液相色譜-質譜聯用儀

1、 液相色譜-質譜聯用儀液相色譜-質譜聯用儀摘要：液相色譜-質譜聯用技術是以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質譜為檢測系統(tǒng)的現代分析手段。本文介紹了液相色譜-質譜聯用技術的分析特點及關鍵技術，并詳細介紹了該技術應用情況，以“應用液質聯用技術測定化妝品中12種磺胺類藥物”為例詳細說明了該技術的應用方法及優(yōu)化條件。最后展望了該技術的發(fā)展趨勢。關鍵詞：液相色譜-質譜聯用儀、分析條件、優(yōu)化條件Abstract:LC-MSisamodernanalyticaltoolswithliquidchromatographyasaseparationsystemandmassspectrometryasadetection

2、system.Thispaperintroducesboththecharacteristicsoftheliquidchromatography-massspectrometrytechnologyanditskeytechniques,andshowstheapplicationofthistechnology,andtakesDeterminationof12kindsofsulfonamideresiduesincosmeticsbyLC-MS-MSmethodasanexampletoexplainitsapplicationandoptimalconditionsindetail.

3、Finally，thefuturedevelopmentandofthetechnologyisprospected.Keywords:liquidchromatography-massspectrometry,analyticalconditions,theoptimumconditions1前言液質聯用（LC-MS）又叫液相色譜-質譜聯用技術，它以液相色譜作為分離系統(tǒng),質譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質譜部分和流動相分離，被離子化后，經質譜的質量分析器將離子碎片按質量數分開，經檢測器得到質譜圖。液質聯用體現了色譜和質譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相

4、對分子質量與結構信息的優(yōu)點結合起來，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領域得到了廣泛的應用。LC-MS除了可以分析氣相色譜-質譜（GC-MS）所不能分析的強極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個方面的優(yōu)點：分析范圍廣、分離能力強、定性分析結果可靠、檢測限低、分析時間快、自動化程度高2液相色譜-質譜聯用儀液相色譜-質譜聯儀主要由高效液相色譜、接口裝置（同時也是離子源）、質譜儀和數據處理系統(tǒng)構成。高效液相色譜儀和一般的液相色譜儀基本相同，其作用是將混合物試樣分離后進入質譜儀。該儀器生物關鍵部分是LC和MS之間的接口裝置，其主要作用是出溶劑并使試樣離子化。由于接口裝置同時就是離子源，

5、因此質譜儀部分只包括質量分析器，對進入的離子進行質量分離，分離后的離子按質量的大小先后由收集器收集，并記錄質譜圖。液質聯用儀器3關鍵技術液質聯用技術的關鍵在于：如何將液相色譜過程使用的流動相與樣品分開，如何使極性大、難揮發(fā)、相對分子質量大的樣品完全離子化并引入質譜分析器。3.1接口技術LC/MS最重要的位置是接口裝置。樣品經液相色譜分離，進入質譜，要除去溶劑并使其電離，同時要求液相色譜的高流速與質譜的氣相和高真空度條件相匹配。接口的作用就是將被分析的樣品分子電離成帶電離子，并使這些離子在離子光學系統(tǒng)的作用下匯聚成一定幾何形狀和一定能量的離子束，然后進入質量分析器被分離。這是當時解決聯用技術的最

6、大難題。自20世紀70年代初，人們開始致力于液-質聯用接口技術的研究。在開始的20年中處于緩慢的發(fā)展階段，研制出了許多種聯用接口，但均沒有應用于商業(yè)化生產。直到大氣壓離子化(atmospheric-pressureionization,API)接口技術的問世,液-質聯用才得到迅猛發(fā)展，廣泛應用于實驗室內分析和應用領域。主要有大氣壓電離接口、熱噴霧電離接口、離子束電離接口等，大氣壓電離接口是現有商品化儀器中最為普遍的電離接口。3.2、基質效應321基質效應的來源LC-MS中的基質效應現象最初在1993年被發(fā)現，當改變樣品基質的種類和濃度時，待測物電噴霧化質譜的響應值降低了。美國FDA2001年出

7、版的生物分析方法驗證準則明確提出：在LC-MS分析方法開發(fā)和驗證過程中需要對基質效應進行評價?；|效應是指樣品中除了待測物以外的其他基質成分對待測物測定值的影響，它源自色譜分離過程中與被測物共流出的物質對被測物離子化過程的影響，共流出干擾物可分為內源性雜質和外源性雜質。內源性雜質是指樣品提取過程中同時被提取出來的有機或無機分子，當這些物質在共提取液中濃度較高，并與目標化合物共流出色譜柱進入離子源時，將嚴重影響目標化合物的離子化過程。外源性雜質通常易被人們忽視，但也會帶來嚴重的基質效應。這些干擾物由樣品前處理各步驟引入,文獻報道的主要包括的聚合物殘留、酞酸鹽、去污劑降解產物、離子對試劑、有機酸等

