培養(yǎng)細(xì)胞常用染色與固定方法

1、培養(yǎng)細(xì)胞常用染色與固定方法培養(yǎng)細(xì)胞常用染色與固定方法一、普通染色觀察蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色和Giemsa染色是觀察培養(yǎng)細(xì)胞一般形態(tài)的最常用方法， 也是把細(xì)胞作為標(biāo)本保存的主要方法。 對于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，以生長于蓋玻片和塑料培養(yǎng)瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理鹽水清洗培養(yǎng)物2次，去除妨礙染色的血清。固定后可將蓋玻片用樹膠貼于載玻片上，以利操作。對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，須先經(jīng)離心沉淀(1000rmin，10min)， 棄上清液后(留少量液體)， 將細(xì)胞懸液滴于玻片上做成涂片， 冷風(fēng)吹干。（一）HE染色法1.染液配制(1)蘇木精染液：這里介

2、紹鄂征(1995)改良的Mayer法。稱取0.5g蘇木精，5.0g銨礬或鉀礬， 0.1g碘酸鈉加溫溶于70m1蒸餾水。 再加入30ml甘油， 2ml冰醋酸?；靹?。過濾后即成母液?？砷L久保存。用蒸餾水以1:20稀釋即成工作液，可用很長時(shí)間。每次染色前宜過濾，去除氧化膜。(2)伊紅染液：伊紅有醇溶性與水溶性之分。將0.5g伊紅溶于100m170乙醇或蒸餾水即成工作液。2.染色程序（1）用10甲醛(福爾馬林)固定培養(yǎng)物30min，或以丙酮固定15min。（2）蒸餾水洗1次后，入蘇木精染液510min染細(xì)胞核。（3） 入0.5鹽酸-70乙醇溶液301min， 脫去胞質(zhì)的著色。 此時(shí)核呈紫紅色。（4）入

3、堿性溶液堿化，使細(xì)胞核變成藍(lán)色。如果時(shí)間允許，最好用自來水(呈弱堿性)長時(shí)間浸泡。也可入1NaHCO3溶液。此過程須不斷用顯微鏡監(jiān)視，以掌握堿化時(shí)間。（5）蒸餾水洗1 min，去除殘留的堿性溶液，否則影響伊紅著色。（6）入伊紅染液30s1 min。（7）用梯度乙醇溶液脫水：70、90、95乙醇各30s1 min；100(2次)各2min。如伊紅為乙醇溶液，略去70乙醇。（8）用二甲苯透明2次，各5min。（9）樹膠封固。3.染色結(jié)果細(xì)胞核呈紫藍(lán)色或深藍(lán)色，大部分細(xì)胞的胞質(zhì)呈粉紅色。如果胞質(zhì)內(nèi)含較多核糖體(例如淋巴細(xì)胞)則亦呈藍(lán)色。（二）吉姆薩染色法此法可將細(xì)胞核與胞質(zhì)同時(shí)染色，故便捷快速；但染

4、液配制技術(shù)不易準(zhǔn)確掌握，效果常不如HE染色穩(wěn)定。1.吉姆薩(Giemsa)染液的配制（1）取1.5g吉姆薩粉末放入50ml甘油，置于60溫箱，約3h后溶解。（2）取出后倒入50ml中性甲醇，即為母液。于棕色瓶可長久保存。需要注意的是，有的甲醇內(nèi)含醋酸，會使染液中的伊紅沉淀出來，不利染色。（3）將母液與0.1 molLPBS(Ph6.97.2)按1:9混合即成工作液。吉姆薩染液對pH極敏感，偏酸時(shí)染色過紅，偏堿時(shí)則過藍(lán)。所以，工作液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時(shí)間不超過48h以免被CO2酸化。2.染色程序（1）將標(biāo)本用甲醇固定510min。（2）入吉姆薩液染色1015min?？捎萌旧祝换?qū)⑷疽旱胃灿跇?biāo)本。

