下呼吸道感染細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)范

1、下呼吸道感染細(xì)下呼吸道感染細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)范菌學(xué)檢驗(yàn)操作規(guī)范 臨床通常將正常人喉以上部位稱(chēng)之為上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而氣管以下包括氣管、支氣管和肺泡稱(chēng)下呼吸道，通常無(wú)菌。下呼吸道感染包括急性氣管-支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作、支氣管擴(kuò)張繼發(fā)感染及肺實(shí)質(zhì)感染（肺炎、肺膿腫）等。病原體有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體、真菌、立克次體和原蟲(chóng)等。 社區(qū)獲得性肺炎常見(jiàn)的病原菌有肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、軍團(tuán)菌、肺炎支原體和肺炎衣原體等。醫(yī)院獲得性肺炎常見(jiàn)的病原有銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌和假絲酵母

2、菌等。 下呼吸道感染患者可有發(fā)熱、咳嗽和咳痰，痰呈膿性、粘稠或血性，可伴有胸痛、氣急，肺部聞及濕羅音、白細(xì)胞總數(shù)及嗜中性粒細(xì)胞比例明顯增高，x線檢查提示肺部有炎癥性浸潤(rùn)或胸腔積液等體癥，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致感染性休克和呼吸衰竭，因此臨床診斷一般不難；細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)?zāi)苊鞔_感染病原及藥敏結(jié)果，有助于疾病治療、流行病學(xué)調(diào)查和醫(yī)院感染的監(jiān)測(cè)。臨床呼吸道標(biāo)本中常見(jiàn)的分離細(xì)菌見(jiàn)表1。表1呼吸道標(biāo)本中常見(jiàn)分離菌 革蘭陽(yáng)性菌 革蘭陰性菌 草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、 化膿性鏈球菌 表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、其他葡萄球菌 微球菌、消化鏈球菌、消化球菌、腸球菌 真桿菌、丙酸桿菌、乳酸桿菌 放線菌、奴卡菌、結(jié)核分枝桿菌 白喉

3、棒狀桿菌、類(lèi)白喉棒狀桿菌假絲酵母菌 韋榮球菌 腦膜炎奈瑟菌、其他奈瑟菌 卡他莫拉菌 肺炎克雷伯菌及其他克雷伯菌 沙雷菌、變形桿菌 大腸埃希菌及其他腸桿菌科細(xì)菌 百日咳鮑特菌、不動(dòng)桿菌 銅綠假單胞菌及其他假單胞菌屬細(xì)菌、嗜肺軍團(tuán)菌、氣單胞菌、流感嗜血桿菌、付流桿嗜血桿菌、梭桿菌 一、送檢指征 痰液標(biāo)本是臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)最常見(jiàn)的的標(biāo)本，但不是下呼吸道感染的最佳標(biāo)本。 1.咳嗽咳嗽咳痰是下呼吸道感染最常見(jiàn)的癥狀，咳嗽的性質(zhì)與痰的性狀如膿或鐵銹樣痰具有鑒別診斷意義。 2.咯血喉以下的呼吸道出血為咯血，包括泡沫血痰、鮮血和痰中帶血等。 一、送檢指征 3.呼吸困難呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。 4.發(fā)熱伴白

4、細(xì)胞增高尤其是中性粒細(xì)胞或crp明顯增高。 5.胸部影像學(xué)檢查提示有感染可能。二、標(biāo)本采集與驗(yàn)收 對(duì)可疑烈性呼吸道傳染?。ㄈ鐂ars、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者采集檢驗(yàn)標(biāo)本時(shí)必須注意生物安全防護(hù)。（一）標(biāo)本采集方法 1.自然咳痰法以晨痰為佳，采集標(biāo)本前應(yīng)用清水、冷開(kāi)水漱口或用牙刷清潔口腔和牙齒，有假牙者應(yīng)取下假牙。盡可能在用抗菌藥物之前采集標(biāo)本。用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入無(wú)菌、清潔、干燥、不滲漏、不吸水的廣口帶蓋的容器中，標(biāo)本量應(yīng)1ml?？忍道щy者可用霧化吸入加溫至45c的100g/l nacl水溶液，使痰液易于排出。對(duì)難于自然咳痰患者可用無(wú)菌吸痰管抽取氣管深部分泌物。標(biāo)本應(yīng)盡快送檢，

5、不能及時(shí)送檢的標(biāo)本，室溫保存2h。（一）標(biāo)本采集方法 2.支氣管鏡采集法、防污染毛刷采集法、環(huán)甲膜穿刺經(jīng)氣管吸引法、經(jīng)胸壁針穿刺吸引法和支氣管肺泡灌洗法，均由臨床醫(yī)生按相應(yīng)操作規(guī)程采集，但必須注意采集標(biāo)本時(shí)盡可能避免咽喉部正常菌群的污染。（一）標(biāo)本采集方法 3.小兒取痰法用彎壓舌板向后壓舌，將拭子伸入咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳痰時(shí)，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上送檢。幼兒還可用手指輕叩胸骨柄上方，以誘發(fā)咳痰。 （二）標(biāo)本驗(yàn)收與拒收 遇有不合格標(biāo)本應(yīng)及時(shí)與臨床聯(lián)系，反饋不合格標(biāo)本拒收的具體理由。 下呼吸道細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本驗(yàn)收與拒收見(jiàn)下： 1.呼吸道有大量的正常菌群存在，咽拭子、咳痰、吸出的分泌物厭氧

