薯莨提取物體外抗人型支原體作用

1、薯淺提取物體外抗人型支原體作用摘要目的從中藥薯董中提取具有體外抗人型 支原體作用的成分，并測定其最小抑菌濃度，為開發(fā)薯葭提 供依據(jù)。方法采用超聲提取法醇提，d101大孔樹脂梯度洗 脫的方法得到不同的洗脫流分，經(jīng)固體培養(yǎng)法初篩具有體外 抑制人型支原體作用的流分，再經(jīng)液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)法測 定其mic范圍和mic50值。結(jié)果薯萇正丁醇部位經(jīng)d101 大孔樹脂梯度洗脫，其中25%乙醇洗脫流分具有較好的體外 抑制人型支原體的作用，其mic范圍是(16/32128) mg/ml, 而mic50為32 mg/mlo結(jié)論 薯菽具有抗人型支原體作用的 開發(fā)和研究價值。關(guān)鍵詞薯萇；人型支原體；最低抑菌濃度中圖分

2、類號r285 文獻標識碼b 文章編號 1673-9701 (2013) 26-0102-02泌尿生殖道支原體感染是非淋菌性尿道炎(ngu)的重 要病因之一。近年來，泌尿生殖道支原體感染受到普遍重視。 但隨著臨床上日趨嚴重的抗菌藥物濫用，泌尿生殖道支原體 耐藥性也不斷發(fā)生著變化。因此，從中草藥中尋找有效治療 藥物越來越受到重視。薯萇(dioscorea cirrhosa lour.) 是薯菽科薯菽屬的一種藤本植物，其藥用有效成份主要包括 塊莖中的酚類、昔類等。本品味微苦、澀，性微寒，藥理作 用包括活血止痛、止血止癢、解毒抗菌1、收縮子宮平滑 肌2和治療應(yīng)激性潰瘍3等。目前國內(nèi)外對中藥薯罠的研 究

3、非常少，而有關(guān)其有效成份方面的研究則更少。近年來本 課題組的研究表明，薯淺提取物具有降壓作用4。同時， 薯萸浸膏對泌尿生殖道人型支原體(mycoplasma hominism, mh)也有較強的抗菌作用，并找到薯萇抗泌尿道人型支原體 作用的有效部位，為臨床上治療泌尿生殖道支原體感染篩選 新藥和有效開發(fā)中草藥薯萇提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。1材料與方法1. 1實驗材料1. 1. 1培養(yǎng)基a7固體培養(yǎng)基購自法國梅里埃生物公 司。人型支原體液體培養(yǎng)基按照文獻5方法配制。1： 1牛 心消化液、10%新鮮酵母液、20%新生小牛血清、0. 002%酚 紅、青霉素20 000 u/lo加0.1%精氨酸,ph調(diào)至6

4、. 5。1.1.2支原體株從泌尿生殖道感染患者的標本中分離 獲得30株人型支原體(mh)菌株，經(jīng)初步鑒定5,傳代3 次后，保存于-70工備用。實驗菌液：取保存的備用菌液， 在室溫下融化，用人型支原體液體培養(yǎng)基按1： 100稀釋， 37°c培養(yǎng)2448 h后達106顏色變化單位(color changing unit, ccu) /0. 1 ml 作為接種物6。1. 1.3提取物的制備原藥處理取8. 1 kg薯萇塊莖 (采自湖南省平江縣，經(jīng)南華大學生藥學鑒定，標本存放于 南華大學藥物藥理研究所），洗凈，干燥，粉碎。在75%乙醇 中浸泡4 h,超聲回流提取4次，得總浸膏1 612.5 g

5、o取 浸膏850.0 g （相當于原藥材4 269.8 g）,加水4 l,充分 攪勻，依次用石油瞇、乙酸乙酯、正丁醇萃取。萃取液減壓 蒸館濃縮，揮干，稱重，得石油瞇部位13.17 g,乙酸乙酯 部位247. 05 g和正丁醇部位445. 00 god101大孔樹脂 分離活性跟蹤結(jié)果顯示正丁醇部位具有體外抗人型支原體 的活性。取正丁醇萃取成份320. 0 g （相當于原藥材3 070. 4 g） ±d101大孔吸附樹脂柱（5.5x120 cm）,依次用水和不 同濃度（梯度為5%）的乙醇洗脫，每濃度洗6個柱體積（bv）。 收集各濃度洗脫流分，濃縮，揮干。5%、10%、15%、25%、 3

