基因治療綜述

1、基因工程綜述基因治療研究進(jìn)展及基因載體介紹摘要：基因治療是一種新的治療手段，可以治療多種疾病，包括癌癥、遺傳性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。癌癥基因治療是基因治療的主要應(yīng)用領(lǐng)域?；蛑委煹幕窘M成元件是：載體(病毒載體、非病毒載體)、轉(zhuǎn)導(dǎo)基因(外源基因)和靶基因。本文主要綜述基因治療的載體研究進(jìn)展和基因治療的疾病研究進(jìn)展、存在的問(wèn)題和發(fā)展前景。關(guān)鍵詞：基因治療 病毒載體 非病毒載體 發(fā)展前景 基因治療(gene therapy，GT)最早指在原位用正?；蛱鎿Q缺陷基因來(lái)治療人類疾病，后來(lái)指將外源基因?qū)爰?xì)胞以糾正基因缺陷，其概念隨分子遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展而拓展，目前指將外源基因

2、轉(zhuǎn)移至患者細(xì)胞內(nèi)并有效地適度表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委熆梢允侵苯有迯?fù)、補(bǔ)償缺陷基因?；蛞种颇承┗虻倪^(guò)度表達(dá)；也可間接增強(qiáng)機(jī)體免疫功能?；蚶猛庠椿?qū)Σ∽兗?xì)胞特異性殺傷等。11、 基因治療中載體研究進(jìn)展 基因治療這項(xiàng)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)要求將目的基因運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞，進(jìn)而將目的基因運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核部位。因此，基因治療的關(guān)鍵技術(shù)是基因傳遞載體的設(shè)計(jì)。基因治療中常用的載體有病毒載體和非病毒載體，病毒載體主要包括慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等；非病毒載體主要是納米載體和高分子載體。1、 病毒載體1.1 腺病毒載體腺病毒載體是目前臨床基因治療中使用最多的載體，占所有使用的基因治療載體24。腺病毒

3、載體在基因治療中的優(yōu)點(diǎn)有：首先，給人方便?？梢远喾N途徑給入，如肌注、靜注、口服和霧化吸人。其次，安全性好。經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，常用的5型腺病毒無(wú)致病及致癌作用，不會(huì)引起癌基因激活。再次，宿主范圍廣。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，給予機(jī)體腺病毒后，可分別在肝臟、肺臟、心肌及骨髓肌發(fā)現(xiàn)感染并可表達(dá)所載的目的基因，另外局部注射如肌肉、大腦及視網(wǎng)膜后等部位，也可使之感染并表達(dá)。2然而，它缺乏特異靶向性，在一些缺乏其相應(yīng)受體的細(xì)胞中感染效率低。現(xiàn)在很多實(shí)驗(yàn)室在構(gòu)建靶向腺病毒載體，它們主要針對(duì)腺病毒天然噬性進(jìn)行改造，從而只對(duì)特異性受體具有靶向性2。在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)也限制了它的應(yīng)用，空殼載體刪除了病毒基因組，只

4、保留了ITRs及包裝信號(hào)，也稱為裸腺病毒載體，是第3代腺病毒載體。它去除了所有病毒編碼基因，僅保留了5 7和3末端反向重復(fù)序列與野生型腺病毒的包裝信號(hào)。需要輔助病毒提供編碼序列?？諝ぽd體可以容納多達(dá)36 kb的外源DNA，可以攜帶大量cDNA與適宜的調(diào)控元件，比起第1代和第2代載體，空殼載體表現(xiàn)出低免疫原性和體內(nèi)表達(dá)的持久性。因此，以第三代腺病毒為載體在進(jìn)行基因治療中具有重要意義。31.2逆轉(zhuǎn)錄載體 反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)是一類已知的RNA病毒。該載體系統(tǒng)有兩部分組成，一是帶有外源基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體分子。二是能以反式提供病毒結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細(xì)胞，其要求是能高效產(chǎn)生感染靶細(xì)胞的霞

5、組病毒顆粒。且無(wú)野生型的反轉(zhuǎn)錄病毒存在，后者是基因治療安全性的關(guān)鍵問(wèn)題。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體最大優(yōu)點(diǎn)是：(1)轉(zhuǎn)染譜廣，可以感染各種細(xì)胞類型；(2)轉(zhuǎn)入的外源基因可完全整合；(3)對(duì)細(xì)胞感染率高，達(dá)到100；(4)感染細(xì)胞不產(chǎn)生病變，可建立細(xì)胞系長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)外源基因。根據(jù)報(bào)道利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體來(lái)進(jìn)行血友病A的基因治療已經(jīng)有了很大的進(jìn)展。4其中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(一般由小鼠白血病病毒MLV改造而來(lái))是最早被改造的且最廣泛地被應(yīng)用到基因治療當(dāng)中。1990年，Blaese等用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來(lái)表達(dá)腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)基因，該載體被命名為L(zhǎng)ASN，用于治療兩例重癥聯(lián)合