6、菌培養(yǎng)無(wú)意義。（二）標(biāo)本驗(yàn)收與拒收 2.申請(qǐng)單填寫(xiě)應(yīng)完整無(wú)誤。標(biāo)本標(biāo)識(shí)必須唯一，并與申請(qǐng)單相符，未標(biāo)采集時(shí)間、部位或檢驗(yàn)要求等拒收。3.痰標(biāo)本呈水樣或唾液樣，拒收。4.涂片白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)：白細(xì)胞10低倍鏡和鱗狀上皮細(xì)胞25低倍鏡，表示該標(biāo)本已污染正常菌群，建議重送標(biāo)本。（二）標(biāo)本驗(yàn)收與拒收 5.標(biāo)本容器必需符合規(guī)定，溢漏、無(wú)蓋者拒收。6.送檢時(shí)間超過(guò)2h拒收。7.同時(shí)同部位或同一天兩份相同檢測(cè)的標(biāo)本，應(yīng)與申請(qǐng)醫(yī)生協(xié)商處理。 三、實(shí)驗(yàn)室檢查（一）肉眼觀察觀察痰液的顏色、粘度、有無(wú)血絲和是否呈膿性，如見(jiàn)有顆粒存在，則應(yīng)注意可能與放線菌屬及奴卡菌屬感染有關(guān)。（二）顯微鏡檢查下呼吸道細(xì)菌學(xué)檢

7、驗(yàn)的標(biāo)本均需涂片革蘭染色進(jìn)行常規(guī)的白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞顯微鏡下計(jì)數(shù)和細(xì)菌學(xué)檢查，其目的是判別送檢的標(biāo)本是否合適做細(xì)菌培養(yǎng)，并初步判定有否病原菌、病原菌的數(shù)量及其類(lèi)別，有助于初步報(bào)告、選擇培養(yǎng)基和對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的綜合分析。推薦判別標(biāo)本合格的標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。表2 下呼吸道細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本涂片顯微鏡白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi) 細(xì)胞數(shù)低倍鏡 結(jié)果判斷 白細(xì)胞 鱗狀上皮細(xì)胞 a25 25 1025 尚合格可用于細(xì)菌培養(yǎng) c25 不合格，重送標(biāo)本 近年來(lái)推薦判別標(biāo)本合格的簡(jiǎn)單方法是痰標(biāo)本涂片鏡檢10個(gè)白細(xì)胞低倍鏡，就可判斷是基本合格并可用于細(xì)菌培養(yǎng)的標(biāo)本，尤其是白細(xì)胞減少的患者。油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)、排列和

8、染色特性，可初步推定菌屬（或種），涂片中所見(jiàn)細(xì)菌的量及吞噬細(xì)胞內(nèi)是否有細(xì)菌等，如發(fā)現(xiàn)酵母樣菌孢子、菌絲或放線菌、奴卡菌等，應(yīng)予相應(yīng)報(bào)告和繼續(xù)檢查。（三）分離培養(yǎng)痰標(biāo)本培養(yǎng)前處理不含或含粘液很少的合格標(biāo)本，可直接接種，遇有含大量粘液的標(biāo)本，應(yīng)加入等量的液化劑（如ph7.6的10g/l胰酶溶液等），放置35c待充分液化再行接種。也可加液化劑后用旋轉(zhuǎn)混勻器攪拌混勻，3000r/min離心10min，棄去上清液，取沉淀物接種。一般細(xì)菌培養(yǎng)(1)一般細(xì)菌培養(yǎng)應(yīng)同時(shí)劃區(qū)接種：1)血平板適用于分離肺炎鏈球菌和其他細(xì)菌。2)加抗生素的巧克力平板適用于分離嗜血桿菌。3)麥康凱中國(guó)藍(lán)平板適用于分離革蘭陰性桿菌。

9、(2)分離培養(yǎng)血平板和巧克力平板需置5%co2環(huán)境，麥康凱平板中國(guó)藍(lán)平板，35c需氧孵育。(3)挑取可疑菌落進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，痰及下呼吸道分泌物標(biāo)本易受到上呼吸道正常菌群的污染，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室通?？蓮乃蜋z的呼吸道標(biāo)本中分離出多種細(xì)菌，但分離的細(xì)菌是否能真正代表下呼吸道感染的病原菌，這對(duì)臨床診斷和治療感染性疾病至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)室人員在檢驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)重視判斷所分離的細(xì)菌是污染的上呼吸道正常菌群還是引起下呼吸道感染的病原菌。在實(shí)際工作中，有時(shí)也由于細(xì)菌生長(zhǎng)速度不一，如肺炎鏈球菌可能被生長(zhǎng)速度快的細(xì)菌（包括正常軍群）菌落掩蓋，不仔細(xì)觀察就會(huì)漏檢。當(dāng)在同一培養(yǎng)基上分離出多種病原菌時(shí)，應(yīng)主動(dòng)與臨床醫(yī)生

