脂肪醇聚氧乙烯醚降解菌的篩選和鑒定.doc

1、 學(xué)號(hào)： 05439112 江 蘇 工 業(yè) 學(xué) 院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）（2009屆)題 目 脂肪醇聚氧乙醚降解菌的 篩選和鑒定 學(xué) 生 成效江 學(xué)院（系) 化學(xué)化工學(xué)院 專 業(yè) 班 級(jí) 生物工程051 校內(nèi)指導(dǎo)教師 王利群 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 副教授 校外指導(dǎo)老師 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 二九年六月摘要脂肪醇聚氧乙烯醚降解菌的篩選和鑒定摘 要：隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，微生物在環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用前景越來(lái)越廣闊。本研究通過(guò)用篩選脂肪醇聚氧乙烯醚（alkyl alcohol polyoxyethylene ether, AEO）降解菌的方法，對(duì)我國(guó)工業(yè)中用量最大的非離子表面活性劑AEO進(jìn)行降解特性研究。從常州市清潭污水

2、處理廠采集活性污泥，通過(guò)富集和劃線培養(yǎng)獲得兩株對(duì)AEO有較強(qiáng)降解能力的純培養(yǎng)A1和A-2。根據(jù)其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征等,經(jīng)初步鑒定為假單胞菌屬。當(dāng)溫度為30、pH7。0、接種量為5、AEO濃度為0.5時(shí)，培養(yǎng)108小時(shí)后，用KI-I2分光光度法測(cè)定其降解能力，兩株菌株的降解效率均達(dá)到90%.關(guān)鍵詞：脂肪醇聚氧乙烯醚；篩選;鑒定;生物降解Screening and identification of bacterial strains for degrading Alkyl alcohol polyoxyethylene etherAbstract： With the develop

3、ment of modern biotechnology， and more microorganism have a more and more broad range of applications in environment disposal。 In this paper， characteristics of bacteria degrading alkyl alcohol polyoxyethylene ether (AEO)， which is the most popular used nonionic surfactant in our industry，were studi

4、ed by screening screening microorganisms which could degrade AEO through slective medium for AEO。Sludge sample were collected from wastewater treatment plant in Qingtan of Changzhou。 Two strains named A1 and A2 which have the strong competence of degrading were selected from above sludge by enrichme

5、nt and purification，culture characteristics，and physiological and biochemical reactions， A-1and A-2 was identified as Pseudomonas sp. The degradation ability to AEO of two strains which I had screened was determined by spectrophotometer with KI-I2 solution at the concentration of 1%. The degration r

6、ates for AEO both reach to 90% and concentration for AEO at 500mg/L within 108 hours at 30， pH7。0，with inoculating quantity at 5。Keywords： alkyl alcohol polyoxyethylene ether(AEO)； screening; identification; biodegradation 目 錄摘 要I目 錄III1 前言11。1 研究背景11。2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀21.2。1 泡沫分離方法21。2。2膜分離法21。2。3凝處理法21。2。4

7、吸附處理法21.2.5催化氧化處理法21.2.6生物方法的現(xiàn)狀與問(wèn)題31.2.7 發(fā)展趨勢(shì)復(fù)極性固定床電解法31。2。8 AEO生物降解性和降解機(jī)理41.3 研究目的和意義41.4 研究?jī)?nèi)容41.5 研究路線52 材料與方法62。1 實(shí)驗(yàn)儀器、藥品62.1。1 主要實(shí)驗(yàn)儀器62。1。2 主要試劑、藥品和培養(yǎng)基62.1.3 培養(yǎng)基72.2降解脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO）的菌種的分離篩選82。2.1降解AEO菌種土樣的采集82.2。2制備土壤懸液82。2.3菌種的富集82.2.4菌種篩選82。2.5菌種分離純化82。4 AEO7濃度的測(cè)定KII2法分光光度法92.4.1 AEO濃度測(cè)定原理92.4.

8、2 特征吸收波長(zhǎng)的測(cè)定92.4。3 AEO7濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制92。4。3 篩選菌種降解性能的測(cè)定102。5 菌種鑒定102.5。1 菌落形態(tài)102.5。2 革蘭氏染色102.5。3 氧化酶實(shí)驗(yàn)112.5。4 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)112。5。5 淀粉水解試驗(yàn)112。5。6 氧化發(fā)酵試驗(yàn)122.5.7 吲哚試驗(yàn)122.5。8 甲基紅試驗(yàn)122。5.9 乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（VP試驗(yàn)）132。5.10 利用檸檬酸鹽試驗(yàn)132。5。11 產(chǎn)H2S試驗(yàn)132。6 菌種保藏133。 結(jié)果與討論143。1 菌株對(duì)AEO7降解效率143。1。1 AEO7特征吸收波長(zhǎng)的確定143.1。2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制143。1。3降

9、解效率的比較153.1。4 降解效率的計(jì)算153.2菌種鑒定173.2.1菌落形態(tài)的觀察173.2。2蘭氏染色173。2。3 細(xì)菌大小的測(cè)定183.2.4 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)194 結(jié)論與展望214。1 結(jié)論214.2 展望21參 考 文 獻(xiàn)22致 謝241 前言1。1 研究背景工業(yè)廢水是指工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢水、污水和廢液，其中含有隨水流失的工業(yè)生產(chǎn)用料、中間產(chǎn)物和產(chǎn)品以及生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的污染物.隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，廢水的種類和數(shù)量迅猛增加,對(duì)水體的污染也日趨廣泛和嚴(yán)重，威脅人類的健康和安全。對(duì)于保護(hù)環(huán)境來(lái)說(shuō)，工業(yè)廢水的處理比城市污水的處理更為重要。工業(yè)廢水的處理雖然早在19世紀(jì)末已經(jīng)開(kāi)始，

