生物電分析化學

1、 生物電分析化學 ( Bioelectroanalytical Chemistry) 一、引言一、引言 今日的生物電分析化學已經(jīng)涉及到不同領域的生物學問題，主要是： （1）在生物體內(nèi)進行的絕大部分化學反應都是氧化還原反應，例如為生命所需（營養(yǎng)、組織生長、再生）進行的新陳代謝。 （2）光合作用，包括吸收分子的電子激發(fā)過程。膜上產(chǎn)生的電子和質(zhì)子轉移過程和代謝化學反應。 （3）膜現(xiàn)象控制著離子、分子及其它物質(zhì)從細胞外部向內(nèi)部或逆向傳輸，離子有方向性的運動造成了跨膜電位差，調(diào)節(jié)著一系列的物質(zhì)運輸。 （4）生物體所需的信息過程幾乎都是通過電信號方式發(fā)生的，出現(xiàn)一系列電生現(xiàn)象，包括視覺、動作、痛覺、熱刺激

2、、饑餓和干渴感等等。 （5）用一定周期和幅度的適當電脈沖在膜中生產(chǎn)膜孔，使物質(zhì)更容易跨膜轉移，有可能實現(xiàn)細胞融合和基因攝取。 （6）生物電化學方法對各種疾病的治療，涉及生物傳感器、燃料電池、人工心臟、電刺激和電麻醉、食品控制、環(huán)境保護等方面的應用。 生物傳感器所涉及的學科領域Schemes for insulin therapy (胰島素治療）二、生物傳感器的分類壓電(石英晶體微天平) 電位型 阻抗/電容型電化學生物傳感器電導伏安/安培1.1.電導型生物傳感器電導型生物傳感器 許多生物/化學反應通常都伴隨離子種類和數(shù)量的變化，從而會導致電導率發(fā)生相應的改變?；诖嗽砜梢灾苽潆妼蛡鞲衅?。 電

3、導的測量通常被認為缺乏選擇性，但是通過選擇性的生物識別，如特異性的酶促反應，可克服這個局限。電導型生物傳感器為現(xiàn)有的生物傳感器提供了一種有意義的選擇。 2. 2. 電容型生物傳感器電容型生物傳感器 Newman于1986年首次報道用電容傳感器直接測定抗原-抗體的相互作用以來，該技術得到了科技工作者的關注。這類傳感器研究主要集中在免疫電容生物傳感器、酶電容生物傳感器、DNA電容生物傳感器、分子印跡電容生物傳感器等方面。 3. 3. 電位型生物傳感器電位型生物傳感器 電位型傳感器是基于異相之間的界面電位的變化。電位型生物傳感器主要有兩類: 一類一類是將離子選擇電極和固定酶結合在一起，能實現(xiàn)對被檢測

4、分子的高靈敏、高選擇性分析。 另一類另一類電位型生物傳感器是固定了酶、抗體等生物組份的場效應晶體管 4. 4. 安培（電流）型生物傳感器安培（電流）型生物傳感器 安培生物傳感器是研究和應用最多的電化學生物傳感器，也是最為成功的生物傳感器。同電位法相比，安培檢測更加靈敏、準確和快速。安培試驗所用的儀器也相對簡單,記錄的是i-t曲線。三、 生物傳感原理 生物傳感器是將生物活性物質(zhì)如：器官、組織、細胞、酶、抗體等生物物質(zhì)與換能器 (Transducer)、電子放大器(Electronic amplifier)直接結合，將受體與被檢測分子發(fā)生的特定生物化學反應轉換成可檢測的輸出信號。 根據(jù)換能器轉換的

5、信號又可分為電化學生物傳感器、光學生物傳感器、壓電晶體生物傳感器、半導體生物傳感器、介體生物傳感器及熱敏生物傳感器。電化學生物傳感器是這幾種中發(fā)展最為廣泛的。 生物傳感器的結構生物傳感器的敏感識別模式生物傳感器的電子傳遞 1. 1. 酶的種類及其電子轉移性質(zhì)酶的種類及其電子轉移性質(zhì) 酶是一種由生命體合成的特殊化學催化劑，作為催化劑其最顯著特征是在溫和條件下的高效和專一性。酶通常由兩個部份組成：一是脫輔基酶蛋白 (Apoenzyme)；另一部份是非朊基基團(Prosthetic group)，這部份在酶的催化反應中起主要作用，是酶的活性中心(Active center)。按其催化反應的性質(zhì)，酶可