6、免疫缺陷(ADA severe combined immunodeficiency，ADASCID)的兒童患者。但存在著一些不足：不能感染非分裂細(xì)胞；轉(zhuǎn)錄終止能力相對(duì)較弱；從有可能造成轉(zhuǎn)錄通讀；可能產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒；可能造成插入性突變；包裝外源基因的能力有限(一般在7 kb以下)等。5慢病毒是屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的成員之一，它的特點(diǎn)是可以感染分裂期和靜止期細(xì)胞。而且與其他載體相比慢病毒載體的免疫原性比較低。同樣，它也可以整合基因至宿主細(xì)胞中使其長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。因此，慢病毒在基因治療中具有良好的應(yīng)用前。1.3其他病毒載體 除上述常用的病毒載體外，應(yīng)用于基因治療的載體還包括腺相關(guān)病毒，單純皰疹病毒，痘

7、病毒和溶瘤病毒。其中腺相關(guān)病毒最常用于眼部疾病的基因治療，如遺傳性視網(wǎng)膜退行性病變。腺相關(guān)病毒(AAV)載體作為基因轉(zhuǎn)移載體具有安全性好、宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率高、目的基因長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)勢(shì)，是視網(wǎng)膜色素變性基因治療領(lǐng)域最具潛力和應(yīng)用價(jià)值的病毒載體6。 2、 非病毒載體 非病毒載體具有成本低、制備簡(jiǎn)單、便于大規(guī)模生產(chǎn)、安全性高、外源基因長(zhǎng)度不受限制等優(yōu)點(diǎn)。最簡(jiǎn)單的非病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是裸DNA，可直接注入特定的組織，特別是肌肉，造成較高水平的基因表達(dá)。目前，正在研究的非病毒載體還有聚合物(聚-L一賴氨酸、聚乙烯亞胺等)、復(fù)合載體以及納米粒子載體等。2.1納米生物技術(shù)基因治療載體 2.1.1納米基

8、因載體的優(yōu)點(diǎn)納米基因載體的優(yōu)點(diǎn)：(1)納米脂質(zhì)體主要由群脂以及膽圍醇合成，這兩種化學(xué)物質(zhì)本身就是細(xì)胞膜的主要成分，由于它們仿生物膜的特點(diǎn)，可以通過(guò)與細(xì)胞膜的融合或者胞吞作用將目的基因?qū)税屑?xì)胞；(2)納米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在傳遞過(guò)程中無(wú)毒，無(wú)免疫原性，并且可以通過(guò)新陳代謝降解，因此不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性；(3)通過(guò)調(diào)節(jié)納米材料的降解速度，還可以控制目的基因的釋放速度，延長(zhǎng)其治療效果；(4)納米基因載體比表面積大，并可在表面偶聯(lián)靶細(xì)胞的配體或抗體，實(shí)現(xiàn)基因治療的主動(dòng)靶向性，大大提高基因傳遞的特異性和加強(qiáng)靶細(xì)胞對(duì)目的基囡的攝取。7 2.1.2 納米基因載體類型納米基因載體主要有一

9、下幾類： （1）納米脂質(zhì)體，是由脂質(zhì)體構(gòu)建的囊泡/囊膜載體，根據(jù)載體自身所帶電荷分為陽(yáng)離子脂質(zhì)體、中性脂質(zhì)體和陰離子脂質(zhì)體。陽(yáng)離子脂質(zhì)體是非病毒載體中研究和應(yīng)用最多的載體之一。8 （2）微膠粒，一種薪興的納米載體，由雙親性的共聚物在水溶液中自動(dòng)聚合而成，親油端形成核，親水端形成外殼。作為基因載體，陽(yáng)離子的親水集團(tuán)可將核酸分子濃縮吸附在微膠粒的表面。多聚陽(yáng)離子形成的微膠粒外殼在內(nèi)吞溶酶體內(nèi)可干擾溶酶體膜的完整性，逃避溶酶體的降解。 （3）納米粒載體，是由高分子材料合成的一種固態(tài)膠體納米級(jí)顆粒載體。這些高分子材料通常具有良好的生物兼容性，可生物降解，對(duì)機(jī)體基本無(wú)毒害，無(wú)免疫原性8。常用的合成材料有

