實(shí)驗(yàn)六用離子交換層技術(shù)純化目的蛋白

1、實(shí)驗(yàn)六 用離子交換層技術(shù)純化目的蛋白【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴箤W(xué)生掌握離子交換層技術(shù)純化蛋口質(zhì)的工作原理。學(xué)會(huì)篩選離子交換介質(zhì) 的工作方法，以及優(yōu)化離子交換層析過(guò)程的策略，獲得具有教高程度的蛋口質(zhì)?！緦?shí)驗(yàn)原理】離子交換層析技術(shù)是一種分離純化牛物物質(zhì)的最常用的方法之一。由于此種 方法是一種建立在各種生物分子攜帶有不同的電荷的基礎(chǔ)之上的分離方法，所以 它依賴于分離系統(tǒng)的ph高于被分離物質(zhì)的pi吋，被分離物質(zhì)帶負(fù)電荷，可被 陰離子交換劑結(jié)合，相反，則同陽(yáng)離子交換劑結(jié)合。牛物分子表面所帶電荷即使 有很小的差別，也足以采用離子交換層析技術(shù)把它們分離開(kāi)來(lái)。通過(guò)優(yōu)化分離系 統(tǒng)的離子強(qiáng)度和ph值以及采用梯度洗脫方法可以使

2、離子交換層析的分辨力更 高。蛋白質(zhì)是帶有多個(gè)極性集團(tuán)的大分子物質(zhì)，在有多種蛋白質(zhì)存在的蛋白質(zhì)混 合物溶液中，每種蛋白質(zhì)因其分子大小，氨基酸組成的差別，對(duì)同種離子交換 介質(zhì)具有不同的離子交換吸附能力，接著于此種差別，我們就可以在特定的離子 交換層析技術(shù)環(huán)境下把目的蛋白分離出來(lái)。離子交換層析環(huán)境包括離子交換介質(zhì) 的種類、交聯(lián)度、蛋白質(zhì)溶液和離子交換層析柱平衡液的ph值及離子強(qiáng)度等。 通過(guò)對(duì)離子交換層析環(huán)境的優(yōu)化，可以使選擇的離子交換劑在特定的環(huán)境下僅同 目的蛋白結(jié)合。而不同其他蛋白結(jié)合，或者僅同雜蛋白結(jié)合而不同目的蛋白結(jié)合。 然而，此種環(huán)境條件對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)是不易找到的。通常遇到的情況是，在

3、特定的條件下，離子交換介質(zhì)既能與目的蛋白結(jié)合也能與雜蛋白結(jié)合，但是對(duì)兩 者的結(jié)合量有所不同。在此種情況下，可以通過(guò)選用特異的洗脫條件選擇性的將 目的蛋白或雜蛋白從離子交換層析柱上洗脫下來(lái)，而達(dá)到分離純化目的蛋白質(zhì)的 目的。離子交換劑同其反離子的結(jié)合能力因反離子的種類不同而有差別。例如強(qiáng)酸 性邙日）離子交換劑對(duì)h+的結(jié)合力比對(duì)nf的??；強(qiáng)堿性（陰）離子交換劑對(duì) oh的結(jié)合力比對(duì)cf'的小；而弱酸性和弱堿性離子交換劑對(duì)上述離子的結(jié)合力 的大小同強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性離子交換劑相反。因此在應(yīng)用離子交換劑時(shí)，采用何種 反離子進(jìn)行電荷平衡是決定吸附容量的重要因素。蛋白質(zhì)是兩性離子物質(zhì)，一種離子交換劑對(duì)它

4、的結(jié)合力取決于蛋白質(zhì)的理化 性質(zhì)和在環(huán)境中呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)環(huán)境的ph值底于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pi）吋, 蛋白質(zhì)帶正電荷能被陽(yáng)離子交換劑吸附；相反，被陰離子交換劑吸附。在特定的 ph環(huán)境中，pi>ph,其值相差愈遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)的堿性愈強(qiáng)帶正電荷愈多，愈易被 陽(yáng)離子交換劑吸附。蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)，其溶液呈膠體狀，因此用離子交換層析技術(shù)提純蛋白 質(zhì)時(shí)，應(yīng)選擇那些選擇性好弱酸性或弱堿性離子交換劑。并且希望其交聯(lián)度小， 孔隙大，以利于蛋白質(zhì)分之滲透入交換劑的網(wǎng)孔中進(jìn)行離子交換吸附。蛋白質(zhì)在離子交換劑上的吸附和解吸附（洗脫）受環(huán)境中的ph值和離子強(qiáng) 度控制。因此，可以選擇一種特定的環(huán)境條件促使蛋白質(zhì)同離