6、0%、35%洗脫流分依次命名為a、b、c、d、e、f。稱重分別 為 24.61 g. 18. 14 g. 12. 10 g. 24. 75 g. 12.48 g. 6. 20 go1.2實驗方法1.2. 1初篩實驗 取相同重量各洗脫部位組分分別溶于 1%二甲基亞磯（dms0）溶液配成相同濃度（預(yù)實驗用1%二 甲基亞楓，沒有發(fā)現(xiàn)有抗人型支原體的作用）。取a7固體培 養(yǎng)基，37恒溫箱復(fù)溫10 min,將培養(yǎng)基均分為三個區(qū)，在 不同區(qū)中央滴入同一洗脫部位的1% dms0溶液50 ul,倒置 lomin,無菌接種環(huán)在藥液區(qū)內(nèi)均勻接種mh菌株，c02培養(yǎng) 箱培養(yǎng)，選擇1% dmso溶液作為陰性對照，o.

7、lg/ml阿奇霉 素溶液作為陽性對照。培養(yǎng)96 h后，取出培養(yǎng)基，倒置，在10倍物鏡顯微鏡下，觀察視野中煎蛋樣菌落，順時針方 向在三個區(qū)中各取5個視野，記錄菌落數(shù)7。根據(jù)a7固體 培養(yǎng)基說明書，以平均每個視野中菌落數(shù)1.3統(tǒng)計學方法采用spss13. 0統(tǒng)計學軟件，計量資料采用均數(shù)加減標 準差表示，多組間比較采用方差分析，兩兩采用t檢驗。 p45°c)o e和f組分為黃色粉末狀物質(zhì)，易溶于甲醇、乙醇、 二甲基亞磯等，溶于熱水(>70°c)o2. 2初篩實驗各洗脫部位均配成0.2 g/nil濃度進行初篩實驗。結(jié)果 顯示，d組分具有明顯的體外抗人型支原體作用，見表1。2.

8、 3最小抑菌濃度測定經(jīng)液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)法培養(yǎng)結(jié)果見表2,兩種培養(yǎng)法測 定的最小抑菌濃度相近。3討論人型支原體是女性泌尿生殖道感染的常見病原之一，可 引起盆腔炎、急性腎盂腎炎等多種生殖道疾病和創(chuàng)傷感染、 支原體血癥等生殖道外感染9。因此，mh感染日漸為人們 所重視，不斷有抗支原體新藥問世。中藥薯萇為薯鎖科植物。其藥用有效化學成分包括皂昔 類和生物堿等。既往研究證實，薯籟科植物的總皂昔成分具 有治療心血管疾病、平喘、抗炎和抗腫瘤等多種作用10, llo而其抗人型支原體作用卻未見報道。筆者在對薯萇有 效成分的提取和分離的實驗中，發(fā)現(xiàn)薯萇正丁醇部位通過 d101大孔樹脂梯度洗脫后，25%乙醇洗脫流分

9、具有較好的體 外抑制人型支原體的作用。經(jīng)液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)法證實， 其 mic 范圍為(16/32128) mg/ml,而 mic50 為 32 mg/mlo 兩種培養(yǎng)方法有一定的偏差，主要是因為該流分有較深的顏 色影響了結(jié)果的判斷。臨床上人型支原體一般采用液體培養(yǎng)法，依據(jù)培養(yǎng)液的 顏色變化情況判斷支原體的存在與否，結(jié)果容易分辨，但缺 點是容易污染及可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果12o同時大部分的中 藥提取液本身具有顏色，與培養(yǎng)液混合后，容易使結(jié)果的判斷產(chǎn)生偏差。a7固體培養(yǎng)基作為經(jīng)典的解淼和人型支原體分 離的培養(yǎng)基，具有在低倍鏡下觀察菌落數(shù)既直觀又可靠的優(yōu) 點12 o由于本實驗中梯度洗脫的各流分均有較深

10、的顏色， 可以影響液體培養(yǎng)法中藥敏試驗結(jié)果的判斷。本實驗采用人 型支原體直接劃線固體培養(yǎng)法對各流分先進行初篩，再采用 液體-固體聯(lián)合培養(yǎng)法測定有效流分的mic范圍和mic50,既 解決了單純液體培養(yǎng)法中各流分顏色的影響，又可以解決單 純的固體培養(yǎng)法中各流分的濃度難以精確稀釋的問題。本實驗證實了中藥薯萇具有較好的抑制體外人型支原體的作用。25%乙醇洗脫流分是一個具有成千上萬個單體的 混合物，導致最小抑菌濃度數(shù)值偏大。而且，其中的有效單 體成分還需在接下來的提取和分離實驗中經(jīng)活性跟蹤的方 法深入研究。但本實驗結(jié)果為開發(fā)中藥薯萇，深入研究其藥 理作用，尋找新的具有抑制人型支原體作用的藥物提供了線 索

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