紫外分光光度法

1、 紫外分光光度法 檢測山楂總黃酮方法的建立 作者：張 雪 , 丁長河 期刊：食品工業(yè)科技2007年第7期 匯報(bào)人：宋慧軍2摘要摘要 有關(guān)總黃酮的測定方法有有關(guān)總黃酮的測定方法有: 戴維斯法、薄層層析- 比色法、微分脈沖極譜法、硝酸鋁顯色法、紫外分光光度法等。 缺陷：缺陷： 鮮山楂果膠含量達(dá) 3.0%以上, 但上述方法均忽略了山楂果膠對(duì)總黃酮含量的影響。 本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及目的本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及目的 ：本實(shí)驗(yàn)針對(duì)上述檢測方法存在的問題, 根據(jù)現(xiàn)有條件對(duì)硝酸鋁顯色- 分光光度法進(jìn)行改進(jìn), 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,利用果膠酶將山楂果肉中的果膠分解后, 再進(jìn)行黃酮的含量分析, 減少果膠對(duì)檢測黃酮的影響, 建立起建立起更加

2、精確的紫外分更加精確的紫外分光光度法山楂總黃酮分析系統(tǒng)光光度法山楂總黃酮分析系統(tǒng), 旨在為山楂總黃酮的定量及生物功能評(píng)價(jià)提供檢測旨在為山楂總黃酮的定量及生物功能評(píng)價(jià)提供檢測方法方法31 材料與方法材料與方法 1.1 材料與儀器材料與儀器蘆丁對(duì)照品 ( Quercetin 3 - D- rutinoside) 中國藥品生物制品檢定所; 山楂鮮果 北京市密云縣產(chǎn),色澤鮮紅, 無病蟲害; 果膠酶 活力: 20000u/g, 天津市利華酶制劑廠; 1N NaOH 溶液, 5%NaNO2 溶液, 10%Al(NO3)3 溶液。 YP1200 電子天平, 手持糖度計(jì), 電熱恒溫水浴鍋 , 722S 分 光

3、 光 度 計(jì) , TGL- 16C 離 心 機(jī) , PHS- 25 酸度 計(jì) , 裹 包 式 榨 汁 機(jī) , 自 動(dòng) 電 位 滴 定 計(jì) , Biorad SmartspecTM3000 Spectrophotometer 紫外分光光度計(jì)( 美國伯樂公司) , FA1004 萬分之一分析天平 ( 上海精密儀器廠) , GL- 20B 冷凍離心機(jī)( 上海安亭科學(xué)儀 器廠) 。41.2 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理 ： 黃酮化合物的母核(圖 A)由 C6- C3- C6 即 A- C- B 三個(gè)環(huán)組成, A 環(huán)和 B 環(huán)具有芳香化合物的性質(zhì), C 環(huán)具有黃酮化合物的獨(dú)特性質(zhì)。 母核中某些

4、位置如母核中某些位置如 C3 和和 C5 上含有羥基時(shí)能與鋁、鉛等金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物上含有羥基時(shí)能與鋁、鉛等金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物, 這些絡(luò)合物在光譜上產(chǎn)生這些絡(luò)合物在光譜上產(chǎn)生明顯變化。明顯變化。 黃酮與金屬離子的這種作用不僅可以用于鑒別這類成分中羥基的位置, 還可以作為進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)就是采用這種原理本實(shí)驗(yàn)就是采用這種原理, 通過通過 Al3+與黃酮形成鮮黃色的絡(luò)合物與黃酮形成鮮黃色的絡(luò)合物( 圖圖 B, 圖圖 C) 在最在最大吸收波長處有一吸收峰然后比色測定而進(jìn)行定量的。大吸收波長處有一吸收峰然后比色測定而進(jìn)行定量的。51.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶

5、液配制精密稱取蘆丁對(duì)照品 10.03mg,加 60%甲醇適量, 置水浴中加熱溶解, 放冷, 以60%甲醇定容于 100mL 容量瓶中, 搖勻備用, 配成蘆丁含量為 0.103mg/mL 的工作液, 備用。1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立標(biāo)準(zhǔn)曲線建立1.2.3.1 最佳檢測波長選擇最佳檢測波長選擇 取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于 400600nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描, 確定黃酮的最大吸收波長。結(jié)果為510nm（文獻(xiàn)當(dāng)中沒有給圖）1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精確吸取濃度為 0.103mg/mL的 蘆 丁 標(biāo) 液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL, 置 于25mL 容量瓶中, 準(zhǔn)確加入 5