5、（3）蒸餾水清洗，空氣干燥，二甲苯透明，樹膠封固。3.染色結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)或藍(lán)紫色，胞質(zhì)呈色與HE染色相仿。二、玻片處理方法對于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，在進(jìn)行各種染色前常需先制備成涂片。為了保證細(xì)胞在長時(shí)間的染色過程中不從載玻片脫落，必須使其牢固貼附于載玻片上。在載玻片上涂布一層有助于細(xì)胞黏附的物質(zhì)是經(jīng)常采用的方法之一。 能促進(jìn)細(xì)胞黏附的物質(zhì)主要有多聚賴氨酸、鉻礬明膠等，這里介紹多聚賴氨酸的涂布方法。1、將載玻片用玻璃專用洗滌劑(如Decon)浸泡5min，間或振蕩。2、用自來水沖洗5min。3、以1鹽酸70乙醇溶液浸泡5min。4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。5、多聚L-賴氨酸(1:10溶于去離

6、子水)浸泡5min，振蕩。6、入60烤箱1 h，或室溫過夜干燥(用于細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)及原位雜交細(xì)胞化學(xué))。三、培養(yǎng)物的常用固定方法固定細(xì)胞的目的在于把組織和細(xì)胞的原有結(jié)構(gòu)盡可能完整地保存下來，避免組織和細(xì)胞發(fā)生降解、自溶、腐敗和變形等，使細(xì)胞和組織內(nèi)的各種酶失去活性，防止細(xì)胞和組織的各種分子變性、解離，使細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)和酶能準(zhǔn)確定位，并在以后的處理和制片過程中亦不發(fā)生改變和破壞。同時(shí)，固定還可使細(xì)胞的各部分易于著色，適于觀察、長期保存和分析。1.固定組織、細(xì)胞的基本原則盡可能選用新鮮培養(yǎng)物；根據(jù)檢測工具、對象、目的和要求選擇固定劑和固定方法。2.培養(yǎng)物的準(zhǔn)備和固定前處理各種細(xì)胞培養(yǎng)物，如

7、雙蓋片懸滴培養(yǎng)物、懸液培養(yǎng)物、單層培養(yǎng)物和蓋片單層培養(yǎng)物都可作固定材料。對雙蓋片懸滴培養(yǎng)物和懸液培養(yǎng)物來說，常通過離心收集細(xì)胞，PBS漂洗23次后，備固定制片；對蓋片單層培養(yǎng)物來說，將蓋片從培養(yǎng)器皿中取出后，PBS液漂洗23次，以洗去血清和附著于細(xì)胞表面的殘?jiān)?，備固定用?.常用固定液常用的固定液分兩類，一類是以單一化學(xué)物質(zhì)配成的固定液，稱簡單固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞、氯化鎘、四氧化鋨(鋨酸)。另一類是用兩種或兩種以上化學(xué)物質(zhì)配合成的固定液， 稱混合固定液。 如Mueller固定液、 Flemming固定液、 FAA固定液、 Carno

8、y固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液對細(xì)胞的化學(xué)成分、酶類及細(xì)胞結(jié)構(gòu)固定效果不同。因此，選擇合適的固定液是達(dá)到固定目的的基礎(chǔ)。(1)4甲醛-PBS:甲醛是一種氣體，其飽和水溶液無色，約含40甲醛。在很多情況下，甲醛常常產(chǎn)生多聚甲醛的白色沉淀。4甲醛-PBS使組織變硬速度比乙醇快，并能較好地保存組織的外部形式，固定效果不受制片影響，固定材料可用蘇木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力較強(qiáng)，對組織固定均勻，能增強(qiáng)組織的彈性，大標(biāo)本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色體、線粒體和高爾基體的固定液，在冷凍切片中，甲醛作固定劑具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。用40甲醛水溶液