10、并且在隨后的半個(gè)世紀(jì)進(jìn)行了大量的試驗(yàn)研究和生產(chǎn)實(shí)踐，但是由于許多工業(yè)廢水成分復(fù)雜,性質(zhì)多變,至今仍有一些技術(shù)問(wèn)題沒(méi)有完全解決。脂肪醇聚氧乙烯醚(alkyl alcohol polyoxyethylene ether ,AEO）是一類非離子表面活性劑的總稱。是長(zhǎng)鏈脂肪醇與環(huán)氧乙烷通過(guò)加成反應(yīng)制得的。通式：R-O(CH2CH2O）nHR一般為不飽和的或飽和的C8C20羥烴.n環(huán)氧乙烷的加成數(shù),也就是表面活性劑分子中氧乙烯基的數(shù)目。n越大，分子親水基上的氧越多,與水就能形成更多的氫鍵,水溶性就越好，n=15時(shí)，能溶于油而不溶于水。常用于制備硫酸酯類陰離子表面活性劑的原料。n=68時(shí)能溶于水，常用于紡

11、織品的洗滌和油脂乳化劑。n=620時(shí)工業(yè)上用作乳化劑、與染劑.當(dāng)R為C7-9,n=5時(shí)生成的脂肪醇聚氧乙烯醚在工業(yè)上被稱作滲透劑JFC。當(dāng)R為C12-18,n=1520時(shí),生成的脂肪醇聚氧乙烯醚在工業(yè)上被稱作平平加。而當(dāng)R為C12時(shí)，生成的脂肪醇聚氧乙烯醚俗稱AEO1。脂肪醇聚氧乙烯醚是最重要的一類非離子表面活性劑，分子中醚鍵不易被酸堿破壞，所以穩(wěn)定性較高，水溶性較好，耐電解質(zhì)，泡沫小，能生物降解，除了在印染行業(yè)大量使用外還大量適用于低泡液洗滌劑。其生物降解性與乙氧基的加成數(shù)目成反比，由于它的水溶性較好并且泡沫小，給污水處理后的出水感官上有很大的迷惑性.脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO）類非離子表面活

12、性劑是非離子表面活性劑的主要產(chǎn)品,包括AEO系列、JFC系列、平平加系列,它們被廣泛乳化劑、分散劑、洗滌劑等1,在日常生活、工業(yè)生產(chǎn)中起著重要的作用。表面活性劑的用量也從1950年全球表面活性劑生物用量3500t/a增加到1990年的4.3×106t/a,而到1996年全世界表面活性劑的用量已超過(guò)了9×106t,預(yù)計(jì)到2050年其用量將達(dá)到1。8×108t2。由于AEO系列表面活性劑的生物降解性比傳統(tǒng)的陰離子和陽(yáng)離子表面活性劑的降解性要高3，所以它正在工業(yè)上的作用與日俱增.但是表面活性劑大量工業(yè)化使用后，因其不易降解性使水體、土壤受到污染,進(jìn)人下水道后還經(jīng)常與其他

13、有機(jī)物質(zhì)如蛋白質(zhì)一起產(chǎn)生泡沫、氣味等，給工業(yè)、生活廢水凈化帶來(lái)了相當(dāng)大的問(wèn)題4，5，表面活性劑對(duì)微生物、水生植物和魚(yú)類等有毒性,長(zhǎng)期高濃度存在會(huì)使水生環(huán)境惡化,其環(huán)境安全性逐漸引起重視6。聚氧乙烯醚類表面活性劑對(duì)水生動(dòng)植物、土壤微生物的損害比較大，因此對(duì)其治理顯得非常重要.1。2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2。1 泡沫分離方法泡沫分離方法是向AEO廢水中曝氣，從而產(chǎn)生大量的氣泡，使AEO吸附于氣泡表面并隨氣泡浮升至水面，除去形成的泡沫層，從而將AEO從廢水中分離.該法對(duì)AEO去除率高，工藝操作簡(jiǎn)便，運(yùn)行穩(wěn)定,能耗低,適用于處理較低濃度的AEO廢水，但對(duì)COD的去除率不高,泡沫濃縮液經(jīng)絮凝脫水后的濾渣可

14、能造成二次污染。工程實(shí)踐中常采用泡沫分離塔實(shí)現(xiàn)泡沫分離，并常與其他技術(shù)組成組合工藝.常用的有泡沫分離一混凝法泡沫分離一生物接觸氧化法等.采用煤渣吸附絮凝沉淀-泡沫分離技術(shù)的組合工藝處理AEO廢水去除率可達(dá)95以上。1.2.2膜分離法超濾和納濾技術(shù)是處理AEO廢水的有效方法當(dāng)廢水中AEO的濃度小于其臨界膠束濃度，此時(shí)AEO的分子量較小，因而適用納濾技術(shù)處理;當(dāng)AEO的濃度大于其臨 界膠束濃度，此時(shí)AEO的分子量較大，則適用超濾技術(shù)。新興的膜生物反應(yīng)器技術(shù)綜合了膜分離和生物處理技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，目前對(duì)AEO廢水的處理正處于小試階段，今后研究的重點(diǎn)是與其他技術(shù)的聯(lián)用以及克服膜污染問(wèn)題?，F(xiàn)已有將粉末活性炭吸

15、附與微濾技術(shù)聯(lián)合，該技術(shù)可以提高AEO的去除率,緩解膜的堵塞。1。2.3混凝處理法 混凝法處理AEO廢水效果理想、成本低、易操作,但降解不徹底，產(chǎn)生大量廢渣與污泥.目前的研究集中在與其他技術(shù)的聯(lián)合使用和開(kāi)發(fā)出針對(duì)陰離子表面活性劑的高效的混凝劑。已報(bào)道的有用聚合硫酸鐵作混凝劑，處理低、高濃度的AEO廢水,出水均可達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn) (對(duì)于高濃度的AEO廢水需后續(xù)的中和泡沫分離處理）。組合工藝有微電解一混凝沉淀法，混凝沉淀冰解酸化一接觸氧化法等。1.2.4吸附處理法常用的吸附劑主要包括活性炭、吸附樹(shù)脂、硅藻土、高嶺土等?；钚蕴吭诔叵聦?duì)AEO廢水處理效果理效果較好。但再生能耗大，且再生后無(wú)法完全恢復(fù)

