全血線粒體DNA萃取試劑盒產(chǎn)品說明書中文版

1、全血線粒體DNA萃取試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)主要用途全血線粒體DNA萃取試劑是一種旨在通過化學(xué)溶解純化血白細(xì)胞、物理或化學(xué)破膜及離心處理獲得線粒體，然后進(jìn)一步生物酶處理以獲得高質(zhì)量的線粒體DNA的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物血細(xì)胞中的線粒體核酸成分處理。用于后續(xù)的雜交、克隆、酶切、PCR分析等。產(chǎn)品即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，無核酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。技術(shù)背景線粒體細(xì)胞器的研究是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的最重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細(xì)胞凋亡、腫瘤、HIV、老年癡呆癥、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要對(duì)象。線粒體DNA的分離和定量以及突

2、變分析是研究中必不可少的。產(chǎn)品內(nèi)容溶血液(Reagent A)毫升清理液(Reagent B)毫升裂解液(Reagent C)毫升凈化液(Reagent D)毫升強(qiáng)化液(Reagent E)毫升保存液(Reagent F)毫升破膜液(Reagent G)毫升去干擾液(Reagent H)微升酶解液(Reagent I)微升萃取液(Reagent J)毫升濃縮液(Reagent K)毫升助沉液(Reagent L)微升沉淀液(Reagent M)毫升純化液(Reagent N)毫升緩沖液(Reagent O)毫升產(chǎn)品說明書1份保存方式保存凈化液(Reagent D)、 去干擾液(Reagent

3、H)、 酶解液(Reagent I)、萃取液(Reagent J和 助沉液(Reagent L)在20°C冰箱里，其余的保存在4 °C冰箱里，有效保證 6月用戶自備1.5毫升離心管：用于核酸操作的容器15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備的容器50毫升錐形離心管：用于血細(xì)胞處理的容器渦旋震蕩儀：用于混勻4C微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞和核酸4'C超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞58 C恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物實(shí)驗(yàn)步驟一、白細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)開始前，室溫預(yù)熱血溶液(Reagent A),同時(shí)4C預(yù)冷 清理液(Reagent B)。然后進(jìn)行下列操

4、作。1. 準(zhǔn)備2個(gè)無菌的50毫升錐形離心管2. 輕輕混勻新鮮的EDTA抗凝的全血樣品3. 分別移出5毫升全血樣品到每個(gè) 50毫升錐形離心管4. 分別加入毫升室溫預(yù)熱的 血溶液(Reagent A)5. 輕輕上下傾倒離心管 5次，確保充分混勻6. 室溫下(25C)孵育4分鐘，期間輕輕上下傾倒離心管數(shù)次(注意：肉眼可以觀察到血液顏色由不透 明紅色到清澈紅色的變化)7. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g& 小心抽掉上清液，留下 500微升液體，以防抽掉白細(xì)胞顆粒群9. 用手指輕彈離心管2至3下，使白細(xì)胞顆粒群松動(dòng)10. 分別加入毫升預(yù)冷的 清理液(Reagent B)，混勻細(xì)胞11.

5、 2管50毫升錐形離心管合并為 1管12放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g13. 小心抽去上清液14. 加入毫升預(yù)冷的 清理液(Reagent B)，混勻細(xì)胞15放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g16.小心抽去上清液，確保沒有液體殘留(注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)一70C冰箱里)二、白細(xì)胞線粒體分離實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的 凈化液(Reagent D)凍融，然后移出毫升 凈化液(Reagent D)和 毫升的 裂解液(Reagent C)到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作，根據(jù)用戶要求選擇其中一種方法：方法一：細(xì)胞勻漿法1.

6、 加入預(yù)冷的毫升裂解工作液2. 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群3. 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器4. 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞(約 20至40下)(注意：參見注意事項(xiàng)11)5. 將所有細(xì)胞勻漿物移入 15毫升錐形離心管6. 放進(jìn)4'C臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g7. 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管一一此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞8 放進(jìn)4C超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g9.小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 一一此步驟獲得線粒體沉淀物方法二、化學(xué)處理法1. 加入預(yù)冷的毫升裂解工作液2. 渦旋震蕩5秒，充分混勻3. 在冰槽里孵育2分鐘，其中每

7、間隔一分鐘渦旋震蕩5秒4. 加入預(yù)冷的微升 強(qiáng)化液(Reagent E)5. 渦旋震蕩5秒，充分混勻6. 在冰槽里孵育5分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5秒(注意：參見注意事項(xiàng)12)7. 加入預(yù)冷的毫升 保存液(Reagent F)，用手指輕彈混勻8 放進(jìn)4C臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g9. 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管一一此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞10. 放進(jìn)4C超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g11小心抽去上清液，保留沉淀顆粒一一此步驟獲得線粒體沉淀物三、DNA萃取1. 加入 微升破膜液(Reagent G)到線粒體顆粒樣品中2. 渦旋震蕩15秒

8、，混勻顆粒群3. 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管4. 置入冰槽中孵育15分鐘5. 加入 微升 去干擾液(Reagent H)6. 用200微升槍頭上下抽吸混勻7. 放進(jìn)37C恒溫水槽孵育15分鐘8 加入 微升酶解液(Reagent I)9.渦旋震蕩15秒10放進(jìn)58C恒溫水槽或干式恒溫儀孵育2小時(shí)(注意：可以孵育4至16小時(shí)，增加萃取產(chǎn)量)11置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)(或置于冰槽里15至30秒)12. 加入 微升 萃取液(Reagent J)(注意：使用前搖勻)13 渦旋震蕩15秒14.放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心 10分鐘，速度為16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5

9、415)15移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管(注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物)16. 加入微升 濃縮液(Reagent K)17. 加入微升助沉液(Reagent L)18. 加入微升 沉淀液(Reagent M)19在渦旋震蕩儀上震蕩 15秒，充分混勻20.放進(jìn)微型臺(tái)式微型離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5415)(注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒)21 小心抽掉上清液22. 加入毫升純化液(Reagent N)23. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g (或13000RPM，例如eppen

10、dorf 5415)24. 小心抽掉上清液25. 空氣中晾干沉淀顆粒群26. 加入微升緩沖液(Reagent O)27溶解后放進(jìn)20C冰箱長期保存或移出 2微升進(jìn)行PCR反應(yīng)注意事項(xiàng)1. 本產(chǎn)品為20次操作2. 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是 裂解液(Reagent C)和 保存液(Reagent F)3. 線粒體操作均須在4 °C或以下狀態(tài)下進(jìn)行4. 操作時(shí)，須戴手套5. 建議使用新鮮全血6. 全血樣品采集建議使用EDTA血液抗凝液(HL12054.1 )、ACD血液抗凝液(HL12054.2 )或肝素鈉血液抗凝液(HL12054.3 )7. 試劑中的溶液使用前搖勻；酶解液(Reag

11、ent I)需放進(jìn)37C溫育少許；為避免反復(fù)凍融，建議適量 分裝8 建議全血樣品和 血溶液(Reagent A)充分混勻，否則造成血紅細(xì)胞的不完全溶解9. 建議全血樣品和 血溶液(Reagent A)孵育時(shí)間避免過長，不宜超過5分鐘，以防白細(xì)胞損害10. 每毫升全血平均可獲得 2.5 X 106白細(xì)胞11通常勻化次數(shù)為 20至40下(或細(xì)胞顆粒群消失為止)達(dá)到80%的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加勻化次數(shù)12通常孵育5分鐘(不宜超過5分鐘)達(dá)到80%的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察 3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)13. 可以通過增加線粒體溶解時(shí)間(30分鐘)和酶解時(shí)間(直至 16小