6、分為氧化還原酶(Oxidoreductase)、移換酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、裂合酶(Lyase)、異構酶(Isomerase)、合成酶(Lligase)等六大類。大部分酶安培生物傳感器是在氧化還原酶的基礎上發(fā)展的，這是因為氧化還原酶和底物在酶促反應過程中發(fā)生了電子轉移。氧化還原酶又可細分為脫氫酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、還原酶(Reductase)、過氧(化)物酶(Peroxidase)、氧酶(Oxygenase)、羥化酶(Hydroxylase)、觸酶(Catalase)等幾種。通常根據(jù)其非朊基基團(活性中心)又可分為含黃素

7、(Flavin)類活性中心酶和含醌(Quinone)類活性中心酶兩類。黃素(Flavin)類酶包含約80種酶（如：葡萄糖氧化酶和黃嘌呤氧化酶），其活性中心分別為黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavine adenine dinucleotide, FAD)或黃素單核苷酸 (Flavin mononucleotide, FMN)，其中絕大多數(shù)是FAD型酶。 FAD氧化還原中心的氧化還原反應過程，醌類酶的活性基團是吡咯并喹啉醌 。許多氧化還原酶的酶促反應都有一種輔助底物(Co-substrate)的參與。這類物質(zhì)包括O2、H2O2、ATP、NAD+/NADH及NADP+/NADPH，起著電子受體的作用。與

8、酶對其主要底物的高選擇性不同，酶促反應對輔助底物的選擇性很低，因而可以用具有良好電化學性能的人工合成試劑(如電子媒介體和中繼體)代替輔助底物，從而獲得期望的目的。正由于這些特征，氧化還原酶被廣泛用來制備安培型生物傳感器。 2. 2. 生物傳感器的發(fā)展生物傳感器的發(fā)展 根據(jù)酶與電極間電子轉移機理,大致可將酶安培生物傳感器分為三代：a)a)第一代生物傳感器第一代生物傳感器 第一代生物傳感器是基于檢測酶促反應產(chǎn)物(如：過氧化氫、NADH)的生成或輔助底物(如氧分子)的消耗來實現(xiàn)對底物的測定(圖1-6A)，因而據(jù)此可分為氧檢測型、過氧化氫檢測型、NADH檢測型等三種。 第一代生物傳感器具有如下局限性：

9、第一代生物傳感器具有如下局限性：i)響應信號與氧濃度關系較大，氧分壓的變化會對酶電極產(chǎn)生明顯影響；ii)氧分子也是氧化酶的底物，當溶解氧的濃度不是很高時，難以對高濃度底物進行測定，從而導致線性范圍過于狹窄；iii)酶促反應產(chǎn)生的過氧化氫濃度高時會使酶活性降低很多；iv)過氧化氫的測定通常在較高電位(一般在600mV左右)下進行，許多還原性電活性物質(zhì)會被氧化而產(chǎn)生干擾信號； v) NADH的氧化需要很高的過電位及氧化產(chǎn)物會對電極表面發(fā)生聚合而毒化生物傳感器。這些缺點限制了第一代生物傳感器的進一步推廣和應用，于是導致了第二代傳感器的發(fā)展。b) 第二代生物傳感器第二代生物傳感器 在第二代酶安培生物傳

10、感器中，一個人工合成的電子受體，即媒介體被用來代替天然受體來傳遞酶電極間的電子。電子媒介體是一種低分子量的具有氧化還原電對的分子，媒介體首先與酶的還原態(tài)反應，然后擴散到電極表面發(fā)生快速的電子轉移。其電極反應過程如下： S + Eox = P + Ered Ered + Mox = Eox + Mred Mred = Mox + ne- 其中Mox、Mred分別為媒介體的氧化態(tài)和還原態(tài)。 diffusional mediatorImmobilizationmediator與第一代傳感器相比，媒介體生物傳感器主要優(yōu)勢在于： (i)測量受氧影響??；(ii)酶電極的工作電位由媒介體的氧化電位調(diào)節(jié)，即可