5、子交換劑吸附；選 擇另外一種環(huán)境條件（即改變ph或改變離子強(qiáng)度），使蛋白質(zhì)從離子交換劑上 解吸附，由于蛋白質(zhì)的種類無(wú)記其數(shù)，組成各異，很難找到一種適用于所有蛋白 質(zhì)的離子交換層析條件（包括吸附和洗脫兩種過(guò)程）。因此，每一種蛋白質(zhì)的離 子交換層析過(guò)程，都需要利用小樣法對(duì)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。常用的小樣法是在試管中 進(jìn)行的而不是采用小型層析柱。通過(guò)改變離子濃度和ph值篩選最佳吸附和洗脫 條件。根據(jù)離子交換介質(zhì)所帶的反離子完全離子化的ph值范圍，將其分類為強(qiáng)陽(yáng) 強(qiáng)陰，弱陽(yáng)和弱陰四種類型。離子交換介質(zhì)離子化范圍較寬的為強(qiáng)，較窄的為弱, 與反離子的結(jié)合強(qiáng)度無(wú)關(guān)。在利用離子交換層析技術(shù)分離純化某種蛋白質(zhì)的時(shí)候，首

6、先需要選擇適宜的 離子交換劑。對(duì)蛋白質(zhì)而言，可以選用陰離子交換劑也可以使用陽(yáng)離子交換劑究 竟選用何種離子交換劑，要根據(jù)蛋白質(zhì)的pi來(lái)決定。由于在研究工作開(kāi)始時(shí)， 人們尚不知道目的蛋白質(zhì)的pi,所以一般先在生理ph值下對(duì)陰、陽(yáng)兩種離子交 換劑都做小樣實(shí)驗(yàn)。由于弱酸、弱堿性離子交換劑在生理ph值下的交換容量也 比較高，用來(lái)分離蛋白質(zhì)時(shí)，其生物活性不易受損，所以常被進(jìn)行蛋白質(zhì)純化工 作。pharmacia生物工程公司新近研制岀強(qiáng)陽(yáng)sp型和強(qiáng)陰q型離子交換介質(zhì)的 工作ph范圍比弱陰deae和弱陽(yáng)cm型的工作ph范圍更寬，更易保持高交換 量。所以不少研究工作者傾向于使用一些新型離子交換劑、代替弱陽(yáng)和弱陰

7、型交 換介質(zhì)。在基因工程藥物生產(chǎn)實(shí)踐中，常常根據(jù)產(chǎn)品分離純化過(guò)程的不同階段的 樣品性質(zhì)和純化目標(biāo)來(lái)選擇合適的離子交換介質(zhì)。如下表所示：產(chǎn)品純化 階段樣品性質(zhì)/純化冃標(biāo) 及工作原則應(yīng)選擇的離子交換介質(zhì)（推薦）捕獲及產(chǎn)品粗 分離去除細(xì)胞碎片、快速濃縮、處理量越大越好， 最短時(shí)間內(nèi)捕獲產(chǎn)品，避免產(chǎn)品被降解，減 少核酸、內(nèi)毒素對(duì)介質(zhì)載量和uv檢測(cè)的影 響。介質(zhì)須耐受高粘度、流速快，對(duì)分辨率 的要求不高sepharose 大顆粒（200pm） 交換劑可在短時(shí)間里處理 大量樣品，陽(yáng)離子交換劑 和親和介質(zhì)可在捕獲產(chǎn)品 的同時(shí)，去除核酸。中度純化以高選擇性離子交換介質(zhì)去除主要雜蛋白， 須注重介質(zhì)載暈和分辨率z

8、間的平衡，介質(zhì) 流速不是重要的選擇指標(biāo)sepharose ff (90mm)話官 用于早期純化， sephanrose hp (34pm)可 提供更高的分辨率精細(xì)純化去除多聚體，異構(gòu)體，所有雜質(zhì)必須減低至 藥屮標(biāo)準(zhǔn)。交換介質(zhì)的分辨率應(yīng)高，流速不 重要source lm 30,15 sephadex sephacry r 凝膠過(guò)濾 介質(zhì)通過(guò)小樣試驗(yàn)確定了最適離子交換劑以及吸附/洗脫的最適層析條件之后，接 下來(lái)的工作便是確定離子交換層析柱的尺寸，樣品溶液上樣體積以及洗脫也流速 等。離子交換層析柱的柱床體積，即離子交換劑的裝柱量，由離子交換劑的交換 量和樣品溶液屮待分離蛋口質(zhì)的含量決定。在溶液成分復(fù)