10、PLA、PLGA、殼聚糖、聚氰基丙烯酸乙酯等，可制備成帶正電荷的納米粒吸附核酸或經(jīng)物理包埋將核酸濃縮包裹在納米粒。納米粒有利于被組織細(xì)胞攝取，主要經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)高分子材料的降解逐漸釋放出核酸。殼聚糖是一種從蝦皮、蟹殼等提取出來(lái)的天然高分子氨基多糖，分子量一般為幾萬(wàn)至幾十萬(wàn)不等。Mumper等最早報(bào)道了殼聚糖與質(zhì)粒溶液混合自組裝成納米微粒。納米微粒大小、穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)染效果與殼聚糖的分子量、殼聚糖中氨基(N)與DNA磷酸基(P)比例(NP)、DNA濃度、pH值、離子強(qiáng)度以及溫度等有關(guān)。Yoo等研究發(fā)現(xiàn)，用PEG修飾殼聚糖后其轉(zhuǎn)染效率在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中均有所提高。Zuo等研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)共轉(zhuǎn)

11、染殼聚糖酶基因，促進(jìn)入胞的殼聚糖DNA復(fù)合體解聚，可提高轉(zhuǎn)染效率。9¨殼聚糖納米粒作為一種新型的基因遞送系統(tǒng)，以其具備無(wú)毒性、生物可降解性和良好的生物相容性、藥物緩釋和藥物靶憊傳遞，以及其本身帶正電荷易與DNA、RNA結(jié)合等特性成為良好的基因載體。聚乙烯亞胺，是最早用于組織培養(yǎng)和體內(nèi)試驗(yàn)的陽(yáng)離子聚合物，在目前基因轉(zhuǎn)染中應(yīng)用最多，也是高分子基因載體中最突出的一例9。聚合物間的孔隙可包裝外源基因或抗癌藥物，作為導(dǎo)入載體應(yīng)用于基因治療10。)PEI是目前設(shè)計(jì)得最成功的聚合物。主要有線狀和分枝狀兩種結(jié)構(gòu)。PEI每3個(gè)原子中有1個(gè)為膠基原子，可在生理?xiàng)l件下發(fā)生質(zhì)子化，使PEI具有高正電荷密度，

12、并且PEI在較寬pH范圍內(nèi)都具有很強(qiáng)的緩沖能力。由于其自身的內(nèi)吞緩沖特性，在不需要吞噬泡或溶酶體溶解劑的情況下顯示出更好的基因轉(zhuǎn)染效果。PEI的“質(zhì)子海綿假說(shuō)”(proton sponge hypothesis)作用，引起溶酶體腫脹破裂，使PEIDNA復(fù)合物得以放入胞質(zhì)。此外，PEI的結(jié)構(gòu)屈衄性、PEl分子質(zhì)量及其NP(聚合物中氮的量與DNA中磷酸酯的量之比)對(duì)DNA轉(zhuǎn)移都有重要作用。PEI帶有大量正電荷，導(dǎo)致了較大的毒性，成為限制其體內(nèi)應(yīng)用的重要因素之一。112、 基因治療的研究進(jìn)展 1968年首次提出了基因療法的概念；1990年美國(guó)成功基因治療了一位因ADA基因缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重免疫缺損的4歲女

13、孩，成為首個(gè)基因治療臨床試驗(yàn)世界各國(guó)都掀起了基因治療的研究熱潮12；2004年，首個(gè)治療產(chǎn)品重組人p53抗癌注射液面世， 截至2004年6月底，全世界范圍內(nèi)基因治療的臨床試驗(yàn)方案已有 987 個(gè)。全球基因治療走向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。 現(xiàn)在各種病毒載體和非病毒載體的研究正在火熱的進(jìn)行中，并在不同的疾病上已經(jīng)有一定的理論成效，在大量的實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)中，又對(duì)存在的問(wèn)題進(jìn)行不斷的分析，對(duì)載體不斷的進(jìn)行改進(jìn)，使得載體能夠越來(lái)越具體，越來(lái)越能夠在基因治療中發(fā)揮優(yōu)勢(shì)，而缺點(diǎn)則不斷的消失。3、 基因治療中存在的問(wèn)題1、 安全性和有效性 目前，基因治療領(lǐng)域存在的主要問(wèn)題是有效性和安全性，主要表現(xiàn)為：(1)基因?qū)胂到y(tǒng)缺乏靶