6、% NaNO2 溶液 1mL 搖勻, 放置 5min, 再準(zhǔn)確加入 10% Al( NO3) 3 溶液 1mL搖勻, 放置 6min, 然后加入 4mL 1N NaOH 溶液, 最后用 30%乙醇稀釋到刻度, 于溫水浴中加熱 10min 取出, 用 1cm 玻璃比色皿在 510nm 處測定吸光度 A,同時(shí)以未加標(biāo)準(zhǔn)蘆丁的溶液作空白參比。 以吸光度對(duì)標(biāo)樣含量毫克數(shù)作圖以吸光度對(duì)標(biāo)樣含量毫克數(shù)作圖。經(jīng)線性回歸表明, 蘆丁在 00.618mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系, 達(dá)到顯著水平。 典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 所示。 回歸方程為 Y=1.2389X+0.0039(r=0.9998, =0.01)。6 1.2

7、.4 樣品測定樣品測定 1.2.4.1 樣樣 品品 液液 制制 備備 方方 法法 稱 取 山 楂 鮮 果 約 50g 八份, 揀選、清洗后加蒸餾水 125mL, 浸泡 0.5h 后加熱軟化至 90, 用組織搗碎機(jī)打碎成勻漿, 冷卻恒溫至45后, 其中四份直接榨汁, 然后離心、過濾后定容至150mL 備用; 取另外四份加 0.07%的果膠酶, 45恒溫酶解 4h, 將已經(jīng)過酶解處理的樣品 90、15min 加熱滅酶, 然后榨汁, 離心、過濾后定容至150mL 待用。比較酶處理與非酶處理的結(jié)果。比較酶處理與非酶處理的結(jié)果。 1.2.4.2 樣品液測定方法樣品液測定方法 精確吸取樣液 5mL 兩份于

8、2 支 25mL 容量瓶中, 加 5% NaNO2 溶液 1mL 搖勻,放置 5min, 再準(zhǔn)確加入 10% Al (NO3)3 溶液 1mL 搖勻, 放置 6min, 然后加入 4mL 1N NaOH 溶液, 最后用30%乙醇稀釋到刻度, 于溫水浴中加熱 10min,取出,同時(shí)作試劑空白, 以試劑空白為對(duì)照, 于蘆丁最大吸光值處測定吸光度 A, 查標(biāo)準(zhǔn)曲線, 即得所取樣液中黃酮含量。 1.2.4.3 樣品中黃酮含量計(jì)算方法樣品中黃酮含量計(jì)算方法 樣品中黃酮含量( 以蘆丁計(jì)) ( %) =CV1/WV2; 式中: C- 樣液含黃酮量( mg) , V1- 定容體積( mL) , V2- 顯色反

9、應(yīng)測定取用樣液體積( mL) , W- 稱樣量( g) 結(jié)果：山楂原料中總黃酮含量為結(jié)果：山楂原料中總黃酮含量為 0.92%。7 每一組酶處理的山楂總黃酮含量都要比非酶處理的高出高出 2% 3%, 表明酶處理后再進(jìn)行榨汁, 山楂總黃酮含量有明顯的提高, 同時(shí)也說明果膠的存在有礙于總說明果膠的存在有礙于總黃酮的充分釋放。黃酮的充分釋放。 Pitifer,L.A.等人8認(rèn)為, 果膠酶作用于果膠含量高的水果能提高果蔬汁的營養(yǎng)物質(zhì)的含量。 這一結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。8 2.2 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和酶解處理的山楂樣品液, 隨著放置時(shí)間的推移, 于 1.2.4 樣品液測定條件下每

10、20min 測定其吸光度, 共 6 次, 分析測定總黃酮含量,并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差, 結(jié)果見表 1。標(biāo)準(zhǔn)液與樣品液中總黃酮含量的 RSD 均在均在 5%以下以下, 表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液與山楂樣液 2h 顯色很穩(wěn)定。9 2.3 精密度和準(zhǔn)確度驗(yàn)證 精 密 吸 取 蘆 丁 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 和 酶 處 理 的 山 楂 樣 品液, 重復(fù)測定 6 次, 分析總黃酮含量, 六次測定結(jié)果平 均 值 分 別 為 : 0.011% 、0.3% , 相 對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 為 :2.16%、3.2%, 標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣液黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣液黃酮含量的 RSD 均在均在5%以下以下, 表明本實(shí)驗(yàn)具有良好表明本實(shí)驗(yàn)具有良好的重現(xiàn)性的重現(xiàn)性, 條件合理。條件合理。 2.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱取以上樣品各數(shù)份, 分別添加適量標(biāo)準(zhǔn), 按前述操作進(jìn)行處理, 測定, 以加樣測得量減去原樣含量, 除以加樣量, 計(jì)算回收率, 結(jié)果見表 2。精密度( 重復(fù)測定樣品的 RSD) 5%, 平均回收率 98.4%, 達(dá)到了準(zhǔn)確測定山楂中黃酮含量的要求。103 小結(jié)小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)現(xiàn)有條件