高壓液相色譜課件

1、高壓液相色譜PPT課件第九章 高壓液相色譜高壓液相色譜PPT課件n高壓液相色譜 （High Performance Liquid Chromatograph 簡稱HPLC）又稱高速或高效液相色譜高壓液相色譜PPT課件高壓液相色譜PPT課件1）吸收了普通液相層析和氣相色譜的優(yōu)點(diǎn)；2）它既有普通液相層析的功能（可在常溫下分離制備水溶性的物質(zhì)），又有氣相色譜的特點(diǎn)（即高壓、高速、高分辨率和高靈敏度）；3）適用于很多不易揮發(fā)，難熱分解物質(zhì)（如金屬離子、蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、單糖、寡糖和激素等）的定性和定量分析及其制備和分離。 優(yōu)點(diǎn)：高壓液相色譜PPT課件現(xiàn)代高效液相色譜法

2、的特點(diǎn)：1）高壓：工作壓力高達(dá)20MPa30MPa2）高速：分離一個(gè)樣品只需幾分鐘至幾十分鐘3）高效：塔板數(shù)可達(dá)約3萬塔板/米，使分離效率大大提高4）高靈敏度：UV檢測器的檢測限達(dá)10-9g，熒光檢測器的靈敏度可達(dá)10-11g高壓液相色譜PPT課件快速蛋白液相色譜（Fast Protein Liquid Chromatograph FPLC）n能在惰性條件下，以極快的速度把復(fù)雜的混合物通過成百上千次層析分開。如果連續(xù)進(jìn)樣，一天內(nèi)可制出大量的欲純化物質(zhì)。高壓液相色譜PPT課件按其固定相的性質(zhì)可分：n高效凝膠色譜n疏水性高效液相色譜n反相高效液相色譜n高效離子交換液相色譜n高效親和液相色譜n高效聚

3、焦液相色譜原理與相對應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同：高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進(jìn)行。 高壓液相色譜PPT課件LC-MS液質(zhì)聯(lián)用儀n液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)現(xiàn)已發(fā)展成為最重要的定性、定量分析方法之一，在生物、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等領(lǐng)域中均得到了廣泛的應(yīng)用，在組合化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝化學(xué)的研究工作中，液質(zhì)已經(jīng)成為最重要的研究方法之一。高壓液相色譜PPT課件高效液相色譜儀主要有：n進(jìn)樣系統(tǒng)n輸液系統(tǒng)n分離系統(tǒng)n檢測系統(tǒng)n數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高壓液相色譜PPT課件高效液相色譜溶劑輸送系統(tǒng)（高壓泵）進(jìn)樣系統(tǒng)（進(jìn)樣閥）分離系統(tǒng)（色譜柱）檢測系統(tǒng)（檢測系統(tǒng)）高壓液相色譜PPT課件高壓液相

4、色譜PPT課件1. 進(jìn)樣系統(tǒng) n采用隔膜注射進(jìn)樣器高壓進(jìn)樣閥進(jìn)樣進(jìn)樣量恒定，有助于提高分析樣品的重復(fù)性高壓液相色譜PPT課件2. 輸液系統(tǒng) n高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀n高壓泵的壓強(qiáng)為1.47-4.4107 Pan優(yōu)點(diǎn)：流速可調(diào)且穩(wěn)定，高壓流動(dòng)相通過柱層析，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，可提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性。高壓液相色譜PPT課件高效液相色譜的流動(dòng)相要求：1）應(yīng)具有足夠的純度，選用色譜純試劑2）流動(dòng)相與固定液應(yīng)互不相溶3）流動(dòng)相對試樣各組分應(yīng)有適當(dāng)?shù)娜芙舛?）粘度小5）檢測器對流動(dòng)相不產(chǎn)生響應(yīng)高壓液相色譜PPT課件n流動(dòng)相貯存器和梯度儀，可改變洗

5、脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值、或改用競爭性抑制劑或變性劑等。使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。高壓液相色譜PPT課件n采用梯度洗脫，可以提高分離效果 梯度洗提脫：在分離的過程中，應(yīng)用梯度洗提裝置，按一定的程序改變兩種或兩種以上不同極性的溶劑之間的比例，使流動(dòng)相的成分和極性產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而改變樣品中不同極性的組分的相對保留值，提高分離效果，加快分析速度。高壓液相色譜PPT課件高壓液相色譜PPT課件3. 分離系統(tǒng) n包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱長度為10-50cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管）。內(nèi)徑為2-5mm。由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦

