基因工程實(shí)驗(yàn)課教學(xué)改革的再探索

1、基因工程實(shí)驗(yàn)課教學(xué)改革的再探索摘要：本文對(duì)近年來基因工程實(shí)驗(yàn)課教改進(jìn)行再探索，設(shè)計(jì)兩種蛋 口質(zhì)的原核表達(dá)純化及活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，學(xué)生從中任選一種，完成各自實(shí)驗(yàn) 后合作完成最終實(shí)驗(yàn)。此改革拓寬了學(xué)生的學(xué)術(shù)視野，鍛煉了學(xué)生的口學(xué) 能力和團(tuán)隊(duì)合作能力。關(guān)鍵詞：基因工程實(shí)驗(yàn)課；教學(xué)改革；原核表達(dá)純化；活性測(cè)定中圖分類號(hào)：g642. 0文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a文章編號(hào)：1674-9324 (2017) 08-0265-02誕牛于20世紀(jì)70年代初的dna重組技術(shù)是一種獲取、整理、破譯、 編輯和表達(dá)生物遺傳信息的現(xiàn)代生物技術(shù)，它在諸多方面日益顯示出極高 的實(shí)用價(jià)值。目前，作為dna重組技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的基因工程，正在驅(qū)動(dòng)

2、 著人類社會(huì)生活方式的重大變革。在這一技術(shù)浪潮的推動(dòng)下，基因工程已 成為生物科學(xué)、生物工程和生物技術(shù)本科生的專業(yè)主干課程之一。與其他 牛物學(xué)專業(yè)課相比基因工程稍有不同，其他牛物學(xué)專業(yè)課比較注重理論部 分而對(duì)實(shí)驗(yàn)部分要求不高(如植物生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等)， 但基因工程卻理論與實(shí)驗(yàn)并重，因此實(shí)驗(yàn)課在本門課程中的地位就更加重 要。通過實(shí)驗(yàn)課的鍛煉，我們不但能幫助學(xué)生提高動(dòng)手能力，還能反過來 加深對(duì)理論課的理解，這有助于加強(qiáng)學(xué)生的實(shí)踐能力和創(chuàng)新精神。作為一 門炙手可熱的前沿科學(xué)，近年來基因工程的最新進(jìn)展可謂日新月異眼花繚 亂，在此大背景下基因工程本科教學(xué)就必須與時(shí)俱進(jìn)，不斷革新從而跟上 時(shí)代

3、發(fā)展的腳步。本文在近年來基因工程實(shí)驗(yàn)課改革的基礎(chǔ)上再次創(chuàng)新， 設(shè)計(jì)了兩種蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化及活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，通過創(chuàng)新的實(shí)驗(yàn)安排 使學(xué)生在相同的課時(shí)中收獲更多的知識(shí)，得到更多的鍛煉。lon蛋白酶廣泛地分布于微生物、動(dòng)植物和人類中，是一種多結(jié)構(gòu)域 的、atp依賴型的蛋白酶，負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi)特殊的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、有缺陷的 蛋白質(zhì)和異常蛋白質(zhì)，與此同時(shí)lon蛋白酶還具有分了伴侶活性。lon蛋 白酶的這種多活性特點(diǎn)為我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了較大的空間。綠色熒光蛋 白(green fluorescent protein gfp)在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下會(huì) 發(fā)出綠色螢光，因此在日?？诠庹丈湎耮fp即可呈現(xiàn)出綠色。g

4、fp在低pii 值條件下變性后會(huì)喪失綠色熒光，經(jīng)lon蛋白酶分子伴侶活性作用后復(fù)性 又能夠恢復(fù)綠色熒光。gfp蛋白的這種可見特性為初學(xué)者的實(shí)驗(yàn)操作增加 了趣味性。本文設(shè)計(jì)了這兩種蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)它們的 特性設(shè)計(jì)了后續(xù)的活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。一、進(jìn)一步探索教學(xué)改革的目的當(dāng)前的大多數(shù)基因工程實(shí)驗(yàn)課教學(xué)改革是設(shè)計(jì)了一個(gè)蛋白質(zhì)的原核 表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)。這樣的設(shè)計(jì)不僅較為完整地覆蓋了基因工程的實(shí)驗(yàn)步 驟，而且還將原有的分散的支離破碎的實(shí)驗(yàn)安排整合為一個(gè)有機(jī)的整體。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)可將載體的酶切、連接、載體構(gòu)建、原核宿主轉(zhuǎn)化、重組子的鑒 定、蛋白質(zhì)的表達(dá)純化等相關(guān)實(shí)驗(yàn)有機(jī)地整合起來，是一個(gè)前后相繼緊密 銜