10、聯(lián)系，結(jié)合患者的臨床癥狀、痰涂片染色鏡檢及近期細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果（如近期同一病人多次分離培養(yǎng)出同一種菌）等綜合判斷所分離的多種細(xì)菌中哪一種菌可能為優(yōu)勢(shì)病原菌。當(dāng)分離的優(yōu)勢(shì)菌與涂片染色鏡檢結(jié)果相符時(shí)，優(yōu)勢(shì)菌必需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。若分離培養(yǎng)結(jié)果與涂片染色鏡檢結(jié)果不相符時(shí)，或少量生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)可疑病原菌時(shí)，也需做藥敏試驗(yàn)，但在報(bào)告中提示，此結(jié)果請(qǐng)結(jié)合臨床和涂片所見(jiàn)進(jìn)行分析。痰及下呼吸道分泌物標(biāo)本檢驗(yàn)流程見(jiàn)下圖。痰及下呼吸道標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)操作流程 痰及下呼吸道分泌物標(biāo)本 肉眼觀察及涂片革蘭染色白細(xì)胞、鱗狀上皮細(xì)胞和細(xì)菌學(xué)顯微鏡檢查 合格標(biāo)本 培養(yǎng)前處理 血平板 （5%co2環(huán)境） 巧克力平板 （5%co2環(huán)境） 麥康

11、凱平板 （需氧環(huán)境） 初步報(bào)告 不合格標(biāo)本 拒收及建議重新采集合格標(biāo)本 菌落觀察，涂片染色鏡檢 結(jié)合涂片白細(xì)胞、鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)菌學(xué)鏡檢結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果綜合分析菌種鑒定 藥敏試驗(yàn) 結(jié)合涂片白細(xì)胞、鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)菌學(xué)鏡檢與培養(yǎng)鑒定、藥敏結(jié)果綜合分析 結(jié)果報(bào)告（最終報(bào)告） 四、結(jié)果報(bào)告由于檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告的時(shí)效性，下呼吸道標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果分為初步報(bào)告和最終報(bào)告。1.初步報(bào)告應(yīng)包括標(biāo)本涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢的描述性報(bào)告（發(fā)現(xiàn)有診斷價(jià)值時(shí)應(yīng)及時(shí)向臨床口頭報(bào)告，并作相關(guān)記錄）。1)涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢的描述性報(bào)告細(xì)菌學(xué)鏡檢的描述性報(bào)告：如鏡檢見(jiàn)

12、到排列成葡萄狀的革蘭陽(yáng)性球菌，可報(bào)告“找到革蘭陽(yáng)性球菌，形似葡萄球菌”；如見(jiàn)到瓜子仁形成矛頭狀端相背，成雙排列，具有明顯莢膜的革蘭陽(yáng)性球菌時(shí)，可報(bào)告“找到革蘭陽(yáng)性球菌，形似肺炎鏈球菌”；如見(jiàn)到不易識(shí)別的細(xì)菌時(shí)則報(bào)告“找到革蘭性形細(xì)菌”；如發(fā)現(xiàn)其他有意義病原微生物存在時(shí)，應(yīng)主動(dòng)描述性報(bào)告觀察結(jié)果，并與臨床聯(lián)系和追蹤進(jìn)一步檢查。2) 白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)的描述性報(bào)告：包括白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)低倍、細(xì)胞內(nèi)是否含有細(xì)菌和胞內(nèi)細(xì)菌染色及形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。2.最終結(jié)果報(bào)告應(yīng)包括送檢標(biāo)本肉眼觀察的結(jié)果、涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢的描述性報(bào)告、分離致病菌的鑒定結(jié)果、藥敏試驗(yàn)結(jié)果。1)痰標(biāo)本涂片革蘭染色后白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌學(xué)鏡檢未發(fā)現(xiàn)有臨床診斷意義結(jié)果（可不用初步報(bào)告），細(xì)菌分離培養(yǎng)為正常菌群時(shí)，最終檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)報(bào)告“正常菌群生長(zhǎng)”。若無(wú)菌生長(zhǎng)應(yīng)報(bào)告“經(jīng)48h培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)”。有意義的培養(yǎng)基（巧克力平板、血平板），再置2天仍無(wú)可疑病原菌生長(zhǎng)時(shí)可將其棄之；但對(duì)偶然分離的“優(yōu)勢(shì)可疑病原菌”，還需做藥敏試驗(yàn)，并及時(shí)與臨床聯(lián)系，最終檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括標(biāo)本肉眼觀察結(jié)果、涂片革蘭染色白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)菌學(xué)鏡檢的描述性報(bào)告、細(xì)菌鑒定的規(guī)范細(xì)菌名稱(chēng)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果。但應(yīng)提示所報(bào)告的結(jié)果請(qǐng)結(jié)合臨床進(jìn)