6、合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為5-10m粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。高壓液相色譜PPT課件n固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成。特點(diǎn)： 惰性（如硅膠表面的硅醇基團(tuán)基本已除去） 多孔性（孔徑可達(dá)1000） 比表面積大n其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬或用化學(xué)法偶聯(lián)各種基團(tuán)（如磺酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物，對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。高壓液相色譜PPT課件n基質(zhì)粒度小，能提高分辨率： 固定相基質(zhì)粒度小，柱床易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短，能縮小譜帶寬度、提高分辨率。高壓液相色譜PPT課件 根據(jù)柱效理論（

7、即塔板理論數(shù)N與理論塔板高度H成反比，而H與顆粒度的平方成正比）分析，基質(zhì)粒度越小，塔板理論數(shù)N就越大，分辨率也越高。另外，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60，改善傳質(zhì)速度、縮短分析時(shí)間，增加層析柱的效率。 高壓液相色譜PPT課件n色譜柱常用內(nèi)壁拋光過的不銹鋼制成標(biāo)準(zhǔn)柱型：內(nèi)徑為4.6mm 或 3.9mm，長為15cm-30cm 的直形不銹鋼柱 填充柱的方法：干法和濕法 顆粒直徑大于20m的可用干法填充 顆粒直徑10m以下的采用濕法裝柱濕法裝柱每米柱效可達(dá)3萬塔板高壓液相色譜PPT課件 色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成 高壓液相色譜PPT課件柱的使用和

8、維護(hù)注意事項(xiàng)：色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，否則會(huì)降低柱效、縮短壽命甚至損壞。 需要維護(hù)色譜柱： 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。高壓液相色譜PPT課件 一般色譜柱不能反沖，若標(biāo)明該柱可反沖，可用反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。 選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。高壓液相色譜PPT課件 避免將組成復(fù)雜的樣品直接注入柱內(nèi)，需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，或在進(jìn)樣器和色譜柱之

9、間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以經(jīng)常更換。 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除柱內(nèi)殘留的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75ml。高壓液相色譜PPT課件 保存色譜柱時(shí)，應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間。 色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。高壓液相色譜PPT課件正相色

10、譜和反相色譜n正相分配色譜用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑（如苯、正己烷等）作流動(dòng)相。n反相分配色譜用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑（如水、甲醇、己腈等）作流動(dòng)相。n一般地，正相色譜是固定液的極性大于流動(dòng)相的極性，而反相色譜是固定相的極性小于流動(dòng)相的極性。正相色譜適宜于分離極性化合物，反相色譜則適宜于分離非極性或弱極性化合物。高壓液相色譜PPT課件高壓液相色譜PPT課件4檢測系統(tǒng) 常用的檢測器：紫外檢測器示差折光檢測器熒光檢測器 高壓液相色譜PPT課件（1）紫外檢測器 適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測特點(diǎn)： 使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸等） 靈敏度高（檢測下限為10-10

11、g/m1） 線性范圍寬 對溫度和流速變化不敏感 可檢測梯度溶液洗脫的樣品高壓液相色譜PPT課件（2）示差折光檢測器 n凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。適用：糖類化合物優(yōu)點(diǎn)：通用性強(qiáng)、操作簡單缺點(diǎn)：靈敏度低（檢測下限為10-7g/m1）流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化不適用于痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測高壓液相色譜PPT課件（3）熒光檢測器n凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。n適用：具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測定。n優(yōu)點(diǎn)：靈敏度很高（檢測下限為10-14 10-12g/m1），用于痕量分析和梯度洗脫樣品。高壓液相色譜PPT課件 5. 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) n對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。 高壓液相色譜PPT課件HPLC易出現(xiàn)的問題（一）渦流擴(kuò)散（Eddy diffusion）如果柱裝填得不均勻，流動(dòng)相的速度不均一，就使區(qū)帶變寬。因此，固定相顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，柱效率高。（二）分子擴(kuò)散（Molecular diffusion）要減少分子擴(kuò)散就要采用小而均勻的固定相顆粒裝柱。如果流速太慢，被分離物質(zhì)停留時(shí)間長，