11、以在較低電位下檢測以避免其它物質(zhì)的干擾。 早先是一些水溶性的無機或有機化合物如鐵氰化物和醌用來作為電子媒介體。 近年來應用比較多的電子媒介體有二茂鐵二茂鐵及其衍生物、四硫富瓦烯四硫富瓦烯類、TCNQ類、有機導電鹽有機導電鹽類、醌醌類、鐵鐵/亞亞鐵氰化物鐵氰化物類等 例:介體葡萄糖傳感器的制備 PVI-PAA-Os/GOD復合膜的最佳成膜條件是: PVI-PAA-Os： 0.5 mg mL 1 GOD ：0.5 mg mL 1 階躍電位：0.7 V (2s)和-0.5 V (2s) 階躍次數(shù)：35次。PVI-PAA-Os/GOD膜共沉積機理膜共沉積機理 生物復合膜的電化學特性生物復合膜的電化學特

12、性 CV of a PVI-PAA-Os/GOD film . Potential scan rate: 5, 10, 20, 50,100, 200 mV s-1 Ep no change Ip 復合膜對葡萄糖的電催化復合膜對葡萄糖的電催化 a) No glucose b) 10 m mol L-1 glucose電子轉移機理電子轉移機理 葡萄糖在電極上的安培響應葡萄糖在電極上的安培響應 Hydrodynamic voltammograms 線性范圍: 0.1-30 mM，靈敏度為340 nA mM-1 檢測限: 0.03 mM (S/N=3)。 Each 2 mM c)第三代生物傳感器第三

13、代生物傳感器 理想的第三代生物傳感器是在電極表面實現(xiàn)酶與電極的直接電子傳遞,即: Ered = Eox + ne- 三代生物傳感器敏感機理對比三代生物傳感器敏感機理對比 五、五、電極上電極上酶的固定化方法酶的固定化方法 酶是酶傳感器中的分子識別物質(zhì)，因此酶在電極表面固定是制備生物傳感器的一個非常關鍵步驟，酶電極的成功與否往往在很大程度上取決于酶的固定。理想的酶固定方法應該滿足以下三條標準： i)能保留酶的高活性；能保留酶的高活性； ii)酶固定層具有很好的穩(wěn)定性，酶固定層具有很好的穩(wěn)定性，如：在一定pH范圍內(nèi)不變性，在溶液中沒有泄漏； iii)酶電極能對底物發(fā)生快速和靈敏的響應。酶電極能對底物

14、發(fā)生快速和靈敏的響應。 經(jīng)過多年的研究，發(fā)展了許多基于物理的、化學的或物理化學方法相結合的酶固定方法。 a)a)吸附法吸附法 這是一種最為簡單的方法，即通過物理吸附物理吸附(基于離子的、極性的、氫鍵、親油性、-電子作用等作用力)或化學吸附化學吸附(基于化學反應的分子自組裝膜， Self-assembly monolayer, SAM)將酶固定在基體上。 由于沒有試劑參與固定過程及這些載體對酶良好的親和性，該方法最大的優(yōu)點是生物活性高優(yōu)點是生物活性高。然而由于吸附是一個可逆的過程，該方法制備的生物傳感器對pH、溫度、離子強度、底物濃度很敏感，這些因素可能會導致酶的脫落。 b) 包埋法包埋法 這是

15、一種應用很普遍的酶固定化技術，該技術包括碳糊包埋、溶膠溶膠-凝膠包埋凝膠包埋、電化學聚合膜包埋等。溶膠-凝膠包埋是將酶包埋并固定在一個聚合物三維空間網(wǎng)絡結構或孔狀結構中，小分子物質(zhì)能容易地滲透進來。 該方法的缺點是缺點是膜的孔徑控制不好經(jīng)常發(fā)生酶的泄漏或?qū)Φ孜锏臄U散速率的消極影響。碳糊包埋法一般是將酶直接固定在修飾電極材料中；溶膠-凝膠包埋使用金屬醇鹽（如TEOS）sol-gel膜；電化學聚合膜包埋包括導電聚合物包埋導電聚合物包埋和非導電性聚合物膜包埋。非導電性聚合物膜包埋主要包括聚苯酚、聚硝基酚、聚- 氨基乙基苯酚、間笨二酚、苯二胺和聚吲哚等。聚合物包埋聚合物包埋 溶膠溶膠- -凝膠法：凝膠