5、接的整體。學(xué)生在每個(gè)實(shí)驗(yàn)過程屮都必須小心謹(jǐn)慎全身心投入，因?yàn)槊?一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都是后一個(gè)實(shí)驗(yàn)的初始材料，這就好比一個(gè)串聯(lián)電路，一 點(diǎn)斷開全盤皆輸。這就要求同學(xué)們必須極其專心，直到全部實(shí)驗(yàn)完成，從 而使學(xué)生產(chǎn)生更加深刻的印象，從而顯著地提升了教學(xué)質(zhì)量。但是經(jīng)過一 段時(shí)間的教學(xué)實(shí)踐后，我們乂發(fā)現(xiàn)了一些有待改進(jìn)的地方。(1)已有的實(shí) 驗(yàn)改革雖己覆蓋基因工程“切、接、轉(zhuǎn)、增、檢”的基本實(shí)驗(yàn)步驟，但尚 未明確涉及目的蛋口的活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，因此依然存在實(shí)驗(yàn)覆蓋面不夠完整 的問題。(2)因?yàn)橐延械膶?shí)驗(yàn)改革只設(shè)計(jì)了一個(gè)蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化， 所以無法比較不同蛋白質(zhì)表達(dá)純化過程中存在的不同問題。這樣便限制了 學(xué)生

6、的學(xué)術(shù)視野，很可能會(huì)誤認(rèn)為不同蛋白質(zhì)的原核表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)鮮有 區(qū)別。(3)實(shí)驗(yàn)中的目的蛋白基本不可見，使初學(xué)者感到實(shí)驗(yàn)操作單調(diào)乏 味，進(jìn)而影響了學(xué)習(xí)興趣。本文針對(duì)這些問題進(jìn)行了教學(xué)改革，從而進(jìn)一 步提高了教學(xué)質(zhì)量。二、教學(xué)改革內(nèi)容本實(shí)驗(yàn)改革設(shè)計(jì)了 lon蛋白酶和gfp兩種蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化實(shí) 驗(yàn)，學(xué)生經(jīng)分組后可任意選取一種蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)純化，然后各自進(jìn)行l(wèi)on 蛋白酶的蛋白酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)和gi；p變性實(shí)驗(yàn)。完成各自全部實(shí)驗(yàn)后，表 達(dá)純化不同蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)小組使用各自產(chǎn)物，以合作的方式完成以gfp為 底物測(cè)定lon蛋白酶分了伴侶活性的實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：(1)使用限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切中間載

7、體上的 目的基因片段和表達(dá)載體，然后進(jìn)行膠回收；(2)使用t4 dna連接酶將 目的基因片段連接到表達(dá)載體上；(3)感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化；(4)重組子篩 選;(5)重組蛋白的表達(dá)和純化；(6)測(cè)定lon蛋白酶的蛋白酶活性或進(jìn) 行g(shù)fp蛋白失活實(shí)驗(yàn)；(7)以gfp蛋白為底物測(cè)定lon蛋白酶的分子伴侶(8)討論各自實(shí)驗(yàn)過程中的心得體會(huì)；(9)撰寫實(shí)驗(yàn)論文。在第8 部分討論環(huán)節(jié)中，要求學(xué)生充分交流不同蛋白質(zhì)表達(dá)純化過程中遇到的問 題以及解決方式。然后在撰寫實(shí)驗(yàn)論文中將兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)過程進(jìn)行比 較，分析每種蛋白質(zhì)表達(dá)純化過程中的難點(diǎn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)出自本人的科研課 題，因此幣個(gè)流程非常成熟可靠性很高，便于初學(xué)