9、雜時(shí)，必須使離子交換 劑的交換量留有充分的余地。因此層析柱的實(shí)際交換量只能是理論交換量的 25-50%o在要分離的蛋口質(zhì)溶液的成分復(fù)雜，目的蛋白質(zhì)與雜質(zhì)蛋口質(zhì)性質(zhì)相 似時(shí)，則實(shí)際交換量應(yīng)設(shè)定得更低。離子交換層析柱屮的離子交換劑的用量可以 用下式來(lái)計(jì)算：aw= (1 )bxcxm式中：w離子交換劑的裝柱量，mla冃的蛋白質(zhì)的含量mgm目的蛋白質(zhì)的分子量dalb單位重量的離子交換劑的理論交換當(dāng)量亳克當(dāng)量/mlc系數(shù)一般取5%50%離子交換層析柱的高徑比多為10： 1。根據(jù)下式可以計(jì)算出層析柱的直徑和高度:式中：h層析柱離子交換劑的裝填高度cmw所需交換劑的裝柱量(由式(1)求得)，ml兀3.141

10、61貝9,柱的直徑d= h10離子交換層析柱洗脫液流速一般由離子交換介質(zhì)的性質(zhì)、操作壓力、層析柱 的體積和待分離蛋白質(zhì)決定的。流速大小可以用體積流速(mlcnf2hj)或線 性流速(cm/h)表示。對(duì)體積不同的層析柱來(lái)說(shuō)，體積流速不能直接用作比較， 所以常用線性流速表示，兩種流速的換算關(guān)系如下：體積流速(ml cm'2 h1)層析柱橫斷面面枳(cm2)線性流速 (cm-h'1)=流速過(guò)犬會(huì)降低層析柱的分辨力。其最佳值，需實(shí)驗(yàn)確定。一般采用5- 10cm h_io【實(shí)驗(yàn)器材】1.5ml eppendorf離心管8支、10x 15帶螺旋蓋的試管一支、試管架、1ml、 5ml刻度吸管

11、各5支、吸頭、紫外分光光度計(jì)、sds-page裝置、425x300玻 璃層析柱、鐵架臺(tái)、木工水平尺、螺動(dòng)泵、核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀、部分收集器【實(shí)驗(yàn)試劑】1. 蛋白質(zhì)溶液為實(shí)驗(yàn)六得到的脫區(qū)硫酸鍍的目的蛋白質(zhì)溶液；2. 20mm磷酸緩沖液ph7.53. 2m naci磷酸緩沖液：將固體nacl添加到20mm的磷酸緩沖液中， 使naci的濃度為2m4. 離子交換樹(shù)脂：弱酸性cm sephadex c弱酸性 deae sephadex a505bradford試劑：稱取loomg考馬斯亮蘭g250,將其溶于50ml 95%乙醇 中后，添加100ml 85%磷酸，加雙蒸水至1000mlo【實(shí)驗(yàn)方法】1. 層

12、析條件的優(yōu)化a.吸附條件的確定(1) 將 5ml cm-sephadex c-50 凝膠或 deae-sephadex a-50 凝膠(本實(shí)驗(yàn)選 用后者)置于一帶有螺旋蓋的©10x15試管中添加5ml 20mm磷酸緩沖酸(ph7.5),顛倒試管數(shù)次后，將試管直立地放置在試管架上，讓凝膠自然沉淀， 用帶吸頭的5ml吸管移去凝膠上部的緩沖液；(2) 重復(fù)上述洗滌操作10次；(3) 將200 u 1凝膠分別轉(zhuǎn)至五個(gè)1.5ml eppendorf離心管中,分別編號(hào)為12、3、 4、 5；(4) 向每個(gè)離心管屮添加500 u 1脫鹽的目的蛋白溶液；(5) 向各號(hào)、離心管中添加總體積為400 u

13、 1的不同量的200mm磷酸緩沖液 和含2mnacl的磷酸，使naci的終濃度分別為50mm、100mm、200mm、300mm 和 400mm(6) 顛倒離心管510次以充分混合其屮的內(nèi)容物，然后直立離心管，靜置, 使凝膠沉于管底。重復(fù)上述操作兩或卷次，總時(shí)達(dá)15min(7) 在高速離心機(jī)中，離心12分鐘，從每個(gè)離心管中取50 u1上清，制 備sds-page樣(一脫鹽后的目的蛋白作對(duì)照)(8) 作sds-page分析，觀察目的蛋白和雜蛋白在各管中的分布情況，選擇上 清屮雜蛋口多，目的蛋口少的一管的鹽濃度作為上柱時(shí)的洗柱緩沖液。b.洗脫條件的確定(1) 將操作中剩余的deae-scphadc