8、離子交換促進劑、緩沖鹽或SPE小柱材料及色譜柱固定相釋放的物質等。3.22基質效應的確認方法目前報道的缺人基質效應的方法有兩種，一種是標準曲線測定法，另一種方法是利用柱后灌注技術進行測定。3.23基質效應的補償基質效應的存在會嚴重影響對待測物的定量準確度和精密度，且影響因素多變,很難被完全消除。近兒年來，致力于消除和補償基質效應的研究逐漸增多，主要包括優(yōu)化質譜條件，優(yōu)化色譜分離體系，多步凈化措施，使用內標物定量，采用基質匹配標準曲線定量，回聲峰技術等。4、應用隨著聯用技術的日趨完善，HPLC-MS逐漸成為最熱門的分析手段之一。特別是在分子水平上可以進行蛋白質、多肽、核酸的分子量確認，氨基酸和堿

9、基對的序列測定及翻譯后的修飾工作等，這在HPLC-MS聯用之前都是難以實現的。HPLC-MS作為已經比較成熟的技術，目前己在生化分析、天然產物分析、藥物和保健食品分析以及環(huán)境污染物分析等許多領域得到了廣泛的應用。4.1應用實例應用液質聯用技術測定化妝品中12種磺胺類藥物4.11分析條件4.111色譜條件8色譜柱，5Lm,211mm150mm;流速:0125mL/min;柱溫:30e;進樣量:25LL;流動相:流動相A為U=011%的甲酸水溶液，流動相B為甲醇；洗脫梯度程序見表1。表1分離12種磺胺類藥物的洗脫梯度TablElutionconditionfordeterminationof12k

10、indsofsulfonamidet/mill0（0-1%的甲酸水溶液）/%*（甲醇）/%096439641070302065353010904.112質譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;檢測方式：多反應檢測；干燥氣:N2;霧化氣壓力：27518kPa;干燥氣溫度:340e;干燥氣流速:8L/min。12種磺胺類藥物質譜分析的條件參數如表2所示。表212種磺胺類藥物的質譜參數Tab212ParameterofMassspectraof12kindsofsulfonamide祓測物質名稱定量離子定性離子碎裂電壓V匹撞能量V磺胺瞇215-1/156215-1/108;21

11、5.1-1564025/10磺胺醋酰214-9/156214.9.-156;214.9.-108405/15磺肢腳辰25L1/156251.1/156;251.1/1084010/20磺胺噱魁256.1/156236.1/156;256.1.1084010/25磺胺毗囁250.1/156250-.1/156;250-1.183.810015/15磺胺甲基喘唳265.1/156265.1/156;265.1/171.84015/15磺胺對甲氧咗噬281.1/156281.1/156;281.1/1084015/20磺胺二甲基咗嚨279.1/156279-1.-156;279.1185.64010

12、/10磺腔甲氧噠嗪281.1/156281.1/156;281.1/187.810015/15285-0/156285-0/156;285.0/1084015/15磺肢甲基異左呼254.1/108254.1/156;254.1108&015/30磺胺間二甲氧噸唏31L1/15631b1.156;31L1-1084020/304.12樣品處理稱取化妝品110g（精確到01001g）于50mL容量瓶中，用乙睛定容至刻度，充分搖勻后超聲提取20min,上層提取液經濾紙過濾，將25mL濾液吸取至100mL蒸發(fā)瓶內，并將其接至旋轉器上，于40e水浴中減壓蒸餾至干，用5mL水溶解，加入5mL正己烷渦旋30

13、s,靜置分層，棄掉上層正己烷，再加5mL正己烷渦旋30s,靜置分層，棄去正己烷層，移取3mL水相于5mL聚丙烯離心管中，以10000r/min離心10min,過0120Lm濾膜,供液相色譜-串聯質譜儀分析。4.13結果與討論4.131樣品提取磺胺類藥物易溶于乙腈，而且乙腈又有較強的清除蛋白能力，因此利用乙腈作為提取溶劑。超聲波提取20min,旋轉蒸發(fā)富集提取液，用水溶解,正己烷脫脂，再經C18色譜柱將樣品測定液中磺胺類藥物進行有效分離，利用串聯三重四極桿質譜對其進行準確的定性定量分析。試驗結果表明，該處理具有操作簡單、測定周期短，適用于大批量樣品的快速檢測，而且有較高的穩(wěn)定性和滿意的提取效率。

