣品位置，點選窗口右下角 “Apply” ，此時被選取的樣品位置會呈現(xiàn)實心的藍色，如下圖。 4. 以此方式依序?qū)⑺袠悠啡航M編輯完畢。v 樣品必須分群才能夠獨立分析，但是樣品是否分群并不影響樣品的 Cp 值。· 編輯樣品名稱1. 點選窗口左邊的 “Sample Editor”。2. 輸入每個位置之樣品名稱 (Name)與重復 (Repl. Of)。3. 若要更快速輸入，可直接在左邊的圖上點選欲編輯之樣品：v 若 A1, A2 與 A3 為三重復，在A2 與 A3 R

8、epl. Of 字段上都填上A1 即為三重復。v 在編輯過程中，可利用Ctrl+C復制文字，Ctrl+V貼上文字。4. 根據(jù)實驗分析模式，編輯 Abs Quant (絕對定量)，Rel Quant (相對定量)，或 Genotyping 分頁，設定 Sample Type。20絕對定量 (Abs Quant)： Unknown:未知濃度樣品Standard: 已知濃度標準品相對定量 (Rel Quant)：Target: 目標基因Reference: 參考基因Calibrator: Control 樣品Standard: 已知濃度的樣品Unknown:未知濃度樣品v 其它分析模式之分頁在此不贅

9、述，請自行參考 LightCycler 480 Instrument Operators Manual。5. 若設定成 Standard之樣品請輸入濃度。6. 若想要將此樣品編輯儲存成 Template，可點選窗口左下角 “Save As Template” 即可，下次實驗時可點選 “Apply Template” 進行套用。四結果分析· 點選左邊的 “Analysis”，選取分析模式，并選擇所需分析之群組，如下圖：3.2.1.分析模式說明Abs Quant / 2nd Derivative Max絕對定量 (自動法)Abs Quant / Fit Points絕對定量 (手動法)C

10、olor Compensation色差校正 (多色實驗校正用)Gene Scanning基因掃描 (適用于High Resolution Melting Curve, HRM 分析)Genotyping基因分型 (適用于 HybProbe 之基因分型實驗)Relative Quantification相對定量Tm CallingTm 分析· 絕對定量 (Absolute Quantification)1. 點選下方的 “Calculate” 即可得到樣品之 Cp 與標準曲線。各個樣品之 Cp 值與濃度重複樣品平均後之Cp值與濃度, 並自動計算標準差2. 數(shù)值之數(shù)據(jù)輸出: 在數(shù)值分析表

11、上按鼠標右鍵，點選 “Export” 即可輸出成 .txt 檔案格式?？芍苯右?Microsoft Excel 軟件開啟。3. 圖形輸出: 在圖形上按鼠標右鍵，點選 “Export” 即可輸出成各種圖形檔案格式。4. 標準曲線儲存: 點選窗口下方 Std Curve之 “Save as external” ，輸入適合檔名后即可儲存在數(shù)據(jù)庫中。· 相對定量 (Relative Quantification)1. 在選擇相對定量分析后，出現(xiàn)下面窗口： v Reference Sample Location: 若 Reference (Housekeeping gene) 之樣品在同一盤上

12、請選擇 “In-Run”，否則請選擇 “External” 可輸入另一次實驗的數(shù)據(jù)一起分析。v 建議將 Auto Pair 打勾讓計算機自動將樣品配對。2. 進入 Target與 Reference分頁，右下角顯示 “Eff = 2” 表示將目標基因與參考基因的 PCR 效率以 2.0 來計算。 3. 若需要校正目標基因與參考基因之 PCR 效率，則需要輸入標準曲線。在Target與 Reference分頁之右下角，輸入 (import) 標準曲線。 v Use in run：輸入 (import) 同一盤上之標準曲線。v Use external：輸入 (import) 之前已儲存于數(shù)據(jù)庫中

13、之標準曲線。4. 點選 Pairing分頁，檢查計算機自動配對結果是否正確。其中，紅色表示 Unknown樣品，綠色表示 Calibrator 樣品。若欲外加配對，則可直接以鼠標點選樣品后按 “Add” 即可增加配對。5. 點選 Results分頁，點選 “Calculate” 即可得到計算結果。 6. 數(shù)值和圖形輸出與絕對定量相同。(請參考絕對定量)· 基因分型 (Genotyping)1. 進入基因分型的窗口中。 2. 窗口右下角可設定分類方式v Auto Group：自動分組v In-run：標準品包含在本次實驗中v External：標準品在之前已儲存之實驗中3. 點選 “Calculate” 即可得到分型結果。· Tm 分析 (Tm Calling)1. 進入 Tm 分析窗口 2. 確認波峰數(shù)目3. 選擇檢測模式4. 點選 “Calculate即可得到每個樣品之 Tm 值。五報告 (Report)1. 將分析后結果儲存后即可點選報告鍵。 數(shù)據(jù)儲存報告2. 勾選想要呈現(xiàn)的報告內(nèi)容。3. 點選 “Generate” 即可產(chǎn)生報告。4. 點選 “PDF” 即可將此報告儲存成 .pdf 檔案格式。 六數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計算機 (數(shù)據(jù)輸出與輸入)· 數(shù)據(jù)輸出1. 點選 (navigator)2. 點選所要輸出的實驗檔案，點選 即可將