16、吸附能力，因而限制了其應(yīng)用。天然的粘土礦物類吸附劑貨源充足、價(jià)廉，應(yīng)用較多。為了提高吸附容量和吸附速率，對(duì)這類吸附劑研究的重點(diǎn)在于吸附性能、加工條件的改善和表面改性等方面.用硼泥處理表面活性劑廢水,AEO的去除率達(dá)94左右，硼泥再生后對(duì)AEO去除率仍可達(dá)94%。吸附樹(shù)脂處理表面活性劑廢水，其吸附速率快、穩(wěn)定性好、再生容易,但是預(yù)處理較繁瑣,一次性投資大。未來(lái)應(yīng)重點(diǎn)開(kāi)發(fā)價(jià)廉的吸附材料，如對(duì)工業(yè)廢物再利用。以CaO為改性劑的粉煤灰作為吸附劑,對(duì)表面活性劑的去除率可達(dá)95以上。1.2.5催化氧化處理法催化氧化法是對(duì)化學(xué)氧化法的改進(jìn)與強(qiáng)化，主要有均相氧化法，光催化氧化法和多相氧化法Fenton法屬均相

17、氧化法，目前研究的熱點(diǎn)是將Fenton法與其他技術(shù)聯(lián)合使用，例如混凝一Fenton工藝，超聲Fenton試劑聯(lián)合法。后者在最佳條件下對(duì)AEO的去除率可達(dá)80。光催化氧化法是用紫外光照射半導(dǎo)體催化劑，生成強(qiáng)氧化性的·OH自由基來(lái)氧化分解AEO，對(duì)AEO的去除率可達(dá)90%以上。該法在處理高濃度AEO模擬廢水存在一個(gè)H2O2的最佳投量 （0。8mg/L），過(guò)多的H2O2投量會(huì)對(duì)AEO的降解有不利影響。目前對(duì)催化氧化法的研究熱點(diǎn)是：（1） 發(fā)展該法與其他技術(shù)的聯(lián)用，如將Fenton氧化與光催化氧化結(jié)合的TioZ一Fenton試劑光氧化法；(2) 開(kāi)發(fā)價(jià)格低廉性能優(yōu)越的催化劑。目前已開(kāi)發(fā)出Cu

18、O/ Ni2O3、ZnO/Ni2O3、TiO2/活性炭等混合催化劑，對(duì)LAS的去除率可分別達(dá)到99.5、93.8%和80%。多相催化氧化法處理 AEO廢水去除率最高可達(dá)88.3.其中光催化氧化法和多相催化氧化法都可以徹底地將AEO分解為CO2、H2O。1。2。6生物方法的現(xiàn)狀與問(wèn)題在我國(guó),生物法是AEO廢水處理的主要方法，其中活性污泥法應(yīng)用最廣，一般條件下AEO的去除率可達(dá)80一95。采用生物接觸氧化法處理AEO廢水，對(duì) AEO的去除率可保持在93%以上。但其缺點(diǎn)是AEO對(duì)厭氧微生物有一定的抑制作用。另外該法需要采用不完全厭氧或其他方法進(jìn)行預(yù)處理才能避免曝氣時(shí)產(chǎn)生大量泡沫，防止降低氧的傳遞效率

19、。在生物法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的固定化細(xì)胞技術(shù)是處理AEO廢水的新興技術(shù)，其菌體穩(wěn)定性、抗毒性強(qiáng)，適應(yīng)性較高，處理效率高，可反復(fù)使用，且反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)。目前,該技術(shù)未來(lái)研究的方向是增強(qiáng)固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，并發(fā)展與其他技術(shù)的聯(lián)用。對(duì)一般AEO廢水效率高，處理能力大，但對(duì)高濃度的AEO廢水去除率不高，且降解不徹底.未來(lái)研究的重點(diǎn)是發(fā)展與其他處理技術(shù)的聯(lián)合使用，已報(bào)到的有混凝沉淀一水解酸化一接觸氧化工藝，混凝一活性碳吸附微生物法，以絮凝床技術(shù)作為預(yù)處理的SBR工藝等,并都取得了一定的效果。1。2.7 發(fā)展趨勢(shì)-復(fù)極性固定床電解法近年來(lái)人們不斷研究開(kāi)發(fā)AEO廢水等難降解有機(jī)廢水的處理技術(shù)，其中復(fù)極性固定

20、床電解法 （BPBC）這一新興技術(shù)成為研究的熱點(diǎn).該法是以傳統(tǒng)的電解法 （二維電極電解法）為基礎(chǔ)，在二維電解槽電極間裝填高阻抗粒子材料，通過(guò)主電極的電壓使填料粒子感應(yīng)帶電，一端成為陰極，一端成為陽(yáng)極，通過(guò)直接氧化作用和活性中間體的間接觸氧化作用對(duì)污染物進(jìn)行氧化降解。與傳統(tǒng)的二電極相比，該法有如下特點(diǎn)：(1) 具有更大的電極比表面積，從而增加了催化反應(yīng)的面體比,提高了污染物的解速率；（2) 增加了反應(yīng)體系的紊動(dòng)性，縮短了傳質(zhì) （包括對(duì)流，擴(kuò)散和電遷移)的距離；(3） 反應(yīng)速率快，時(shí)空產(chǎn)率較二維可以提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)；(4） 具有吸附作用的填料能進(jìn)一步顯著提高污染物的去除率;（5) 以較低的電流密度獲

21、得較大的電流強(qiáng)度，能耗顯著降低。對(duì)于AEO廢水的處理，復(fù)極性固定床電解法還具有如下優(yōu)勢(shì):（1） 為均相催化反應(yīng)提供巨大的活性中間體 (.·OH，O3，H2O2，HO2·等)的附著面積，增加了AEO與中間體接觸機(jī)率，從而大大提高了AEO去除率； (2)可將LAS完全礦化;（3) 對(duì)于具有吸附作用的填料，AEO被吸附后再氧化分解，填料得以再生。這類活性劑的治理方法很多,但結(jié)合對(duì)環(huán)境的影響、經(jīng)濟(jì)因素、操作條件等諸多因素，生物降解法如活性污泥法、生物膜法、篩選菌種法等7,8是目前最有應(yīng)用前景。生物法具有處理效率高、環(huán)境影響小、可以就地處理等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的研究，并已經(jīng)取得了一定的成