8、者掌握基因工程實(shí)驗(yàn)的 基本知識(shí)和流程。三、教學(xué)改革總結(jié)本文設(shè)計(jì)了兩種蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)，兩者雖然技術(shù)路線相 同，但是又有各自特有的有待解決的技術(shù)問題。通過教師的介紹和引導(dǎo)， 每個(gè)學(xué)生實(shí)驗(yàn)小組口主選擇實(shí)驗(yàn)課題，完成各自實(shí)驗(yàn)后再使用各自產(chǎn)物合 作完成最終實(shí)驗(yàn)?？傮w來說本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)解決了以下幾點(diǎn)教學(xué)問題：(1)通過取消重復(fù)實(shí) 驗(yàn)拓寬了實(shí)驗(yàn)課覆蓋面：我們將與分子生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)(目的基因獲取 相關(guān)實(shí)驗(yàn)，即總dna提取和pcr等實(shí)驗(yàn))取消，直接向?qū)W生提供目的基因 片段。這樣既避免了實(shí)驗(yàn)重復(fù)，又為新增的目的蛋白活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)節(jié)省了 必要的課時(shí)。(2)通過二選一的方式為實(shí)驗(yàn)課擴(kuò)容：如果要求學(xué)牛同時(shí)表 達(dá)純

9、化兩種蛋白質(zhì)，則工作量過人難以實(shí)現(xiàn)。所以我們要求學(xué)生自主決定 任選其一，然后相互交流討論各自實(shí)驗(yàn)過程中的心得體會(huì)。這種選擇性設(shè) 計(jì)會(huì)促使學(xué)生主動(dòng)思考問題，同時(shí)也無形中擴(kuò)大了實(shí)驗(yàn)課容量拓寬了學(xué)生 的學(xué)術(shù)視野，討論環(huán)節(jié)的設(shè)置還會(huì)鍛煉學(xué)生的學(xué)術(shù)交流能力。(3)增加實(shí) 驗(yàn)趣味性：gfp是一種肉眼可見的蛋白質(zhì)，在其表達(dá)純化過程中會(huì)伴有綠 色出現(xiàn)。lon蛋白酶雖肉眼不可見，但在其活性測(cè)定過程中依然會(huì)出現(xiàn)肉 眼可見的底物顏色變化。這樣便使基因工程實(shí)驗(yàn)初學(xué)者的操作變得有趣起 來，從而激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。(4)培養(yǎng)學(xué)生的團(tuán)隊(duì)合作能力：表達(dá)純 化不同蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)小組，最終要拿著各自的產(chǎn)物共同完成最終的實(shí)驗(yàn)。 這

10、樣的設(shè)計(jì)使學(xué)生認(rèn)識(shí)到團(tuán)隊(duì)合作的重要性，因?yàn)闆]有其他小組純化的蛋 白質(zhì)任何小組都無法獨(dú)立完成所有實(shí)驗(yàn)。這種新穎的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)充分調(diào)動(dòng)了學(xué)牛的學(xué)習(xí)積極性，鍛煉了學(xué)牛的獨(dú) 立思考能力和團(tuán)隊(duì)合作能力，使學(xué)生由傳統(tǒng)教學(xué)中的被動(dòng)接受者變成了主 動(dòng)的探索者、積極的討論者和負(fù)責(zé)的合作者。通過教學(xué)實(shí)踐，我們發(fā)現(xiàn)此 教學(xué)設(shè)計(jì)取得了良好的教學(xué)效果，獲得了學(xué)生的支持和好評(píng)。參考文獻(xiàn)：1 barakat s, pearce d a, sherman f, ct al. maizo contains a lon protease gene that can partially complement a yeast piml-deletion mutantj. plant mol biol, 1998 (37)： 141-154.2 mi l, fatima r, edward e m, el al.m aurizi and alexander w. crystal structure of the nterminal domain of e. coli lon protease proteinsciencej, 2007, 28 (2)： 2895-2900.3 王文鋒，穆靈敏，張采宏，等生物技術(shù)專業(yè)基因工程大實(shí)驗(yàn)的探 索和優(yōu)化j生物技術(shù)世界,2016, (