16、法：溶膠凝膠(sol - gel) 法是將金 屬醇鹽或無機鹽溶于水或有機溶劑,在低溫下通過水解、聚合等化學反應,形成內(nèi)含納米粒子的溶 膠,再轉化為具有一定空間結構的凝膠。然后經(jīng)過適當熱處理或減壓干燥,制備出相應的粉末、薄 膜和固體材料的方法。此法的優(yōu)點是反應過程易控制,處理溫度低,粒徑分布窄,純度高,納米顆粒分散均勻。但成本昂貴,周期長,產(chǎn)量小,熱處理時易團聚且污染環(huán)境,難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。c) 共價鍵合法共價鍵合法 該方法是通過共價鍵將酶分子與電極表面結合而固定的方法，雖然這種方法操作較為困難，但由于提供了比較穩(wěn)定的固定化酶，因而已得到了較為普遍的應用。 共價鍵合法的主要缺點是酶在共價鍵合時

17、可能會改變酶的結構，因而共價鍵合酶的催化活性及穩(wěn)定性會受到一定程度的影響。 d) 交聯(lián)法交聯(lián)法 通過雙(多)功能團試劑將酶分子之間、酶分子與凝膠/聚合物之間交聯(lián)形成網(wǎng)狀結構而使酶固定化。這種方法可以克服酶電極在溶液中從電極表面泄漏的缺點。最常用的交聯(lián)劑是戊二醛，它能在溫和條件下與酶蛋白上的-NH2殘基反應。惰性蛋白(如：牛血清蛋白，BAS)常用來形成酶膜，因它含有豐富的賴氨基殘基，易于和戊二醛作用形成非水溶性的聚合物膜，同時也為酶分子提供了合適的微環(huán)境，從而提高了測定靈敏度。 戊二醛和BAS固定酶電極 Glucose oxidase catalysed oxidation of glucose

18、: identification of measurement parameters for glucose assay.六、免疫傳感器六、免疫傳感器 電化學免疫分析法：電化學免疫分析法：將免疫法的高選擇性與電化學法的高靈敏性結合起來所產(chǎn)生的一種新型的免疫分析法。 電化學免疫分析法包括電化學電化學免疫傳感免疫傳感器器和伏安免疫分析法伏安免疫分析法。 免疫法免疫法是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應而建立起來的分析方法。它具有很高的選擇性和很低的檢測限，可以應用于測定各種抗原、半抗原或抗體。 免疫法有放射免疫法、熒光免疫法、發(fā)光免疫法及酶聯(lián)吸附免疫法等。其中以放射免疫法的靈敏度最高。但由于

19、放射免疫法涉及到示蹤原子的處理，使用上受到限制。 將生物學免疫分析法與伏安法相結合，產(chǎn)生了一種新型的免疫分析法電化學伏安免疫法電化學伏安免疫法。1、伏安免疫分析法、伏安免疫分析法 實現(xiàn)伏安免疫法的途徑很多。通常按標記方法的不同，分為酶標記法酶標記法和非酶標記法非酶標記法。 采用酶標記法酶標記法時，通過酶的催化作用，產(chǎn)生一種電活性物質(zhì)，再用適當?shù)碾娀瘜W方法進行測量。酶標記法的優(yōu)點是靈敏度高，因為它利用了酶的催化作用（放大系數(shù)103104以上）。 非酶標記法非酶標記法通常利用抗體或抗原本身的電活性，或者通過適當?shù)幕瘜W反應進行標記，使其產(chǎn)生電活性，然后再進行電化學測量。但靈敏度一般較低。 在上述兩種

20、方法中，根據(jù)是否要將抗體-抗原結合物（Ab-Ag）與游離抗體或抗原進行分離而又可將其分為非均非均相相免疫法免疫法與均相免疫法均相免疫法。下面舉例加以說明。 1.1.酶標記伏安免疫法酶標記伏安免疫法（1）非均相法非均相法 一種方法首先是將抗體固定在聚苯乙烯容器表面上。表面上的空位置用Tween-20結合之。然后將酶標記的抗原（Ag*）和抗原試樣（Ag）加入容器中，讓其與容器表面上有限的抗體進行競爭反應。 待一定時間后，洗去游離的抗原。這時，由于競爭反應的結果，與容器表面上抗體相結合的標記抗原量與試樣中的抗原量成反比。然后加入基物，讓其與Ag*中的酶相互作用，得到電活性產(chǎn)物P，最后用伏安法進行檢測