22、效811。1.2.8 AEO生物降解性和降解機(jī)理Balson和Felix12認(rèn)為，表面活性劑的生物降解性是指在微生物的作用下，表面活性劑分子結(jié)構(gòu)的破壞,轉(zhuǎn)化為微生物的代謝產(chǎn)物或細(xì)胞濃度，并產(chǎn)生二氧化碳和水。完整的生物降解需要經(jīng)歷以下過(guò)程【1315】:第一步為初級(jí)降解（primary degradation）,表面活性劑分子結(jié)構(gòu)的改變，表面活性喪失。第二步為達(dá)到環(huán)境可以接受程度的生物降解，降解產(chǎn)物不再導(dǎo)致污染。第三步為最終降解（ultimate degradation）,底物完全轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水和其他無(wú)機(jī)物,并被同化為微生物的一部分。在自然界中，AEO的生物降解如圖1所示16。圖1 AEO的生

23、物降解機(jī)理可以看出，AEO的生物降解先發(fā)生在烷基碳鏈與聚氧乙烯相連的C-O鏈上。在酶的作用下發(fā)生C-O鏈的氧化斷裂生成烷基酸，進(jìn)一步連續(xù)的-氧化代謝生成二氧化碳和水。以上各步變化都會(huì)使相當(dāng)數(shù)量的AEO分解。因此，精確測(cè)定水樣中被微生物降解前、后的濃度，其前后濃度差就是被微生物降解的AEO濃度,從而可以計(jì)算出降解率17。1.3 研究目的和意義本研究的目的是從污水處理廠的活性污泥中分離得到能夠降解AEO系列的非離子表面活性劑的菌株，并把篩選到的菌株經(jīng)過(guò)馴化改良重新投到污水處理廠的活性污泥中，以提高污水處理廠的處理污水的效率，提高出水質(zhì)量,從而達(dá)到改善環(huán)境的目的.1。4 研究?jī)?nèi)容(1）脂肪醇聚氧乙烯

24、醚(AEO）降解菌的篩選、分離、純化；（2）測(cè)定所篩選的菌株在正常工作環(huán)境下對(duì)AEO7的降解性能；（3）脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO）降解菌的鑒定.1.5 研究路線通過(guò)選擇性培養(yǎng)基分離和篩選降解污水中AEO列的非離子表面活性劑的菌種,并進(jìn)行鑒定。研究獲得降解AEO的菌株。從菜園泥土和苗圃地中取樣，先用LB液體培養(yǎng)基，30搖床中富集培養(yǎng)兩次，每次富集時(shí)間16-24h，然后轉(zhuǎn)接到以AEO7作為唯一碳源的無(wú)基機(jī)礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30搖床中培養(yǎng)35次,每次培養(yǎng)時(shí)間為4-5天，分離篩選出能降解AEO的菌株。然后通過(guò)在同樣成分的平板上分離純化。最后通過(guò)研究比較不同菌種AEO的效率，從而篩選出高效降解菌株.利用篩選出

25、的高效降解菌株對(duì)含有一定濃度的AEO廢水進(jìn)行生物處理，檢驗(yàn)降解效果。樣品采集富集培養(yǎng)菌種保藏菌種純化菌株馴化降解效率測(cè)定菌株鑒定菌株篩選圖2 研究路線2 材料與方法2。1 實(shí)驗(yàn)儀器、藥品2.1。1 主要實(shí)驗(yàn)儀器表1 實(shí)驗(yàn)儀器編號(hào)名稱型號(hào)產(chǎn)地1上皿電子天平FA1104上海精密科學(xué)儀器有限公司2手提式壓力蒸氣鍋YXQ.SQ41.280上海華錢醫(yī)用核子儀器有限公司3分光光度計(jì)722型上海精密科學(xué)儀器有限公司4隔水式恒溫培養(yǎng)箱GNP-9160上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司5可調(diào)式電爐GB548885上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司6干燥箱101-1型上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠7超凈工作臺(tái)SW-CJ1BU型蘇凈集團(tuán)安泰公司8電

26、熱恒溫孤峰干燥箱DHG9240A型上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司9顯微鏡XSZG型上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司10空氣浴振蕩器HZQC型哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠2。1。2 主要試劑、藥品和培養(yǎng)基表2 實(shí)驗(yàn)藥品編號(hào)品名規(guī)格生產(chǎn)廠家1AEO7分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司2牛肉膏生化試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司3蛋白胨生化試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司4葡萄糖生化試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司5瓊脂粉生化試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司6氯化鈉分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司7酵母膏生化試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司8氫氧化鈉分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司9鹽酸分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司10MgSO4·7H

27、2O分析純上海金山區(qū)興塔美興化工廠11K2HPO4分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司12KCl分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司13FeSO4·7H2O分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司14NH4Cl分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司15溴麝香草酚藍(lán)分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司表2 實(shí)驗(yàn)藥品（續(xù)）編號(hào)品名規(guī)格生產(chǎn)廠家16NH4H2PO4分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司17檸檬酸三鈉分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司18胱氨酸分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司19Na2SO4分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司20過(guò)氧化氫分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司21KI分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司22乙醇分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)

28、試劑有限公司23甲基紅分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司24亞甲基藍(lán)分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司25碘分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司26KOH分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司27精密pH試紙（5。59）28醋酸鉛試紙2.1.3 培養(yǎng)基(1)LB富集培養(yǎng)基蛋白胨10 g，牛肉膏 5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水 1000mL。（2）無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)篩選培養(yǎng)基NH4Cl 3。00g， MgS04 . 7H2O 0。25 g, FeSO4.7H2O 0.005 g，K2HPO4 1.00 g， KCl 0.25 g，酵母膏 0.3 g， AEO7 0。1-0.5 g（每次篩選增加0。1 g），蒸餾水 1000mL

29、。（3）固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.52。0%的瓊脂。（4）休和利夫培養(yǎng)基葡萄糖10 g，蛋白胨 2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 0。2 g，水洗瓊脂 5 g左右,溴麝香草酚藍(lán) 0。03 g，蒸餾水 1000mL。(5）胰蛋白胨培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g；NaCl 5 g;蒸餾水 1000mL。（6）葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基葡萄糖 5g，蛋白胨 5g，K2HPO4（或NaCl) 5g,蒸餾水 1000mL。（7)西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0。2 g，NH4H2PO4 1 g,K2HPO4 。3H2O 1 g，檸檬酸三鈉 2 g,蒸餾水 1

