硅膠柱層析原理和試驗(yàn)技巧

1、硅膠柱層析原理硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。硅膠柱層析流動相極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)；極性大的用甲醇：水：正丁醇： 醋酸系統(tǒng)；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸硅膠柱層析慣用方法1. 稱量。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。2. 攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石?/p>

2、醚/乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿 /醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤 其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化 鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過柱。3. 裝柱。將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降，會有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi)，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。4. 壓實(shí)。沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓， 直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10 體積。無論走常壓柱或加壓柱，

3、都應(yīng)進(jìn)行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。5. 上樣。干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團(tuán)脫脂棉塞至接近硅 膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會沖壞硅膠表面。6. 過柱和收集。柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H， 0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml 收一餾分。7. 檢測。要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會損失較多產(chǎn)品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑 底1-2個數(shù)量級。8. 送譜。收集的產(chǎn)品旋干，在

4、送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少或?yàn)橐后w，可過一小凝膠柱，作為送 譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5ppm左右所謂的硅膠"峰。柱層析分離的實(shí)驗(yàn)方法和技巧常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由于柱 分的經(jīng)驗(yàn)成分太多，所以下面我就幾年來過柱的體會寫些心得，希望能有所幫助。一：柱子可以分為：加壓，常壓，減壓壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的 時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多

5、，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣 （很大的噪音，而且時間長）。以前曾經(jīng)大量的過減壓柱，對它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓后，就 幾乎再也沒動過減壓的念頭了。加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮 空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得加壓柱在普通的有機(jī)化合物的分離中是比較適用的 二：關(guān)于柱子的尺寸 應(yīng)該是粗長的最好。柱子長了，相應(yīng)的塔板數(shù)就

6、高。柱子粗了，上樣后樣品的原點(diǎn)就?。ǚ从吃谥由暇?是樣品層比較?。?，這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的 難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有 0.5 厘米，那么各組分就比較容易 得到完全分離了。當(dāng)然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過這些成本相對于產(chǎn)品來說也許 就不算什么了（有些不環(huán)保的說，不過溶劑回收重蒸后也就減小了部分浪費(fèi)） 。現(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在 1 : 510，書中寫硅膠量是樣品量的 3040倍，具體的選擇要具體分析。 如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開（是指在所需組分rf在0.20.4，雜質(zhì)相差0.1以

7、上），就可以少用硅膠,用小柱子（例如 200毫克的樣品，用2cmK 20cm的柱子）；如果相差不到 0.1，就要加大柱子，我覺得可 以增加柱子的直徑，比如用 3cm 的，也可以減小淋洗劑的極性等等。三：關(guān)于無水無氧柱 適用于對氧，水敏感，易分解的產(chǎn)品，可以濕柱，也可以干柱。不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和 一次，因?yàn)槿軇┖凸枘z飽和時放出的熱量有可能是產(chǎn)品分解，畢竟要分離的是敏感的東東，小心不為過。 也是因?yàn)榉蛛x的東西比較敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk 操作。至于是加壓、常壓、減壓，隨需而定。因?yàn)槭?schlenk 操作，所以點(diǎn)板是個問題，如果樣品是顯色的，恭喜了，不用

8、點(diǎn)板，直 接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色，只好準(zhǔn)備幾十個 schlenk 瓶，一瓶一瓶的點(diǎn)，不過幾次之后就 知道樣品在哪， 也就可以省些了。 像我以前過一根無水無氧柱，需要六個 schlenk ，現(xiàn)在只一個就能把所要 的全收集到。無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。 因?yàn)楣枘z中有大量的羥基裸露在外， 很容易是樣品分解， 特別是金屬有機(jī)化合物和含磷化合物。而氧化鋁可以做成堿性、中性和酸性的，選擇余地比較大，但是比 硅膠要貴些。聽說有個方法，就是用石英做柱子，然后用 HF254 做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一照 就知道產(chǎn)品在哪里了，沒有驗(yàn)證過。哪位做過可以提出來大家參詳參詳。四：

9、關(guān)于濕法、干法上樣 濕法省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了 淋洗劑了。很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關(guān)系?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會析出，這一般都是 比較大量的樣品才會出現(xiàn)，是因?yàn)楣枘z對樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會發(fā)生，這就 應(yīng)該先重結(jié)晶，得到大部分的產(chǎn)品后再柱分，如果不能重結(jié)晶，那就不管它了，直接過就是了，樣品隨著 淋洗劑流動會溶解的。有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如 DMF,DMSO 等，會隨著溶劑一起走，顯色是一個很 長的脫尾），這時就必須用干法上柱了。樣品和硅膠的量有一種說法是1： 1 ，我覺得是