21、。這一過程可用下圖表示。 另一種定量方法是形成夾心式化合物形成夾心式化合物的定量法。在這種方法中將抗原試樣加入固定了一定量抗體的容器中，讓抗原與抗體進行反應。達到平衡后，洗去游離的抗原。然后加入另一種酶標記的抗體，使其與抗原再反應，形成夾心式化合物。 洗去過量的酶標記抗體，再加入適當?shù)幕|(zhì)S。這時，在酶的催化作用下，基質(zhì)轉變?yōu)榫哂须娀钚缘腜，從而進行測量。在這種情況下，電信號與被測抗原成正比。這一過程可用圖2表示。這種方法已應用于免疫球蛋白的測定。 采用上述酶標記的非均相伏安免疫法，具有靈敏度高的特點，尤其是這種方法可以將試樣溶液中可能存在的干擾物質(zhì)（如蛋白質(zhì)等）分離，提高了方法的適應性；缺點

22、是操作稍復雜。（2）均相法均相法 這種方法在溶液中進行，不涉及到Ag*或Ag的分離步驟。其基本原理是根據(jù)Ag*與Ab反應形成AbAg*后，它的催化活性相應減小這一現(xiàn)象進行測定的。 在這種方法中，被測抗原與一定量的酶標記抗原和抗體在溶液中進行反應，由于競爭反應的結果，一部分Ag*形成了AbAg*，引起Ag*的催化活性降低，從而減小由基質(zhì)（S）產(chǎn)生電活性物質(zhì)（P）的量，據(jù)此可以推算出試樣中抗原的含量。 與非均相法比較起來，均相法比較簡單，但靈敏度較均相法比較簡單，但靈敏度較低，干擾因素也較多。低，干擾因素也較多。這種方法已應用于苯妥英等抗癲癇藥物的測定。 2.2.非酶標記伏安免疫法非酶標記伏安免疫

23、法 這種方法可能是電分析化學家最感興趣的，因為它不涉及到酶操作技術。在這種方法中，可以直接利用抗體或抗原的電活性，或者通過適當?shù)幕瘜W方法，使它們轉變?yōu)榫哂须娀钚缘奈镔|(zhì)，從而利用免疫反應進行測定。 非酶標記伏安免疫法也可以非均相或均相非均相或均相的方式進行。其基本原理已如上述，現(xiàn)各舉一例以說明： 均相均相免疫反應測定雌三醇抗體： 雌三醇是非電活性的，將其硝基化后，即轉變?yōu)榫哂须娀钚缘亩趸迫迹ˋg*）。它可借微分脈沖極譜進行測定。于溶液中加入雌三醇抗體，形成AbAg*后，二硝基雌三醇即結合為非電活性物質(zhì)。因此，利用這一均相免疫反應，可以測定雌三醇抗體含量。非均相非均相免疫伏安法： 采用In（

24、銦）-DTPA進行標記的人血清蛋白（HSA）的測定屬于非均相免疫伏安法。其基本原理如下： 目前，用于標記抗原的電活性物質(zhì)還有Hg2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Cd2+以及Brdicka蛋白質(zhì)的利用等。被測定的抗原或半抗原還有嗎啡、免疫球蛋白、卵蛋白等。 2 2、電化學免疫傳感器、電化學免疫傳感器 電化學免疫傳感器是由抗原或抗體等分子識別元件和電化學電極組合而成，可以直接檢測免疫試劑的結合反應。依據(jù)電化學測定的方式的不同可分為： (1)電位免疫傳感器電位免疫傳感器 主要測量電極表面固定抗原或抗體與其相應的抗體或抗原結合引起的電極表面電位變化，固定抗體的測量電極與參比電極間的電勢差大小與相應

25、自由抗原濃度有關。電位免疫傳感器已用于環(huán)境中2，4-D除草劑的檢測。 (2) 電流免疫傳感器電流免疫傳感器 主要測量電極表面電活性物質(zhì)被氧化或還原所產(chǎn)生的與其濃度大小成線性關系的電流，一般有氧化酶的參與。如利用雙抗電流免疫傳感系統(tǒng)對黃體酮（progestarone）進行了測定。(3) 電容免疫傳感器電容免疫傳感器 主要測量電極板上抗原抗體反應所引起的電容變化，電容大小與電容極板表面的介電層(固定抗原或抗體)的厚度和介電性能有關。已利用ELISA（酶聯(lián)免疫分析）將此類傳感技術應用于葡萄糖的測定。(4) 電導免疫傳感器電導免疫傳感器 這類傳感器與電容免疫傳感器相似，主要通過測定電流變化從而測出兩電

