茶氨酸生物合成基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1、茶氨酸生物合成基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化陸文淵，成浩；王麗鴛，周健(農(nóng)業(yè)部茶葉化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州310008)摘要：對具有茶氨酸生物合成能力的卩谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(fggt)基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。 首先采用plackett-burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對影響yggt活性的培養(yǎng)基成分進(jìn)行篩選，然后將篩選得到的葡 萄糖、酵母提取物、k2hpo43個關(guān)鍵影響因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過對二次多項(xiàng)回歸方程求解得到關(guān) 鍵影響因素的報(bào)佳濃度為匍萄糖10.39 g/l、酵母提取物6.88 k2hpo4 7.10 g/l, yggt活性的最大 預(yù)測值為4.42 u/mu實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證值為4

2、.40 u/mlo最后通過基因工程菌催化合成茶氨酸反應(yīng).得到茶氨 酸的產(chǎn)量為32.22妙l。關(guān)鍵詞：茶氨酸；卩谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(卩gg7); plackett- burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法(rsm)中圖分類號：ts20i文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a文章編號：1005-9989(2(x)8)07-0018-04optimization of cultivation medium for the genetically engineeredescherichia coli strain of y- glutamyltranspeptidase forthe biosynthesis oftheaninelu wen

3、- yuan, cheng hao； wang li- yuan, zhou j ian(key lab of tea chemical engineeri ng, minis try of agriculture, tea research institute,chinese academy of agricultural sciences, hangzhou 310008)abstract: this article studied the optunization ofcultivation medium for the genetically engineered escherichi

4、a coli stra in of glutamyltrans peptidase ibr the biosynthesis of theani nc. plackett-buitna n dcsig n was underta ke n to e va lua te the effects of six cultiva tion medium factors, glucose, ye a s t extiact and k2hp o4 were found to be the critical for the factors activity of 丫- ggt then response

5、surface methodology was used t( optimize the a bove critica 1 factors, the optimum levels of the factors were glucose 10.39 g/l, yeast extract 6.8w g/u k2hpo4 7.10 g/l, with a predicted 丫- ggt activity of 4.42 u/ml, and the experimenta 1 y- ggt activity obtained was 4.40 u/ml the yieid of theanine f

6、rom l- gin and ethylamine was 32.22 g/lkey words: theanine; y- glutamyltranspeptidase; placke® burman design; response suiiace methodology收犒日期：2007-11- 13*通訊作者作者簡介：陸文淵(1982)，男，浙江海寧人，碩士研究生，研究方向?yàn)椴枞~生物工程。茶氨酸(theanine)是茶葉屮一種具有鮮爽味的特 征物質(zhì)，對于茶氨酸的研究已經(jīng)成為了當(dāng)前茶葉科 學(xué)的熱點(diǎn)之一。已有大量研究報(bào)道了茶氨酸對人體 的多種保健功能3】，這些研究結(jié)果表明，茶氨酸

7、具 有很高的醫(yī)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。但由于從茶葉中提 取高純度的茶氨酸，成本菲常昂貴，因此有關(guān)它的 合成制備研究越來越受到重視。之前采用的化學(xué)合 成、茶細(xì)胞培養(yǎng)等方法雖然能生成茶氨酸，但均存在 一定的局限性。隨著基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)的發(fā) 展，通過構(gòu)建具有茶氨酸合成能力的基因工程菌來 發(fā)酵生產(chǎn)茶氨酸是其生物合成的一條有效途徑。細(xì)菌中的卩谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶可以將谷氨酰胺上y 谷氨?；D(zhuǎn)移到乙胺受體上，催化合成茶氨酸氣慶 此，y- ggt活性的高低將決定茶氨酸生物合成的產(chǎn) 量。本實(shí)驗(yàn)室己成功將e.coli dh5 u的ggt基因 與載體pet- 32a相連接形成重組質(zhì)粒pet-ggt,并 將其轉(zhuǎn)化至e.co