14、向性，效率也較低。(2)目前針對(duì)遺傳性疾病的基因治療方案大多采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其插入或整合到染色體的位置是隨機(jī)的，有引起插入突變及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在危險(xiǎn)13。例如病毒感染的細(xì)胞，通常不只一種，這樣，當(dāng)病毒載體攜帶基因進(jìn)入人體，它們改變的不僅是靶細(xì)胞。而且，當(dāng)基因被加入DNA中時(shí)，也存在新基因加錯(cuò)地方的可能，因而導(dǎo)致癌癥或其它損害的危險(xiǎn)(3)理想的基因治療應(yīng)能根據(jù)病變的性質(zhì)和嚴(yán)重程度不同調(diào)控治療基因在適當(dāng)?shù)慕M織器官內(nèi)和以適當(dāng)?shù)乃交蚍绞奖磉_(dá)。但目前還達(dá)不到這一目標(biāo)，其主要原因是：現(xiàn)有的基因?qū)胼d體容量有限，不能包容全基因或完整的調(diào)控順序，同時(shí)人們對(duì)導(dǎo)入的基因在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)有限13。2

15、、 社會(huì)與倫理當(dāng)體細(xì)胞基因治療在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型中進(jìn)行了較多的試驗(yàn)研究后，就基因治療是否很快就試用于病人而言，生命倫理學(xué)家討論的首要問(wèn)題在于體細(xì)胞基因治療預(yù)期或潛在的利弊。14美國(guó)費(fèi)城18歲的格辛戈患了一種遺傳性疾病良性鳥(niǎo)氨酸基轉(zhuǎn)移酶(OTC)缺陷癥。這種鳥(niǎo)氨酸代謝失調(diào)的疾病本可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)和藥物得以控制，但他卻接受了賓夕法尼亞大學(xué)人類基因治療研究所給予的基因治療臨床I期試驗(yàn)，他也是該研究所的第18位和最后一位受試者。在試驗(yàn)中，由威爾森(James Wilson)領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將包含外源性治療基因的腺病毒載體顆粒(最大劑量)注人到他的肝臟內(nèi)。第二天，格辛戈病情加重，血氨急劇攀升，夜間開(kāi)始昏迷不

16、醒。4天后，由于強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，格辛戈因多個(gè)器官衰竭而死亡。這是第一例直接因體細(xì)胞基因治療而死亡的臨床試驗(yàn)。因此對(duì)于基因治療的臨床試驗(yàn)中，倫理問(wèn)題不可避免的出現(xiàn)在當(dāng)中。如應(yīng)對(duì)倫理問(wèn)題，重要的是以下幾點(diǎn)：（1）首先是，重視基因治療技術(shù)的安全性15。在對(duì)人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前 ，要充分的進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，并且完善病人的評(píng)估報(bào)告。了解病人的具體的身體狀況，如是否過(guò)敏，各器官的生理狀況等。（2）充分保障病人的知情權(quán)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，要讓病人充分了解到本次試驗(yàn)所存在的危險(xiǎn)。臨床醫(yī)師在為病人作出診斷和治療方案后，必須向病人提供包括診斷結(jié)論、治療決策、病情預(yù)后及診治費(fèi)用等方面真實(shí)、充分的信息，尤其是診療方案的性質(zhì)、作用

17、、依據(jù)、損傷、風(fēng)險(xiǎn)、不可預(yù)測(cè)的意外及其他可供選擇的診療方案及其利弊等信息，使病人或家屬經(jīng)深思熟慮后自主作出選擇，并以相應(yīng)的方式表達(dá)其接受或拒絕此種診療方案的意愿和承諾15。（3）保護(hù)病人隱私?；蛑委煹那疤崾潜仨毇@得患者的全部遺傳信息。要求運(yùn)用癥狀前測(cè)試、隱形基因攜體篩查、產(chǎn)前診斷等診斷技術(shù)提供充分的遺傳信息16。而人全部基因會(huì)揭示一個(gè)人的智力、身體狀況、家族病例等比較隱私的問(wèn)題。一旦泄露會(huì)給個(gè)人帶來(lái)傷害。（4）公平原則15。因?yàn)榛蛑委煹馁M(fèi)用比較的昂貴，因此使得窮困的和富有的人在資金的籌集上能力不一樣。為了讓窮困的人也有機(jī)會(huì)獲得基因治療的機(jī)會(huì)，要實(shí)行 公平原則。（5）法律保障。為了能夠使得基