14、4.132質譜條件優(yōu)化以直接進樣方式將每種100ng/mL的磺胺藥物標準溶液分別注入離子源中，在正離子檢測方式下進行母離子全掃描,得每種磺胺的分子離子峰，以每種磺胺的準分子離子峰為母離子,進行二級質譜掃描，最后采集全掃描的二級質譜圖，得碎片離子信息，再對得到每種磺胺的二級質譜參數如破碎電壓、碰撞能量等進行優(yōu)化，使每種磺胺的定性離子與定量離子產生的離子對強度比例達最大時為最佳，得每種磺胺的二級質譜圖。4.133色譜條件優(yōu)化圖1為標準樣品混合物的總離子流圖。為使所有的磺胺類藥物達到滿意的分離度,分別考察含有014%乙酸或012%甲酸的10mmol/L乙酸銨溶液、U=011%的甲酸水溶液和甲醇、乙腈

15、、U=50%的甲醇-乙腈等有機溶液作流動相時的分離效果。結果表明，以011%甲酸水溶液和甲醇為流動相梯度洗脫時，可使12種磺胺類藥物得到較好的分離。圖112種磺胺類藥物混合標準品的總離子流圖FigiTICdiagramof12kindsofsulfonamide4.134線性范圍和檢出限將逐級稀釋的標準工作溶液分別進樣25LL，測定結果經線性回歸，線性范圍、回歸方程(y為峰面積;x為質量濃度,Lg/L)、相關系數、檢出限(S/N=3)和定量限見表3。表312種磺胺類藥物的回歸方程、線性范圍、相關系數及檢出限Tab.3Regressionequation,linearityrange,conla

16、tivecofficient,detectionlimitof12kindsofsulfonamide磺胺線性范圍ngmL線性回歸方程相關系數r檢出限mg-kg-1定量限/rLsk.f11100y=2574.-1289.7a999s1033磺胺醋酰1-100y=225h3x430.0a999210331-100y=l095.3x349.4a99991033磺胺毗哽1-100y=3637.3x-2026.7a999710331-100y=4074,2x2026-2a99911033磺胺甲基喘喘1-100y=3388b2x-2334-8a99961033磺胺二甲基喘咗1100y=3357.4x-1

17、383-8a99931033磺胺劉甲氧疇唏1-100y=l813.lx-463.6a99961033磺胺甲氧噠嗪1-100y=6557.-421S-50.99991033磺.胺氯噠嗪1-100y=350h3x-2053-4(L999S1033磺胺甲基異噁呼1-100y=3935.5x-2668-50.99991033磺胺間二甲氧喘唏1100y=8192.4x-6005-60999710334.135方法的加標回收率和精密度表4列出了加標回收率實驗數據表4化妝品中12種磺胺類藥物的加標回收率數據（n=6）Tabl4Recoveryof12kindsofsulfonamideincosmetics

18、amples磺胺添加量平均加標回相對標準/丄gkg-1收率/%偏差/%磺胺月米10090.27.41磺胺醋酰10093.56.15磺胺嗨喘10086.05.00磺胺毗喘10084.02.57磺胺嗟呼10080.13.45磺胺甲基嚅噪10082.74.34磺胺二甲基卩密噪10082.76.23磺胺對甲氧囉喘10090.75.25磺胺甲氧噠嗪10085.26.57磺胺氯噠嗪10090.66.13磺胺甲基異咚睦10087.37.10具體操作程序為:稱取空白樣品6份每份1g，分別添加質量濃度為6”0Lg/mL的12種磺胺類藥物的混合標準溶液011mL,按供試品溶液制備方法制備后，進行測定。從表4中的回

19、收率及精密度數據可以看出，加標回收率在8011%9315%,相對標準偏差在2157%7141%,滿足試驗要求。5發(fā)展趨勢與已成熟的GCMS聯用技術相比較，LC-MS/MS聯用技術還處于發(fā)展階段。但LC-MS/MS所具備的一系列優(yōu)點，決定了它的應用前景比GC-MS更為廣泛。在“接口”方面，API接口的成功應用，使得液-質聯用成為可能。在對大分子和小分子化合物分析中，展現了它作為通用接口的廣闊應用前景。能夠實現微徑HPLC與質譜的聯用，這是近來的一個發(fā)展趨勢。在串聯質譜方面，目前以四極桿串聯質譜為主，它可進行MS1和MS2操作（空間上）。離子阱質譜和富利葉變換質譜（FTICRMS）亦可完成多級串聯

20、質譜分析（時間上），離子阱質譜通過改變阱里射頻場最多可進行10級MS操作，FT-ICR-MS通過離子回旋共振進行多級MS操作。飛行時間質譜（TOF）作為第二個質量分析器，由于其分辨率高、質量范圍寬、掃描快和靈敏度高等優(yōu)點，成為一個重要的發(fā)展方向。LC-MS/MS聯用技術愈來愈多地受到人們的重視，一些國際著名的分析儀器公司和研究機構建立多個研究實驗室參于研究開發(fā)。總之，為應用目的而建立的LC-MS/MS聯用技術會越來越多，應用研究課題也會越來越多。參考文獻：CaoHong,WangHao,LiuYanqin,YangHongmei,GuoQilei.Determinationof12kindso

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