8、li bl21屮，構(gòu)建了具有茶氨酸生物 合成能力的基因工程菌叫為了進(jìn)一步了解該基因工 程菌發(fā)酵培養(yǎng)基中關(guān)鍵營養(yǎng)成分對yggt活性的影 響效果，提高茶氨酸的產(chǎn)量，為今后進(jìn)一步地研究 應(yīng)用提供依據(jù)，本研究根據(jù)大腸桿菌生長所需營養(yǎng) 耍素的基本原則以及其發(fā)酵的一般規(guī)律，結(jié)合和興 文獻(xiàn)報(bào)道與前期實(shí)驗(yàn)"，采用plackett- burman設(shè)計(jì) 法及響應(yīng)面法，對影響該基因工程菌yggt活性矗 培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察和評價(jià)，對篩選得到的關(guān)鍵晟 響因索及其交互作用做進(jìn)一步的研究和探討，以確 定適合該基因工程菌生長利最佳fggt活性產(chǎn)生矗 最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基。1材料與方法 1.1供試菌株含有細(xì)菌y-ggt基因

9、的大腸桿菌工程菌 pet32a- ggt由木實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。1.2儀器與試劑infors agch-4103 控溫?fù)u床，waters 效液 相色譜儀，beckman avanti j- 301 離心機(jī)，tomy ss- 325滅菌鍋，shimadzu uv- 2550紫外可見分 光光度計(jì)，tliermo forma超凈臺；瓊脂糖、蛋白腺、酵母提取物：oxoid公司； 茶氨酸標(biāo)樣：日木太陽化學(xué)；f谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶測定 試劑：北京華宇億康生物工程公司；其他分析試劑： 國產(chǎn)分析純。1.3培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：lb液體培養(yǎng)基，含amp 50蛔mlo發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母提取物，蛋口 腺，nacl, k

10、2hpo mgso, -7h2o,含 amp 50 ng/ inlo1.4培養(yǎng)方法収活化后的斜面試管菌種接入盛有50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在搖床中37 °c、180 r/ min振蕩培養(yǎng)12 ho吸取().5 ml種子發(fā)酵液至盛有 50 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，37 °c、180 r/rnin振蕩培養(yǎng)4 h(od«jo約0.8),然后加入0.05 mmol/ liptg, 32 °c誘導(dǎo)4 h,測定卩谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性。 1.5測定與分析方法細(xì)胞生長光密度(od值)的測定：發(fā)酵液經(jīng)稀釋后 以空白培養(yǎng)基為對照，丁波長600 n

11、m進(jìn)行比色測 定，od“滬od血讀數(shù)痂釋倍數(shù)。yggt的測定(glupa底物法)：將發(fā)酵液離心收 集菌體，加入1 ml y-ggt測定試劑于37 °c反應(yīng) 15min,反應(yīng)結(jié)束后離心，取上清液在405 nm波長 下測吸光度變化，依公式計(jì)算fggt活性大小。k 活定義為在37 °c條件下，每分鐘產(chǎn)生1 nmol對硝毘 苯胺所需的卩ggt量定義為一個酶活單位?；蚬こ叹呋铣刹璋彼岬姆椒ǎ簩⒎磻?yīng)體 系(l-谷氨酰胺0.35 mol/l,鹽酸乙胺2.0 mol/l.菌 體 7() mg/ml, ph9.5)在 180 r/min、32 °c條件下反應(yīng) 4 h后沸水浴5

12、 min,然后室溫12000 r/min離心5 min,收集上清液，hplc測定茶氨酸含量叫培養(yǎng)基優(yōu)化方法：釆用plackett- buiinan設(shè)計(jì)法 及響應(yīng)面法，并用sas軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，design expert軟件輔助作圖。2結(jié)果與討論2.1 plackett- burman設(shè)計(jì)篩選重要因素plackett- burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種兩水平實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)方法，它可以利用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，從眾多 的考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因素， 因此廣泛地用于因素主效應(yīng)的估計(jì)w根據(jù)重組 大腸桿菌發(fā)酵的一般規(guī)律及前期實(shí)驗(yàn)，本階段選 用實(shí)驗(yàn)次數(shù)為8的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對葡萄糖(xi)、酵母 提取物(x2)