18、因治療能夠更加的合法化，可以設(shè)立法律法規(guī)來(lái)對(duì)基因治療進(jìn)行約束，制定詳細(xì)的責(zé)任制，落實(shí)到基因治療中所參與人員的身上。3. 待解決的問(wèn)題 一個(gè)理想載體需要有高效的轉(zhuǎn)移率，能將外源基因定向?qū)氚屑?xì)胞，能轉(zhuǎn)導(dǎo)不分裂的細(xì)胞，能穩(wěn)定整合到宿主染色體上。但是在載體進(jìn)入細(xì)胞后，要求載體對(duì)細(xì)胞本身的各種生理狀態(tài)和機(jī)制不會(huì)產(chǎn)生影響。再是而靶細(xì)胞類型直接決定載體的表達(dá)效率及存在狀態(tài)。骨髓細(xì)胞是最被重視和最常用的靶細(xì)胞，但是任然存在很多缺點(diǎn)17。最后是要去外源基因在細(xì)胞內(nèi)高校的表達(dá)?；虻母咝П磉_(dá)是一個(gè)非常復(fù)雜的問(wèn)題，它受拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄有效性、mRNA的加工轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定性、翻譯有效性，以及蛋白質(zhì)加工、分泌及穩(wěn)定性等因素的

19、影響，而且不同基因高效表達(dá)的限速因素又不一致。在病毒載體中 可以通過(guò)構(gòu)建病毒載體，在一定程度上能夠高表達(dá)，但是非病毒載體，納米載體等，不具備該作用。因此，提高目的基因表達(dá)的手段不僅限于表達(dá)載體調(diào)節(jié)成分的設(shè)計(jì)，人工改造基因使之協(xié)調(diào)于調(diào)節(jié)順序及宿主細(xì)胞也是一個(gè)重要的趨勢(shì)。4、 基因治療的發(fā)展前景基因治療在臨床上應(yīng)用到實(shí)際，應(yīng)符合有效性、安全性、經(jīng)濟(jì)性、容易操作等，同時(shí)從科學(xué)的觀點(diǎn)可以預(yù)測(cè)，較其它治療方法為優(yōu)。但是基因治療的最終目的為同源基因重組及特定的基因?yàn)槟繕?biāo)，將其殖入細(xì)胞核內(nèi)。這種操作技術(shù)勢(shì)必要花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間去研究，因此目前尚未能做到修補(bǔ)基因，僅能做正?；虻难a(bǔ)充，正是因?yàn)槿绱?，其治療?duì)象就會(huì)

20、受到限制。對(duì)癌癥患者的治療，目前仍然以副作用較多的抗癌藥物為主。很明顯科學(xué)家正朝著基因治療癌癥的方向研究，以求突破。不止在癌癥方面的研究較多，在其他的人類疾病上面也是在不斷的研究著，如殼聚糖載體介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎基因治療18。目前病毒載體由于插入后不穩(wěn)定因素太多，雖然表達(dá)較穩(wěn)定，但終究要逐漸被方興未艾的非病毒載體所取代。雖然對(duì)各種新載體的研究尚不健全，且大部分是體外研究，而體內(nèi)外環(huán)境差別很大，但科學(xué)從不會(huì)放棄任何有希望而又有可能的嘗試。要開(kāi)發(fā)出更安全，有效的非病毒載體!還需要漫長(zhǎng)的理論創(chuàng)新和技術(shù)突破。這并不妨礙人們對(duì)它們成為理想的基因治療載體寄予厚望。參考文獻(xiàn)： 1 基因治療及其臨床應(yīng)用J. 向宇、涂冰. 衛(wèi)生職業(yè)教育. 2005：23（15），133135 2 腺病毒載體在基因治療研究中的應(yīng)用J. 李愛(ài)玲. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué).2012:58（5），103104 3 腺病毒載體及其在基因治療中的應(yīng)用J. 王素華. 中國(guó)畜牧獸醫(yī).2009:36(9),，119121 4基因治療研究進(jìn)展J. 羅丹云. 四川生理科學(xué)雜志.2009:31(4)，176178 5臨床基因治療及其載體的研究進(jìn)展J. 高越、張敬之. 國(guó)際遺傳學(xué)雜志.2014:37(1)，2936 6腺相關(guān)病毒載體在視網(wǎng)膜色素變性基因治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展J. 李光輝、曾芳、王曄愷、黎運(yùn)呈