30、000mL。(8)蛋白胨胱氨酸培養(yǎng)基18蛋白胨 10 g, 胱氨酸 0.1 g,Na2SO4 0。1 g， 蒸餾水 1000mL.2.2 降解脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO）的菌種的分離篩選2.2。1降解AEO菌種土樣的采集從清潭污水處理廠取活性污泥標(biāo)號(hào)。再分別從菜園和梨園土壤中采集地表層以下15cm深處的土樣,分別標(biāo)號(hào)為、。2。2.2 制備土壤懸液取每份樣品1克分別加入3個(gè)搖瓶?jī)?nèi)，加入49mL生理鹽水(0.85NaCl)，放入搖床震蕩20分鐘，使土樣充分打散，即成為102的土壤懸液。2。2.3 菌種的富集原理：富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家最強(qiáng)有力的手段之一主要是指利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同,制訂特

31、定的環(huán)境條件，使在該條件下只有目標(biāo)微生物生長(zhǎng)旺盛，從而使其在群落中數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需的微生物的特點(diǎn)從物理、化學(xué)、生物及綜合多個(gè)方面進(jìn)行選擇,如溫度、pH、光照、氧氣、營(yíng)養(yǎng)等。根據(jù)以上原理，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)特點(diǎn),我采用含有AEO7的LB液體培養(yǎng)基作為富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基.方法：將土壤懸液靜止2030分鐘，吸上清1mL加入到含1AEO7 的LB液體培養(yǎng)基中（不需滅菌)，放在空氣震蕩器中30恒溫培養(yǎng)1624小時(shí)。再取培養(yǎng)液1mL加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)，重復(fù)三次。2。2.4 菌種篩選初篩：吸取富集培養(yǎng)液1ml,加入到已滅菌的含

32、有1 AEO7的含有0.3酵母膏無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基,30恒溫?fù)u床培養(yǎng)45天后。復(fù)篩：再取初篩培養(yǎng)液1mL，加入到新鮮的含有2 AEO7但不加酵母膏的無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同樣條件培養(yǎng)。如此從AEO7濃度2重復(fù)到5 。進(jìn)入到菌種分離純化階段.2.2.5 菌種分離純化取AEO7濃度為5的細(xì)菌培養(yǎng)液1mL，進(jìn)行梯度濃度稀釋到108。分別取各梯度濃度的稀釋液500L涂布在含5AEO7的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，30培養(yǎng)3天，長(zhǎng)出單菌落。劃線分離：用接種環(huán)，挑取長(zhǎng)出的單菌落,在含5AEO7的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上劃線分離,30培養(yǎng)3天，長(zhǎng)出單菌落.純化：挑取劃線分離單菌落,繼續(xù)劃線分離，30培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落后，用單染色

33、法檢驗(yàn)細(xì)菌是否為純種菌，如果不是，繼續(xù)挑取單菌落劃線分離,直到檢驗(yàn)為單菌落為止.（5）純種檢驗(yàn) ：光學(xué)顯微鏡觀察（單染色) 涂片 在潔凈無(wú)脂的載玻片中央滴一小滴無(wú)菌水，用無(wú)菌操作方法從菌種平皿中挑出少量菌體與水滴充分混勻,涂成薄膜，涂布面積約11。5cm2。 干燥 將圖片放在室溫下自然干燥。 固定 手扶載玻片一段,使涂菌的一面向上，將載玻片通過(guò)微火23次，在火上固定時(shí)，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載玻片在火上烤，否則菌體形態(tài)會(huì)毀壞。 染色 將涂片至于水平位置,滴加染色液覆蓋于涂菌處，染色約2分鐘。 水洗 傾去染色液，斜置載玻片，用自來(lái)水的細(xì)水流由載玻片上端流下,不得直接沖在涂菌處,直洗

34、至從載玻片上流下的水中無(wú)染色液的顏色為止。 干燥 自然晾干或用吸水紙輕輕的吸干，注意不要擦掉菌體。 鏡檢 待標(biāo)本完全干燥后，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，滴一滴香柏油在涂有菌體的部位，再用油鏡觀察。由菌株分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,純種分離得到的菌株量較大，如果對(duì)每一菌株都作全面或精確地性能測(cè)定,工作量是很大的，而且也沒(méi)必要。因此用在篩選培養(yǎng)基上點(diǎn)種的方法，通過(guò)長(zhǎng)出的菌苔的時(shí)間的長(zhǎng)短以及大小，以及對(duì)篩得的純種菌進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，最后選出8個(gè)菌株進(jìn)入到下面的降解性能測(cè)定階段，這樣就大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了篩選效率19,20。2。4 AEO7濃度的測(cè)定-KII2法分光光度法2。4.1

35、 AEO濃度測(cè)定原理碘作為一種電子受體能與聚氧乙烯型非離子表面活性劑反應(yīng)形成絡(luò)合物.Ross和Becher、等利用碘的這一性質(zhì)測(cè)定聚氧乙烯型非離子表面活性劑的臨界膠束濃度，認(rèn)為碘與表面活性劑的相互反應(yīng)是基于碘與表面活性劑中氧原子的誘導(dǎo)作用導(dǎo)致了電荷轉(zhuǎn)移形成絡(luò)合物?；谝陨显?，本實(shí)驗(yàn)以KII2溶液為顯色劑掃描顯色溶液體系的可見(jiàn)光光譜，確定其特征吸收波長(zhǎng)，于特征吸收波長(zhǎng)下測(cè)定聚氧乙烯型非離子表面活性劑濃度。2。4。2 特征吸收波長(zhǎng)的測(cè)定準(zhǔn)確稱取1g I2和2g KI，加蒸餾水溶解，定容至100mL作為KI-I2顯色劑。因形成I3不太穩(wěn)定,顯色劑應(yīng)避光保存。于10ml試管中加入10ml一定濃度的A