13、、蛋 口 腺(x3)、nacl(x4)、k2hpq(x5), mgso； -7h2o(x6)6個因索進(jìn)行考察，每個因素分別 取兩個水平，高水平取低水平的1.5倍，評價(jià)指 標(biāo)(響應(yīng)值)為y- ggt活性，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表1和表2o表1 plackett- burman實(shí)嵋設(shè)計(jì)因索水平及編碼相關(guān)因素代碼編碼水平編碼未編碼-11匍萄糖/(g/l)xx>1015酵母提取物/(g/l)x2x257.5蛋白腺/(g/l)x3x.1015nacl/(g/l)x4&1015k2hpo4/(g/l)x5x546mgso4-7h2o/(g/l)£11.5注：表中自變址編碼方程為：x

14、-v氏中&為自變蚩編碼值.x為白變世實(shí)驗(yàn)水平實(shí)際值.x為實(shí)驗(yàn)水平中心點(diǎn)實(shí)際值.ax為單變膛 增量。驗(yàn)理 實(shí)處xix2x3x4x5x6酶活 /(u/ml)1-1 1-11113.6421 1-1-1-113.443-1111114.30411-11-1-14.025 11111 13.2861111113.887-111-1-113.7681111114.34在木研究采用的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)條件下，采用 sas軟件對各因素主效應(yīng)進(jìn)行分析。從分析結(jié)果(表 3)可看出，影響卜ggt活性的培養(yǎng)基成分的重要怙 排序?yàn)椋航湍柑崛∥颽k/hpoq葡萄糖mgso；7hq: 蛋口腺nacl。其中酵母提取物、

15、k2hpo4.葡萄糖濃 度對卩ggt活性的影響達(dá)到了顯著水平。因此，選 取葡萄糖、酵母提取物、k2hpo4這3個因素做進(jìn)一 步響應(yīng)面分析，以確定這3個關(guān)鍵因素所對應(yīng)的最 優(yōu)水平。mgsomhq、蛋白腺、nacl 3個因素的確 定根據(jù)效應(yīng)的正負(fù)和節(jié)約成本的原則，將其質(zhì)量濃 度控制在較好水平上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表3各因素主效應(yīng)分析結(jié)果自由度平方和均方f值大于f 的概率模型61.014700.16912375.8150.0395殘差10.000450.00045和關(guān)因素自由度參數(shù)估計(jì)t檢驗(yàn)大于t 的概率重要性截距13.832500511.000().0012葡萄糖/(g/l) 酵母提取物10.0875001

16、1.6670.0544310.27250036.3330.01751蛋白 b/(g/l)1 0.017500 2.3330.25785naci/(g/l)1-0.012500-1.6670.34406khpo/cg/l)10.20750027.6670.02302mnso4-7h.o/(g/l)1 0.037500 5.000().125742.2*谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性響應(yīng)而法分析與優(yōu)化響應(yīng)面法(response surface methodology, rsm) 可以通過建立連續(xù)變量曲面模型，對影響實(shí)驗(yàn)過程 屮的因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評價(jià)，該法 已廣泛應(yīng)用于各種過程的優(yōu)化分析中問。本階段

17、實(shí)驗(yàn) 研究采用box- behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，對發(fā)酵過程 中影響yggt活性的關(guān)鍵因素葡萄糖、酵母提取物、 k?hpoj的質(zhì)量濃度做進(jìn)一步研究和探討，以獲得其 最佳濃度水平范圍。box- behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié) 果見表4和表5。在木研究采用的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)條件下，運(yùn)用關(guān)鍵影響因素編碼水平-10 1衙萄糖/(g/l) a7.51012.5酵母捉取物/(g/l) b2.557.5k2hpo4/(g/l) c369表5box- behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)處理abc幽活性/(u/ml)1 1 103.602 1013.713-1013.8541103.9750-1-14.