26、極間傳感層的電導變化。已利用這類傳感器對環(huán)境中阿特拉津進行了測定。 電化學免疫傳感器按免疫分析法的類型可分為：（1）直接免疫傳感器直接免疫傳感器 抗體和抗原帶有大量的電荷，當抗體和抗原在電極表面形成復合物時，根據(jù)其發(fā)生的電學或電化學性質(zhì)（如介電常數(shù)、電導率、膜電位、離子淌度等）變化，實現(xiàn)抗原或抗體的測定。 （）間接免疫傳感器間接免疫傳感器 利用標記物（如酶）將免疫反應的信號放大以后，間接測定抗原或抗體。 間接免疫傳感器間接免疫傳感器 例如利用碘離子選擇性電極，可以測定乙型肝炎抗原。這是一種酶免疫分析傳感器。制作這種電極時，需要將乙型肝炎抗體固定在碘離子選擇性電極表面的蛋白質(zhì)膜上。測定時，將此電

27、極插入含有乙型肝炎抗原的溶液中，使抗體與抗原結合，再用過氧化酶標記的免疫球蛋白抗體處理，這時就形成了抗原與抗體的夾心結構。 將此電極插入過氧化氫和碘化物的溶液中，在過氧化酶標記的免疫球蛋白的催化作用下，過氧化氫被還原，而碘化物因被氧化而消耗，碘離子濃度的減少與乙型肝炎抗原的量成正比，由此可推算乙型肝炎抗原的濃度。 另一種有趣的免疫傳感器是離子免疫電極離子免疫電極。例如載有特定離子的紅細胞抗原，能與待測抗體結合。這種結合物能被一種稱為補體的酶識別，并使紅細胞溶解，釋放出細胞所載的離子。這些釋放出來的離子可用離子選擇性電極來檢測。 利用這種原理，以羊紅細胞作離子載泡，三甲基苯銨作標記離子，可以測定

28、牛血清蛋白抗體。另外，人造的脂泡也可代替紅細胞進行上述免疫分析。 例如：以四苯基銨離子作標記離子，把一種腦代謝的中間產(chǎn)物神經(jīng)節(jié)苷脂連接到脂泡的表面作抗原，以四苯基銨離子選擇性電極作檢測電極，采用薄層電位測量技術，可以測定微升量血清中的神經(jīng)節(jié)苷脂抗體。 免疫電極的制備和檢測：Competitive binding immunoassay. (a) Antigen determined by competition for an immobilized antibody with a labeled antigen; Competitive binding immunoassay. (b) sim

29、ilar scheme for sample antibody using immobilized antigen.七、生物親和傳感器生物親和傳感器：生物親和傳感器：利用生物分子之間的親和性而建立起來的一種電化學傳感器。如某些蛋白質(zhì)對某特定物質(zhì)的親和（識別）性。 有二種原理的生物親和傳感器： 1）直接親和型生物傳感器； 2）分子競爭型生物親和傳感器。 也有酶標記酶標記和競爭型競爭型生物親和傳感器。 二種原理如下圖所示： (a) The direct affinity electrode (b): the competitive-binding affinity electrode.八、第三代生

30、物傳感器八、第三代生物傳感器 1、酶直接電荷傳輸?shù)睦щy性在于：（1）電活性的輔基位于蛋白質(zhì)的中心；（2）蛋白質(zhì)在電極表面的吸附變性；（3）蛋白質(zhì)在電極表面的不利分子定向 細胞色素c 分子空間結構對于氧化還原蛋白質(zhì)難以實現(xiàn)直接電子轉移的主要原因有：一、通常情況下：（1 1）由于氧化還原蛋白質(zhì)的輔基(生物活性基團常常為電化學活性基團) 被多肽鏈所包裹,其與電極表面的距離較大, 因而難于進行電子傳遞；（2 2）蛋白質(zhì)在電極表面的取向往往不利于其電活性基團與電極之間的電子交換; （3）某些雜質(zhì)在電極表面上的吸附或蛋白質(zhì)本身的吸附變性可能阻礙它們與電極間的直接電子轉移。二、氧化還原酶分為含有或不含電子傳