36、EO7溶液,再向溶液中加加入0。25ml的KII2顯色劑,搖勻靜置120min。然后以蒸餾水為參比用全光分光光度計(jì)進(jìn)行全光掃描，檢測(cè)出最大吸收波長(zhǎng)17.2.4。3 AEO7濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制操作步驟： 稱取0。2112g AEO7加入100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL。 取10支干凈的試管，分別編號(hào)為110號(hào)，用移液器向編號(hào)為19分別移取200L、400L、600L、800取兩毫升上清液加入到10mL試管中，再分別向試管中加入8mL蒸餾水，L、1200L、1400L、1600L 、1800L。10號(hào)試管不加標(biāo)準(zhǔn)液。 向試管里補(bǔ)蒸餾水至10mL。再向每支試管里加入0。2mL濃度為1的

37、KI-I2.顯色120min. 分光光度計(jì)480nm波長(zhǎng)，以蒸餾水作參比，測(cè)定吸光值.2.4.3 篩選菌種降解性能的測(cè)定（1)前期培養(yǎng)在編號(hào)為19的100ml的搖瓶里裝入30ml含5AEO7的無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基。滅菌后接入此前篩到得8株菌,9號(hào)瓶不接菌。包扎好,30，130rp，搖床培養(yǎng)108h后測(cè)定降解效率。（2）降解率的測(cè)定 經(jīng)過(guò)108小時(shí)的培養(yǎng)，分別用移液器取培養(yǎng)液5mL到5mL的離心管中，在8000rpm離心10分鐘。 取兩毫升上清液加入到10mL試管中，再分別向試管中加入8mL蒸餾水。 分別向每支試管中加入1的KII2顯色劑，顯色時(shí)間為120min. 分光光度計(jì)480nm波長(zhǎng)，以蒸

38、餾水作參比，測(cè)定吸光值。（3）降解菌的選擇選擇降解效率較高的兩株菌，做后面的細(xì)菌生理生化試驗(yàn)和鑒定，以及最后的菌種保藏.2。5 菌種鑒定2.5.1 菌落形態(tài)把篩選得到的A1,和A2菌株重新接種到新鮮的LB固體培養(yǎng)基上,每隔一小時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，并作相關(guān)的記錄。2。5。2 革蘭氏染色（1）基本原理：由于不同的細(xì)菌細(xì)胞壁化學(xué)成分的不同而引起物理化學(xué)性質(zhì)的差別,導(dǎo)致革蘭氏染色反應(yīng)不同。通過(guò)結(jié)晶紫初染和碘液媒染，任何細(xì)菌的細(xì)胞膜內(nèi)部都可形成不溶于水的結(jié)晶紫復(fù)合物。G+細(xì)胞因壁厚肽聚糖網(wǎng)的層次多和結(jié)構(gòu)致密，以及不含脂類等原因，故脫色，就可把類脂等原因,故脫色后，可把結(jié)晶紫復(fù)合物阻攔在細(xì)胞內(nèi)，故呈紫色，

39、反之，G細(xì)菌因細(xì)胞壁薄，外膜類脂含量高，以及肽聚糖層薄且交聯(lián)松散，故用脫色劑處理后，就可把類脂和結(jié)晶紫復(fù)合物溶出細(xì)胞，這種無(wú)色細(xì)胞再經(jīng)番紅復(fù)染，就呈紅色。（2)操作步驟制片 涂片 在潔凈無(wú)脂的載玻片中央滴一小滴無(wú)菌水，用無(wú)菌操作方法從菌種平皿中挑出少量菌體與水滴充分混勻,涂成薄膜,涂布面積約為11。5cm2。 干燥 將圖片放在室溫下自然干燥。 固定 手扶載玻片一段，使涂菌的一面向上，將載玻片通過(guò)微火23次，在火上固定時(shí)，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載玻片在火上烤，否則菌體形態(tài)會(huì)毀壞.染色 初染 與制片上滴加結(jié)晶紫染液,染1min后，用水洗去剩余染液。 媒染 滴加魯古氏碘液,1min后水

40、洗。 脫色 滴加95的乙醇脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止，水洗。 復(fù)染 滴加石碳酸復(fù)紅液復(fù)染1min，水洗。 濾紙吸干，油鏡鏡檢。并記錄細(xì)菌的大小。2。5。3 氧化酶實(shí)驗(yàn)（1）基本原理氧化酶在有瘋子氧及細(xì)胞色素C存在時(shí)可氧化鹽酸對(duì)氨基二甲基苯胺,使之呈玫瑰紅到暗紫色.由此反應(yīng)可知受檢菌是否具有細(xì)胞色素氧化酶。（2）操作步驟 以無(wú)菌操作技術(shù)分別取兩種受檢菌的斜面培養(yǎng)物少許,點(diǎn)種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，35培養(yǎng)1824h。 在以干凈的平皿里放一張濾紙，滴上1%鹽酸對(duì)氨基二甲基苯胺水溶液，僅使濾紙濕潤(rùn)即可，不要過(guò)濕。 用細(xì)玻璃棒刮取平板上受檢菌的培養(yǎng)物，涂抹在濕潤(rùn)的濾紙上。 觀察在10s內(nèi)菌苔或其

41、邊緣呈現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，1030s出現(xiàn)紅色者為遲緩陽(yáng)性，不呈現(xiàn)紅色或30s以后呈紅色均屬陰性。2.5.4 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)（1)基本原理某些細(xì)菌還有過(guò)氧化氫酶，能催化過(guò)氧化氫分解產(chǎn)生氧氣.(2）操作步驟取受檢菌菌苔涂于干凈的載玻片上，向菌苔上滴一滴30雙氧水,有氣泡產(chǎn)生的為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，否則為陰性。2。5.5 淀粉水解試驗(yàn)（1）基本原理淀粉是一種多糖，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)。有的細(xì)胞能產(chǎn)生淀粉酶，分泌到細(xì)胞外，將淀粉水解成麥芽糖后進(jìn)入細(xì)胞，淀粉遇碘呈紫色；細(xì)菌水解淀粉，則菌苔周圍出現(xiàn)無(wú)色透明圈,即可知該菌株是否分泌淀粉酶.(2）操作步驟在淀粉肉凍瓊脂平板上點(diǎn)種所檢細(xì)菌，試問(wèn)培養(yǎng).待菌苔明顯生長(zhǎng)后，在平