14、x a50凝膠分裝于五支eppcnclorf 離心管屮，每管200 u 1；(2) 向每管添加500 u 1脫鹽的目的蛋白溶液,添加400卩1含濃nacl的磷 酸緩沖液，使nacl的終濃度為中測(cè)定的最佳吸附nacl濃度，重復(fù)a (6) 操作后，離心除去上清；(3) 分別向管1、2、3、4和5中加入ph值為5. 8、6. 4、6. 8、7. 5和80 的含有于吸附時(shí)相同濃度nacl的磷酸緩沖液lml,重復(fù)a (6) (8)操作，觀 察目的蛋口洗脫情況。(4) 選擇目的蛋口質(zhì)洗脫量最高的緩沖液作洗脫用緩沖液；2 裝制離子交換層析柱(1) 根據(jù)測(cè)定的fi的蛋口質(zhì)在實(shí)驗(yàn)六得到的脫鹽蛋口質(zhì)溶液屮的含量和

15、本實(shí) 驗(yàn)“1”選頂?shù)碾x子交換劑的吸水量技術(shù)出所需層析柱的尺寸；(2) 將根據(jù)裝柱量技術(shù)出的干離子交換劑用蒸館水浸泡三小時(shí)后，補(bǔ)加過(guò)量 的水，攪拌使交換劑懸浮后，靜止放置，使交換劑顆粒沉降，小心傾倒交換劑表 而的上清以除去細(xì)微的顆粒。(3) 如果選用的離子交換劑是弱酸性的，則向用水浸泡過(guò)的交換劑中假如2 倍體積的0. 5niol/l鹽酸，在室溫下處理30分鐘后，傾去演算反復(fù)用蒸績(jī)水漂洗 交換劑，直至漂洗水呈中性后，假如0. 5mol/l naoh浸泡30分鐘后，傾去堿液, 用蒸館水漂洗至中性，如果選用的離子交換劑是弱酸性的，則先用naoh處理， 再用iic1處理。起冃的是使弱酸性交換劑帶的反離子

16、是nf,而弱酸性交換劑以 c1-作為反離子，以增加交換劑的交換量。(4) 將玻璃層析柱洗凈后垂直地固定在鐵架臺(tái)上，用木工水平尺校正垂直度。 關(guān)閉柱下出液閥門，向柱屮灌注蒸鐳水，使液面至1/2柱高，如柱底部有氣泡存 在，可采用開(kāi)啟出液閥排除。將處理好的交換劑灌注如層析柱中，待交換劑下沉 在柱底形成2-3厘米厚的交換劑后，打開(kāi)底閥讓水一 40n)l/h的速度流出，并隨 時(shí)將剩余的交換劑懸浮液添加到層析柱屮，使交換劑裝填均勻、無(wú)氣泡。(5) 關(guān)閉柱底岀液閥，向柱內(nèi)灌注蒸館水至柱頂；蓋上柱頂塞，并用導(dǎo)管同 輸液量以調(diào)整至40ml/h的蠕動(dòng)泵向聯(lián)，打開(kāi)柱底岀液閥開(kāi)動(dòng)蠕動(dòng)泵，使二倍柱 床體積的蒸鐳水通過(guò)層

17、析柱；(6) 關(guān)閉蠕動(dòng)泵，并取下柱頂塞，讓柱頂上的蒸憎水的彎月而降至與主廠頂 面向切，關(guān)閉底部出液閥，將已脫鹽的蛋口質(zhì)溶液沿柱壁小心添加到柱床上。打 開(kāi)柱底出液閥，使樣品液面下降至柱床頂面，用少量洗柱液(其成分由本實(shí)驗(yàn)“1” 確定)小心沖洗柱壁，使粘在柱壁上的樣品完全進(jìn)入柱床；(7) 關(guān)閉柱底出液閥后，小心講洗柱液灌注如柱床頂部空間后塞上柱頂塞， 并將其與上述蠕動(dòng)泵相聯(lián)。打開(kāi)柱底出液閥，開(kāi)動(dòng)蠕動(dòng)泵，將2倍柱床體積的洗 柱液送入層析柱，洗去未被吸附的雜蛋白；(8) 將柱底岀液毛細(xì)管通過(guò)核酸蛋白質(zhì)檢察儀同分部體積已調(diào)至1. 5ml的部 分收集器相聯(lián)后，將蠕動(dòng)泵吸液管插入到洗脫液瓶中(洗脫液成分通過(guò)“1”確 定)，開(kāi)動(dòng)部分收集器和蠕動(dòng)泵，以及核酸蛋白質(zhì)檢察儀，用2倍體積的洗脫