31、遞通道兩類, 前者在自然體系中參與電子傳遞過程, 其活性中心與酶分子表面之間存在電子傳遞通道; 相反,后者不參與電子轉移過程, 所以在其分子中不存在電子傳遞通道，這類氧化還原酶很難實現(xiàn)直接電化學反應, 除非它的氧化還原活性點位于酶分子表面三、氧化還原蛋白質(zhì)結構復雜且具有各向異性, 它們的活性中心并不正好位于蛋白的中心, 此外蛋白質(zhì)分子表面還呈現(xiàn)電荷分布不均勻性1977 年年,H ill和和Kuwana分別發(fā)現(xiàn)馬心細胞色素分別發(fā)現(xiàn)馬心細胞色素c (Cyt c) 與金電極和摻錫氧化銦電極之間有直接可與金電極和摻錫氧化銦電極之間有直接可逆的電化學反應。逆的電化學反應。1979 年年, 酶與電極的直接

32、電子傳酶與電極的直接電子傳遞也見報道。這些開創(chuàng)性的工作為用電化學手段遞也見報道。這些開創(chuàng)性的工作為用電化學手段探索生物體系的奧秘打開了大門探索生物體系的奧秘打開了大門。近幾十年來，。近幾十年來，人們對蛋白質(zhì)直接電化學的研究主要集中在蛋白人們對蛋白質(zhì)直接電化學的研究主要集中在蛋白質(zhì)固定在電極表面上的直接電化學響應。因為質(zhì)固定在電極表面上的直接電化學響應。因為蛋蛋白質(zhì)在電極表面具有良好的取向是實現(xiàn)蛋白質(zhì)白質(zhì)在電極表面具有良好的取向是實現(xiàn)蛋白質(zhì)電極之間直接快速電子傳遞的前提。因此采電極之間直接快速電子傳遞的前提。因此采 用適用適當?shù)姆椒ㄔ陔姌O表面固定蛋白質(zhì)當?shù)姆椒ㄔ陔姌O表面固定蛋白質(zhì), 是目前蛋白質(zhì)

33、電是目前蛋白質(zhì)電化學研究的熱點?；瘜W研究的熱點。 但是大部分氧化還原酶的活性基團被外層的保護性蛋白質(zhì)和糖原所包裹，無法與電極進行電子交換。Marcus方程給出了理論依據(jù)： 其中 G G是反應自由能反應自由能； 是MarcusMarcus重組能重組能；d d是氧化還原中心實際電子傳遞距離電子傳遞距離(即酶氧化還原中心與電極或媒介體之間的距離)。從式可知，電子傳遞的動力學特性由以下因素決定：推動力、重組能、實際電子傳遞距離。氧化還原酶的分子量一般在40 000 (如：半乳糖酶) 至850 000 (如：膽堿脫氫酶) Da (Dalton-道爾，一個氧原子質(zhì)量的1/16)之間，它們的平均直徑在551

34、50之間。通常，氧化還原酶很難與電極進行直接電子交換。 2、酶直接電荷傳輸所采用的主要方法： （1）通過對酶的修飾形成電極轉移接替體（Electron-transfer relay）-縮短電子隧道的距離； （2）使用電子轉移促進劑； （3）酶固定在導電聚合物膜內(nèi)的直接電化學； （4）酶在電極表面的規(guī)律定向吸附。 A. 蛋白質(zhì)膜修飾電極B. 蛋白質(zhì)溶膠/凝膠修飾電極C. 蛋白質(zhì)表面活性劑膜修飾電極D. 蛋白質(zhì)雙層類脂膜修飾電極E. 蛋白質(zhì)DNA膜修飾電極F. 蛋白質(zhì)聚合物膜修飾電極G. 蛋白質(zhì)納米粒子修飾電極(1) 基于蛋白質(zhì)直接電子傳遞的修飾電極A.蛋白質(zhì)膜修飾電極 由Armstrong 等創(chuàng)

35、立的蛋白質(zhì)膜伏安法(PFV ) 具有許多優(yōu)點: (1) 蛋白質(zhì)膜電極的制備簡單, 需用蛋白質(zhì)的量較小; (2) 克服了溶液體系中蛋白質(zhì)的擴散系數(shù)較小的限制; (3) 能使用快速掃描伏安法研究電子傳遞過程; (4) 通過電化學數(shù)據(jù)分析可獲得豐富的生物化學信息。 蛋白質(zhì)膜修飾電極的制備: 經(jīng)過拋光的棱面裂解石墨電極(PEG) 表面產(chǎn)生較多的親水含氧基團。在低溫(0C)、低離子強度和共吸附劑(如氨基環(huán)多醇) 的存在下, 通過靜電吸附作用, 在電極表面形成一層蛋白質(zhì)膜(吸附量10- 1110- 12 mo l cm - 2)。共吸附劑在荷電的蛋白質(zhì)和電極之間起著促進電子傳遞的作用。B.蛋白質(zhì)溶膠蛋白質(zhì)