42、板面滴加碘液.菌苔周圍有透明圈者為水解淀粉陽(yáng)性。2。5.6 氧化發(fā)酵試驗(yàn)（1）基本原理細(xì)菌能以煙花或發(fā)酵方式利用葡萄糖,糖代謝的結(jié)果有酸產(chǎn)生（有的還產(chǎn)生氣體）.前者產(chǎn)酸慢且少，后者產(chǎn)算量多而快.利用含含低有機(jī)氮的培養(yǎng)基，通過(guò)指示劑顏色變化的情況，可鑒別細(xì)菌從糖類是氧化性產(chǎn)酸還是發(fā)酵性產(chǎn)酸.由軟瓊脂柱中有無(wú)氣體,可判斷是否產(chǎn)氣（2)操作步驟 取休和利夫森氏軟瓊脂培養(yǎng)基5支，用記號(hào)筆作好標(biāo)記. 用接種針以無(wú)菌操作分別取兩種受檢菌的菌苔少許，在軟瓊脂中作穿刺接種，注意接種不要碰到試管底。各接種兩只，一支作對(duì)照。 在3037溫箱培養(yǎng)1218h后觀察結(jié)果。若培養(yǎng)基變色從表面開(kāi)始向下擴(kuò)散，屬于氧化產(chǎn)酸；培

43、養(yǎng)基變色自下往上發(fā)生，則屬于發(fā)酵產(chǎn)酸.若24h已全部變黃，即使從上往下開(kāi)始變色，也可能是發(fā)酵,這是應(yīng)用封油管檢查.2。5.7 吲哚試驗(yàn)（1)基本原理有些細(xì)菌能能分解胰蛋白胨中色氨酸產(chǎn)生吲哚。吲哚與Kovac氏試劑中對(duì)二甲基氨基苯甲醛作用，形成紅色的玫瑰吲哚.（2)操作步驟 取胰蛋白胨水培養(yǎng)基試管5支,將兩種菌各接種兩支，剩下的做對(duì)照，作好標(biāo)記。 3037溫箱培養(yǎng)24h。 取出培養(yǎng)物，沿管壁緩緩加入Kovac氏試劑，使在培養(yǎng)液表面厚35mm.在兩液體界面或界面以上呈現(xiàn)紅色,為陽(yáng)性反應(yīng)。若呈色不明顯，可加45滴乙醚并搖動(dòng)，使乙醚分散于培養(yǎng)液中，然后徑直片刻，待乙醚浮至頁(yè)面后,再沿管壁緩緩加入試劑，

44、觀察結(jié)果。2。5。8 甲基紅試驗(yàn)(1）基本原理某些細(xì)菌在降解葡萄糖的過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，后者進(jìn)而分解產(chǎn)生甲酸、乙酸和乳酸等多種有機(jī)酸，使pH顯著下降，可降至4.2以下，滴加甲基紅指示劑后培養(yǎng)液由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。(2）操縱步驟 受檢菌各接種2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，另取1支培養(yǎng)基試管，不接種作對(duì)照。 37溫箱培養(yǎng)27d。 取培養(yǎng)液0.5ml左右,至于白色磁盤小窩內(nèi)，加一滴甲基紅指示劑,呈紅色為甲基紅陽(yáng)性。2.5.9 乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V-P試驗(yàn))（1)基本原理有些細(xì)菌能將糖嗲寫過(guò)程中產(chǎn)生的丙酮酸脫羧形成乙酰甲基甲醇。后者在堿性條件下與空氣中氧氣起作用生成二乙酰，二乙酰與肌酸或胍基化合物作用生成紅色

45、化合物，即V-P反應(yīng)陽(yáng)性。試劑加入少量萘酚可使反應(yīng)加速，呈色明顯.（2）操作步驟 接種、培養(yǎng)同甲基紅試驗(yàn)。 取1ml培養(yǎng)液，注入一支試管內(nèi)，加0。6ml-萘酚液，再加入0。2mlKOH溶液，用力振蕩. 室溫或溫箱內(nèi)靜置30min后觀察,培養(yǎng)液呈紅色或粉紅色為陽(yáng)性反應(yīng)。2。5.10 利用檸檬酸鹽試驗(yàn)（1）基本原理有些細(xì)菌能利用檸檬酸鈉作為碳源，檸檬酸鈉分解后產(chǎn)生堿性化合物，使培養(yǎng)基呈堿性，培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變成藍(lán)色。（2）操作步驟用接種環(huán)挑取受檢菌，劃線接種于西蒙氏檸檬酸鹽斜面上并穿刺，置于3037溫箱培養(yǎng)27d。接種菌在斜面上或沿穿刺生長(zhǎng),培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色者為陽(yáng)性，不能利用者培

46、養(yǎng)基仍為綠色。2.5.11 產(chǎn)H2S試驗(yàn)（1)基本原理許多細(xì)菌能分解有機(jī)硫化物產(chǎn)生H2S,H2S遇鉛鹽形成黑色的硫化鉛沉淀物。（2）操作步驟將受檢細(xì)菌接種于蛋白胨胱氨酸培養(yǎng)基內(nèi)，用無(wú)菌鑷子夾取一條醋酸鉛濾紙,借助棉塞懸于培養(yǎng)基液面上,不接觸液面.每個(gè)菌株兩個(gè)重復(fù)，同時(shí)作不解中對(duì)照，適溫培養(yǎng).與接種后2d、7d、14d觀察，紙條變黑者為陽(yáng)性,不變色者為陰性。2。6 菌種保藏本實(shí)驗(yàn)采用懸液菌種保藏法。取新鮮的菌懸液0.7mL加入到1mL的螺口管，然后再加入0。3mL的無(wú)菌甘油。在管身注明菌種名、保存日期以及菌種的作用。放在冰箱冷凍層保藏18.3。 結(jié)果與討論3。1 菌株對(duì)AEO7降解效率3.1.1