9、:PBS=1:9配方制備甲醛固定液。(2)丙酮：丙酮為無色易揮發(fā)液體，用純冷丙酮(4)固定細(xì)胞內(nèi)酶效果較佳。(3)乙醇：乙醇又稱酒精，固定血纖維蛋白、色素、彈性纖維、細(xì)菌和白細(xì)胞等效果優(yōu)良。無水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液。乙醇除有固定作用外，還具有硬化和脫水的作用。作為固定用乙醇的適宜濃度為70100。乙醇的缺點(diǎn)是滲透力差，并使組織收縮。(4)醋酸：常用0.35濃度的醋酸作固定劑。醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合，醋酸不固定蛋白質(zhì)，但能固定核酸。醋酸的穿透力很大，它對細(xì)胞的膨脹作用顯著，這是由于它破壞了某些蛋白質(zhì)分子的結(jié)合，所以，常用醋酸來減少其他固定劑引起的細(xì)胞收縮。

10、 細(xì)胞學(xué)技術(shù)中， 它能防止細(xì)胞收縮， 并能較好地保存染色體，還能把染色質(zhì)沉淀成為可染色的塊狀體。(5)苦味酸：苦味酸是黃色結(jié)晶體，強(qiáng)酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯，在水中的溶解度可因水溫變化而變化?？辔端峥梢猿恋戆椎鞍住⒑说鞍?、球蛋白、組蛋白和核酸。苦味酸的穿透力很慢，單獨(dú)使用時(shí)，造成組織嚴(yán)重收縮。它和其他藥物混合配制時(shí)，可以作為蛋白質(zhì)的沉淀劑，同時(shí)可避免組織收縮、硬化，而且易于染色。所以在很多混合固定液中被廣泛采用。作固定用的最適濃度為1。(6)鋨酸(四氧化鋨)：鋨酸是一種強(qiáng)氧化劑，不能同乙醇和甲醛混合使用。它的揮發(fā)性很強(qiáng)，揮發(fā)出來的氣體能固定結(jié)膜，對眼睛很有害，所以操作時(shí)應(yīng)特別注意。四氧化

11、鋨是保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)的最好固定劑之一，配制時(shí)先在棕色試劑瓶中盛入50100ml 0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.07.4)，再將裝有1g鋨酸的安培瓶放人PBS中，以玻棒擊碎安培瓶，搖蕩使鋨酸溶解，備用。常用的固定液濃度為12。(7)戊二醛：戊二醛對組織的滲透率高，與蛋白質(zhì)反應(yīng)快，能較好地保存蛋白質(zhì)，對微管和膜性結(jié)構(gòu)保存亦比較好，并能較好地保存糖原。常用的戊二醛固定液配制方法列于表12-1。表14-1 常用的戊二醛固定液配制方法Ph7.2的0.1mol/L磷酸緩沖液（ml） 96 96 92 90 8825%戊二醛水溶液（ml） 4 6 8 10 12戊二醛的終濃度 1% 1.5% 2% 2.5

12、% 3%(8)甲醇醋酸固定液：甲醇：醋酸為3:1的固定液是應(yīng)用最廣的一種培養(yǎng)細(xì)胞固定劑。甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，兩者結(jié)合，能使固定細(xì)胞形態(tài)不變。不僅最適用于固定染色體，而且固定的染色體適于Giemsa染色(注意：此固定液宜現(xiàn)用現(xiàn)配)。(9)FAA固定液：此固定液適用于固定蓋片單層培養(yǎng)的細(xì)胞，固定效果好。配制方法：90ml 80酒精中加5ml冰乙酸和5m140甲醛。(10)Carnoy固定液：Carnoy固定液是較好的非水溶性固定液，是顯示細(xì)胞化學(xué)成分(如粘多糖等)時(shí)常用的固定劑，固定、保真效果好，但穿透力差，適于固定培養(yǎng)的單層細(xì)胞。配制方法：60ml純酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸。(11)Bouin固定液：用于固定雙蓋片法培養(yǎng)的標(biāo)本，固定30分鐘后，用70酒精褪去苦味酸黃色，如不立即染色，可將標(biāo)本保存在70酒精中。本試劑適于固定組織細(xì)胞的糖原。配制方法：先將75ml飽和苦味酸(100ml水中加1.21.4g)過濾，加入25ml福爾馬林(40甲醛，有沉淀時(shí)禁用)，最后加入5ml冰醋酸，混和后存于4冰箱中備用。冰醋酸最好在臨用前加入。該固定液對組織細(xì)