第3周實驗1農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥轉(zhuǎn)化-II

1、發(fā)育生物學(xué)實驗 主講教師：薛秀花 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2016年 一、擬南芥簡介一、擬南芥簡介 二、實驗技術(shù)-農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥轉(zhuǎn)化實驗實驗1 1 擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)觀察及擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)觀察及 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥 農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥的轉(zhuǎn)化 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?、學(xué)習(xí)真核生物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化原理、學(xué)習(xí)真核生物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化原理2、掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥、掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥 的實驗方法的實驗方法3、了解擬南芥的生理特點及在基因工程實驗中應(yīng)用。、了解擬南芥的生理特點及在基因工程實驗中應(yīng)用。 實驗材料實驗材料農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌GV3101重組菌株，重組雙元表達載

2、體重組菌株，重組雙元表達載體pCAMBIA1300 ，擬南芥擬南芥 實驗試劑實驗試劑LB液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基，Kan（卡那霉素），（卡那霉素），Rif（利福平）；（利福平）；轉(zhuǎn)化介質(zhì)轉(zhuǎn)化介質(zhì) ：MS培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、5%蔗糖，蔗糖，0.03%SilwetL-77，KOH調(diào)調(diào)pH 5.7。 實驗原理實驗原理植物遺傳轉(zhuǎn)化植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因槍法基因槍法PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)誘導(dǎo)原生質(zhì)體體電穿孔法電穿孔法操作簡單，易造操作簡單，易造成原生質(zhì)體損傷成原生質(zhì)體損傷雙子葉植物雙子葉植物無宿主限制，無宿主限制，技術(shù)限制技術(shù)限制原生質(zhì)體培原生質(zhì)體培養(yǎng)養(yǎng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥的轉(zhuǎn)化浸花法浸花法葉盤法葉盤

3、法原生質(zhì)體共培養(yǎng)原生質(zhì)體共培養(yǎng)創(chuàng)傷植物感染法創(chuàng)傷植物感染法 實驗原理實驗原理農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥的轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌的感染與生存農(nóng)桿菌的感染與生存 技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用一種方便，高效的植物轉(zhuǎn)基因方法，多用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物，一種方便，高效的植物轉(zhuǎn)基因方法，多用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物，經(jīng)過改進后也逐漸用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化。經(jīng)過改進后也逐漸用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化。 實驗原理實驗原理農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥的轉(zhuǎn)化McKinney et al 2001擬南芥轉(zhuǎn)基因技術(shù)：擬南芥轉(zhuǎn)基因技術(shù)：In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Ar

4、abidopsis thaliana plants. C R Acad Sci Ser III Sci Vie Life Sci1、影響因素 MS salts, hormone, OD of bacteria, vacuum, etc. 無影響 Plant health 非常重要因素2、轉(zhuǎn)化效率： 1%3、轉(zhuǎn)化步驟a、Grow healthy Arabidopsis plants until they are flowering.8、高壓滅菌、高壓滅菌 （1） MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基（121C,15分鐘）分鐘）。 （2）玻璃燒杯：）玻璃燒杯：200ml 2個、個、500ml 1個、個、 50ml的三角瓶的三角瓶 20個、培養(yǎng)皿個、培養(yǎng)皿8個（個（ 4培養(yǎng)皿裝濾紙，培養(yǎng)皿裝濾紙，6片片/平皿）。平皿）。 （3）槍型鑷子、剪刀各）槍型鑷子、剪刀各2把。把。 （4）1ml、200ul、20ul的的tip頭各頭各1盒。盒。 (5)無菌水無菌水500700mL*2擬南芥轉(zhuǎn)基因技術(shù)：擬南芥轉(zhuǎn)基因技術(shù)： McKinney et al 20011、影響因素 MS salts, hormone, OD of bacteria etc.2、3、4、作作 業(yè)業(yè)預(yù)習(xí)：煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)和器官發(fā)生預(yù)習(xí)：煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)和器官發(fā)生課后