47、 AEO7特征吸收波長(zhǎng)的確定配制一定濃度的AEO7溶液,取10mL加入10mL的試管內(nèi)，向其加入0.25mL顯色劑，放置120min后，用全光分光光度計(jì)掃描最大吸收波長(zhǎng)，其結(jié)果如圖3所示。圖3 AEO7特征吸收波長(zhǎng)圖譜由圖4可知AEO7的特征吸收波長(zhǎng)為478nm、480nm、482nm。所以本實(shí)驗(yàn)采取中間值480nm做為AEO7的特征吸收波長(zhǎng).3.1。2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制經(jīng)過(guò)稀釋處理，在480nm處，19試管的標(biāo)準(zhǔn)濃度的AEO7的吸光值（表3）.表3 標(biāo)準(zhǔn)濃度的AEO7的吸光值試管編號(hào)AEO7標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/L）吸光值(經(jīng)過(guò)換算處理）142.240.498284.480.5103126。720

48、.5214168.960.5315211.200.5436253。440。5527295。680。5678337.920.5799380.160。5891000.4863。1。3降解效率的比較經(jīng)過(guò)108小時(shí)的培養(yǎng),對(duì)培養(yǎng)液中殘余的AEO7用KII2分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。表4 經(jīng)108h的培養(yǎng)液的吸光值培養(yǎng)液編號(hào)吸光值（經(jīng)過(guò)換算）10.50920。47830.49140.52150.49760。50270.49880。48490.615注：菌液經(jīng)過(guò)離心分離處理。經(jīng)過(guò)對(duì)表4培養(yǎng)液吸光值的分析，得出編號(hào)為2和8的菌株對(duì)AEO7降解效率相對(duì)比較高.分別對(duì)它們重新編號(hào)為A-1、A-2。3

49、。1.4 降解效率的計(jì)算3.1.4.1 數(shù)量關(guān)系的建立由表3的數(shù)據(jù)，和圖4標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，AEO7的濃度與溶液的吸光值基本呈線性關(guān)系，所以利用這個(gè)關(guān)系，可以很容易得出經(jīng)降解后培養(yǎng)液殘余的AEO7的濃度。 （1）式中：i，j是表3中試管的編號(hào); Ai，Aj是表3對(duì)應(yīng)的試管編號(hào)的吸光值; T是表3對(duì)應(yīng)試管編號(hào)AEO7濃度差。當(dāng)AmA0時(shí)，Nm= （21）當(dāng)Am<A0時(shí),Nm=42。24+ （2-2）式中：n是表4中試管編號(hào)； D是公式（1）中算出的常數(shù),mg/L； Am是表4中與m對(duì)應(yīng)的溶液的吸光值； A0是表3中作對(duì)比的10號(hào)試管溶液的吸光值； Nm是表4中與m對(duì)應(yīng)的溶液AEO7的濃度，mg

50、/L.Wm=×100% （3）式中:Wm是與m對(duì)應(yīng)的編號(hào)的菌株的降解效率； Nm是表4中與m對(duì)應(yīng)的溶液AEO7的濃度，mg/L； N9是表4中作對(duì)照的溶液AEO7的濃度，mg/L。3。1。4.2 降解效率的計(jì)算由公式（1）算出D：=0.011 mg/L由公式（2）算出Nm：N9=(0.615-0。486)×=495。4mg/LA-1菌株的經(jīng)108h培養(yǎng)的降解效率：N2=42。24+（=42。24+（0.484-0。486)× =11。52 mg/LW2=×100=97。67A-2菌株的經(jīng)108h培養(yǎng)的降解效率:N8=42。24+（=42.24+(0。47

51、80.486）× =34。56 mg/LWm=×100%=93.02%3。2菌種鑒定3。2。1菌落形態(tài)的觀察用劃線法，在30，pH為7.0培養(yǎng)12h獲得單菌菌落的形態(tài)特征，如圖5所示表5 菌落的形態(tài)鑒定項(xiàng)目鑒定結(jié)果形狀圓形、略凸起邊緣邊緣整齊、光滑透明度半透明菌落顏色淡黃色表面光滑、油膩生長(zhǎng)速度較快濕潤(rùn)程度濕潤(rùn)3。2。2 革蘭氏染色對(duì)篩選得到的A-1,A2菌株進(jìn)行革蘭氏染色，其結(jié)果均為G桿菌(圖4，圖5）。圖4 A1菌株革蘭氏染色圖5 A2菌株革蘭氏染色3。2。3 細(xì)菌大小的測(cè)定在顯微鏡的目鏡里加入鏡臺(tái)測(cè)微尺，在油鏡下觀并記錄細(xì)菌的大?。ū?、7）表6 A1菌體大小的測(cè)定編

52、號(hào)長(zhǎng)（m）寬（m）11。20。621。40。631。10。541。10.651。30。661。40.671.40。681。20。591。50。6101。30。6均值1。30.6表7 A2菌體大小的測(cè)定編號(hào)長(zhǎng)(m）寬（m)11。70。621.90。631.70。541。80。651.60.761。90.671。90。681。70.591.90。5101。60。6均值1.80。63.2.4 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)3.2。4。1 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象（1)氧化酶實(shí)驗(yàn)：AI菌株不能讓1%鹽酸對(duì)氨基二甲苯芐胺溶液變色，但是A2菌株可以.（2）過(guò)氧化氫酶試驗(yàn):兩株菌都能使過(guò)氧化氫產(chǎn)生氣泡。(3)淀粉水解實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過(guò)三天的培養(yǎng)，加入碘液，兩株菌菌苔周圍顯示紫色,沒(méi)有明顯的透明圈。（4)葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：經(jīng)過(guò)一周的培養(yǎng),兩株菌的培養(yǎng)基都是從上往下變色，并且沒(méi)有完全變色。（5)甲基紅試驗(yàn)：經(jīng)過(guò)三天的培養(yǎng),菌液不能使甲基紅變?yōu)榧t色。(6)V-P試驗(yàn)：經(jīng)過(guò)三天培養(yǎng)，向菌液中加入萘酚和KOH,顏色只是稍微變黃,并沒(méi)有變?yōu)榧t色或粉紅色。（7)產(chǎn)H2S試驗(yàn)：在培養(yǎng)到第三天,所有醋酸