36、溶膠/凝膠修飾電極凝膠修飾電極溶膠溶膠- -凝膠法一般是以金屬鹽或半金屬鹽凝膠法一般是以金屬鹽或半金屬鹽( (硅酸甲脂硅酸甲脂TMOSTMOS，硅酸乙脂，硅酸乙脂TBOSTBOS，鈦酸丁脂等）為前驅(qū)體，在水，鈦酸丁脂等）為前驅(qū)體，在水，互溶劑及催化劑的存在下發(fā)生水解和縮聚反應，形成互溶劑及催化劑的存在下發(fā)生水解和縮聚反應，形成SiOSiO2 2網(wǎng)狀結構網(wǎng)狀結構。蛋白質(zhì)包埋在溶膠凝膠中蛋白質(zhì)包埋在溶膠凝膠中, 一方面與硅酸酯形成氫一方面與硅酸酯形成氫健健, 使之構象不易變化使之構象不易變化; 另一方面另一方面, 與硅酸酯中的甲基與硅酸酯中的甲基等疏水基團存在相互作用等疏水基團存在相互作用, 既能

37、保持蛋白質(zhì)的活性既能保持蛋白質(zhì)的活性, 又又可防止蛋白質(zhì)從凝膠膜內(nèi)泄漏可防止蛋白質(zhì)從凝膠膜內(nèi)泄漏, 而一些小分子、離子而一些小分子、離子則可以自由進出溶膠則可以自由進出溶膠凝膠的孔隙。特別是一些摻雜凝膠的孔隙。特別是一些摻雜和衍生的溶膠和衍生的溶膠凝膠凝膠, 克服了生物分子在溶膠克服了生物分子在溶膠凝膠凝膠形成過程中形成過程中, 因溫度、酸度及有機溶劑等不利條件而因溫度、酸度及有機溶劑等不利條件而降低酶活性的問題。降低酶活性的問題。C.蛋白質(zhì)表面活性劑膜修飾電極蛋白質(zhì)表面活性劑膜修飾電極 生物膜主要由蛋白質(zhì)和磷脂組成。磷脂分子結構的兩生物膜主要由蛋白質(zhì)和磷脂組成。磷脂分子結構的兩性特征決定了它

38、們在生物膜中的雙分子層排列及其與各性特征決定了它們在生物膜中的雙分子層排列及其與各種蛋白質(zhì)相結合的特性。表面活性劑具有類磷脂兩性結種蛋白質(zhì)相結合的特性。表面活性劑具有類磷脂兩性結構構, 它們在電極表面能形成穩(wěn)定的膜它們在電極表面能形成穩(wěn)定的膜, 并能促進氧化還原并能促進氧化還原蛋白質(zhì)與電極之間的電子傳遞。蛋白質(zhì)與電極之間的電子傳遞。 表面活性劑膜中表面活性劑膜中, , 蛋白質(zhì)保持著原始構象不變蛋白質(zhì)保持著原始構象不變, , 與電與電極之間的電子傳遞速度大大加快。肌紅蛋白極之間的電子傳遞速度大大加快。肌紅蛋白(M b)(M b)、血、血紅蛋白紅蛋白(Hb)(Hb)、細胞色素、細胞色素P450 (CytP450 )P450 (CytP450 )、辣根過氧化、辣根過氧化物酶物酶(HRP)(HRP)、過氧化氫氧化酶、細胞色素、過氧化氫氧化酶、細胞色素c c 氧化酶等含氧化酶等含有血紅素的蛋白質(zhì)有血紅素的蛋白質(zhì), , 都可實現(xiàn)都可實現(xiàn)Fe (Fe ( ）-Fe (-Fe () ) 電對電對與電極之間直接、可逆、快速的電子傳遞過程。與電極之間直接、可逆、快速的電子傳遞過程。制備這類蛋白質(zhì)表面活性劑修飾電