18、0360114.2970114.2180114.3391104.09101013.92111014.151211049130004.37140004.30150004.39sas軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及二次多項(xiàng)回歸擬 合(表6),得到fggt活性對葡萄糖、酵母提取物、 khpoj質(zhì)量濃度的多元回歸模型：y =4.353333 +0.152500a +0.086250b +0.093750c - 0.349167a2 0.041667b2 -0.096667c2 - 0.067500ab + 0.022500ac- o.o35ooobc式屮：y為卩ggt活性的預(yù)測值；abc分別為上述3個自變

19、量的編碼值。上述方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明：因素a、 b和c對卩ggt活性的線性效應(yīng)顯著；ab對卩ggt 活性的交互效應(yīng)影響顯著，其曲面效應(yīng)也顯著，而 ac、bc對其交互效應(yīng)影響不顯著。從表6屮可知， 用上述冋歸方程描述葡萄糖、酵母提取物、k.hpo 與卩ggt活性z間的關(guān)系時(shí)，其線性關(guān)系是顯著的 決定系數(shù)為0.9791,回歸方程擬合度很好。由表7可知，該回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，wgg1 活性的最大估計(jì)值4.415021 u/ml, 3個主因素取值 分別為葡萄糖10.393418 g/l、酵母提取物6.883665 g l、k2hpo4 7.100475 g/lo采用培養(yǎng)基優(yōu)化值在相叵 培養(yǎng)條件

20、下進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到y(tǒng)ggt活 性的平均實(shí)測值為4.40 u/ml.與預(yù)測值非常接近， 說明本實(shí)驗(yàn)所采用的方法對該基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng)基 優(yōu)化是可靠的。通過design expert軟件作了葡萄糖和酵母提取物表6 yggt活性二次多項(xiàng)式模型方差分析及 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)回歸項(xiàng)自由度平方和f檢驗(yàn)大于f的概率一次項(xiàng)30.31587530.4460.0012平方項(xiàng)30.46861745.1680.0005交互項(xiàng)30.0251502.4240.1814總回歸90.80964226.0130.0011相關(guān)因素自由度參數(shù)估計(jì)t檢驗(yàn)大于t的概率截距14.353333128.20.0000a10.1

21、525007.3350.0007b10.0862504.1480.0089c10.0937504.5090.0063a21-0.349167-11.4090.0001ba1-0.067500 2.2960.0702b2i-0.041667-1.3610.2315ca10.0225000.7650.4787cb1-0.035000 1.1900.2873c21 0.096667 3.1590.0251離回歸偏差(root mse)： 0.058808 決定系數(shù)(r- square): 0.9791表7 yggt活性響應(yīng)面分析關(guān)鍵點(diǎn)值因素編碼值未編碼值繭萄糖/(g/l) a0.15736710.3

22、93418酵母捉取物/(g/l) b0.7534666.883665kphpcmfe/l) c0.3668257.100475¥ ggt活性最人預(yù)測值/(u/ml) 丫4.415021二賓“工y"；t活性/(u/ml)hvi. ki(> )1圖2 khp(*7.iog/l.時(shí)純萄糖和酵母提取物交互影響 >-< :(;r活忖船曲面團(tuán)尺苴m扈緯團(tuán)交互影響yggt活性的曲面圖及其等高線圖(圖2), 發(fā)現(xiàn)當(dāng)k.hpo.為最佳(7.1 () g/l)時(shí),由其橢圓形等高 圖可以直觀地看出，葡萄糖和酵母提取物這兩因索顯 著的交互作用，并且在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)葡萄糖濃 度

23、較低時(shí)，獲得較高活性fggt的酵母提取物為7 g/l,當(dāng)酵母提取物濃度低于7妙l時(shí)，適當(dāng)增加酵母 提収物的量可以減少葡萄糖的用量，從而可以減少該 基因工程菌代謝過程中抑制物質(zhì)乙酸的積累，防止發(fā) 酵液ph值過低，從而影響該基因工程菌生長。2.3最佳培養(yǎng)基濃度下發(fā)酵所得基因工程菌催化合成 茶氨酸在最佳培養(yǎng)基濃度(葡萄糖10.39妙l、酵母提取物 6.88 g/l、k2hpo4 70 g/l、蛋白腺 10 g/l、nacl 1( g/l、mgso47h2o 1 g/l)下發(fā)酵培養(yǎng)所得的茶氨酸生 物合成基因工程菌催化l-谷氨酰胺和鹽酸乙胺反應(yīng) 生成的茶氨酸產(chǎn)量為32.22 g/l,谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率 為