10、越少越好，但是要保證在旋干后，不能看到明顯的固體顆粒（那說明有的樣品沒有吸附在硅膠上） 。五：溶劑的選擇 當(dāng)然是最便宜，最安全，最環(huán)保的了。所以大多選用石油醚，乙酸乙酯。文獻(xiàn)中有寫用正己烷的，太貴了， 除非特別需要不要用不然銀子嘩嘩的，流的比淋洗劑還快，不過因?yàn)闃O性很小，有時還是非它不可。乙醚 也可以用，但是就是容易睡覺，注意保持清醒別讓溶劑流干了，那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的， 但是要知道，它和硅膠的吸附是一個放熱過程，所以夏天的時候經(jīng)常會在柱子里產(chǎn)生氣泡，天氣冷的時候 會好一些。甲醇據(jù)說能溶解部分的硅膠，所以產(chǎn)品如果想過元素分析的話要留神，應(yīng)該經(jīng)過后繼處理，比 如說重結(jié)晶等。其他的

11、溶劑用的相對較少，要依個人的不同需要選擇了。由于某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛） ，我們這里是用 10 升或 25 升的塑料桶裝的，就要 注意這些工業(yè)品的純度是較低的。 經(jīng)常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質(zhì)， 其他的雜質(zhì)就可想而知了， 所以在比較嚴(yán)格的柱分時就要對溶劑重蒸。當(dāng)然過原料時就可以免去這一步了，反正下面還有提純的方 法。另外溶劑在過柱子后最好也回收使用，一方面環(huán)保，另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費(fèi)，缺點(diǎn)是要消耗一定的人 工。這里要注意的是，一般在過柱同時進(jìn)行的是減壓旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度的不同會 導(dǎo)致極性的變化，一般會使得極性變大，在梯度淋洗時比較合適，正好極性

12、越來越大了。在過完柱子后， 溶劑最后回收要采用常壓， 因?yàn)樵跍p壓旋蒸時會有部分低沸點(diǎn)的雜質(zhì)一起出來， 常壓時就會減少這種現(xiàn)象， 如果雜質(zhì)和你下面要過的樣品有反應(yīng)那就慘了。六：關(guān)于操作問題1、裝柱 柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑，會被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟節(jié)門的。干法和濕法裝柱覺 得沒什么區(qū)別，只要能把柱子裝實(shí)就行。裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢） ，一定要 均勻（不然樣品就會從一側(cè)斜著下來） 。書中寫的都是不能見到氣泡， 我覺得在大多數(shù)情況下有些小氣泡沒 太大的影響，一加壓氣泡就全下來了。當(dāng)然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習(xí)了。但是柱子更 忌諱的是開裂，甭管

13、豎的還是橫的，都會影響分離效果，甚至作廢！2、加樣 用少量的溶劑溶樣品加樣，加完后將下面的活塞打開，待溶劑層下降至石英砂面時，再加少量的低極性溶 劑，然后再打開活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離（24cm就夠了），再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品 快速下行。3、淋洗劑的選擇感覺上要使所需點(diǎn)在rf0.20.3左右的比較好。不要認(rèn)為在板上爬高了分的比較開，過柱子就用那種極性，如果 rf 在 0.6，即使相差 0.2 也不容易在柱子上分開， 因?yàn)橹邮且粋€多次爬板的狀態(tài)， 可以通過公式的比 較： 0.6/0.8 一次的分離度，肯定不如（ 0.2/0.3 ）的三次方或四次方大。4、樣品的收集用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與硅膠的吸附比較強(qiáng)的話，就不容 易流出。這樣就會發(fā)生，后面的點(diǎn)先出，而前面的點(diǎn)后出。這時可以采用氧化鋁作固定相。另外，收集的 試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就收到了三個樣品，wuwu 。如果都用小試管那工作量又太大。5 、最后的處理 柱分后的產(chǎn)品，由于使用了大量的溶劑，其中的雜質(zhì)也會累積到產(chǎn)品中，所以如果想送分析，最好用少量 的溶劑洗滌一下，因?yàn)榇蟛糠值碾s質(zhì)是溶在溶劑里的，一洗基本就沒了，必要時進(jìn)行重結(jié)晶。另外