24、52.8%,比文獻(xiàn)報(bào)道(“均有所提高。3結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了具有茶氨酸生物合成能 力的fggt基因工程菌后，為了將其進(jìn)一步應(yīng)用于 實(shí)際生產(chǎn)中，首先遇到的問題是其牛物過程的優(yōu)化, 而培養(yǎng)基是該慕因工程菌生長的環(huán)境，是其主耍的物 質(zhì)和能量來源，因此，如何使培養(yǎng)基各因索達(dá)到最優(yōu) 值，從而使產(chǎn)ggt基因高效表達(dá)、酶活有效增加、 茶氨酸產(chǎn)量和產(chǎn)率顯著提高是首要解決的問題。本 硏究利用了 plackett- burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)快速有效地篩 選出影響yggt活性的關(guān)鍵培養(yǎng)基因素，在此基礎(chǔ) 上，通過響應(yīng)面法建立了二次多項(xiàng)冋歸模型，確定了 關(guān)鍵因素所對應(yīng)的最優(yōu)水平及卩ggt活性的最大預(yù) 測值。在本研究采用

25、的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)條件下.當(dāng)培 養(yǎng)基配方為葡萄糖10.39 g/l、酵母提取物6.88 g/l. k2hpo4 70 g/l、蛋口 月東 10 g/l、nacl 10 g/l、 mgsor7h2o 1 g/l時(shí)，y- ggt活性的最大預(yù)測值為 4.42 u/ml,進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到丫 ggt活性的平 均實(shí)測值為4.40 u/ml,兩者相當(dāng)接近，表明本研處 所采用的方法科學(xué)合理且快速有效。通過最優(yōu)培養(yǎng)基 條件下得到的該基因工程菌催化合成茶氨酸的產(chǎn)量 為32.22 g/l,產(chǎn)率為52.8%。茶氨酸生物合成基因工 程菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的成功，讓筆者更加堅(jiān)定了對該 基因工程菌發(fā)酵合成茶氨酸生物過程和工藝

26、體系的 進(jìn)一步探索。參考文獻(xiàn)：i呂毅，郭雯飛,倪捷兒，等.茶氨酸的生理作用及合成jj.茶葉科學(xué),2003,30):1-5121高小紅，袁華，喻宗沅.茶氨酸的研究進(jìn)展|j|.化學(xué)與生物alcalase堿性蛋白酶水解甘薯蛋白的研究吳廣輝巴木泰華2,高愿軍i(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，關(guān)b州450002;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100094)摘要：通過測定水解度的方法，研究alcalase堿性蛋白酶對甘薯蛋白的水解效果，并探討了 ph、溫 度、酶用屋、底物濃度、水解時(shí)間對該酚水解效果的影響。通過正交實(shí)驗(yàn)和極差分析確定最佳工藝 條件為溫度45 °c,開始的ph值8

27、.0.底物濃度3%(w/v),酶與底物的濃&.比4%(w/v),水解時(shí)間240 min。此外，alcalase水解甘薯蛋口可分成3個不同分了量的組分。關(guān)鍵詞：甘薯蛋白；alcalase堿性蛋白酶；水解度中圖分類號：ts 201.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a文章編號：10059989(2008)07002204study on hydrolys is of sweet potato protein with alcalase proteasewu guang- hui1-2, mu tai- hua1-2*, gao yuan-jun1(1 .college of food and biology

28、engineering, zhengzhou university of light industry,zhengzhou 450002; 2.1nstitute of agro- food science and technology,chinese academy of agricultural sciences, beying 100094 )abstract: effect of alcalase protease on the hydrolysis of sweet potato protein was studied by determination of收稿日期：2007-11-20 水通訊作者基金項(xiàng)目：國家咼技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2006aa10z332)。作者簡介：吳廣輝(198i-x男，河南太康人.碩士研究生，研究方向?yàn)榱嫫坊瘜W(xué)與營養(yǎng)。工程,2004,(1):7-9 李平，宛曉春,張正竹生物合成茶氨酸的研究進(jìn)展及構(gòu) 、 建基因工程菌合成茶氮酸的可行性探討ij.食品與發(fā)酵 工業(yè),2004,30(1):71 75suzuki h, izuka s, miyakawa n, et al. enzyniatic pro 41d