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文檔簡介

1、組織因子途徑抑制物生理功能及臨床應用價值【摘要】組織因子途徑抑制物(tfpi)是組織因子、 vn因子和x因子的天然抑制物,在維持正常凝血中發(fā)揮關(guān)鍵 的生理作用。近年來,隨著對tfpi結(jié)構(gòu)與功能研究的深化, 發(fā)現(xiàn)它還能抗炎癥和誘導凋亡,并在動脈粥樣硬化、敗血癥 和惡性腫瘤等疾病的治療上有重要的應用價值。本文將對 tfpi的生理作用和臨床應用前景進行綜述?!娟P(guān)鍵詞】組織因子途徑抑制物;結(jié)構(gòu);功能;生理作用;臨床應用physiological functions and applications of tissue factor pathway inhibitorabstract tissue fa

2、ctor pathway inhibitor (tfpi), the inherent inhibitor of tissue factor (tf) and factors vii and x , is a key molecule that plays a regulatory role in the physiological coagulation .people,s knowledge on its structure and functions has been intensively enlarged in recent years .besides the functions

3、of anti-inflammation and introducing apoptosis, it was also found that tfpi could be served as medicine in treatin£ some diseases such as atherosclerosis, sepsis and malignancy. this paper is a review mainly on the physiological functions and applications of tfpi.【key words 】 tfpi; structure; f

4、unction; physiological effect; application組織因子途徑抑制物(tissue factor pathwayinhibitor, tfpi)是外源性凝血途徑的天然抑制物。該因 子早在20世紀初就被發(fā)現(xiàn),但直到上世紀80年代,人們才 對其展開深入系統(tǒng)的研究。1983年,sander等首先闡明了 tfpi抑制外源性凝血途徑的機制。1988年,wun等首次克隆 tfpi的cdna,并據(jù)此推斷出它的氨基酸組成和空間構(gòu)型, 將其隸屬于kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物家族。1990年后, 人們先后對tfpi的基因定位、表達調(diào)控、分子生物學特性、 基因工程表達、其他生理

5、學功能,以及一系列疾病的治療作 用進行了研究,獲得了許多重要進展。tfpi以其重要的生理 學意義和對重大疾病的治療價值,吸引著人們對它的進一步 關(guān)注。1 tfpi基因和蛋白的結(jié)構(gòu)特點1. 1 tfpi的基因結(jié)構(gòu)與定位tfpi基因全長約86kb,定位于2q312q32. 1,由9 個外顯子和8個內(nèi)含子組成。其中外顯子1和2編碼tfpi mrna的5'端非翻譯區(qū),外顯子3編碼信號肽及n末端,外 顯子4、6、8分別編碼tfpi的ki、k2和k3結(jié)構(gòu)域,外顯 子5和7編碼ki、k2和k3之間的兩段連接區(qū),外顯子9編 碼c末端和3端非翻譯區(qū)。由于剪切形式的不同,tfpi基 因在轉(zhuǎn)錄后形成4kb和

6、1. 6kb 2種mrna,后者缺乏外顯子 2 (約2. 6kb)o tfpi基因的上游調(diào)控區(qū)缺少tata盒和gata 盒,它的轉(zhuǎn)錄主要受gata元件的調(diào)控,轉(zhuǎn)錄因子gata-2與 tfpi表達呈明顯相關(guān)性lo1.2 tfpi的蛋白結(jié)構(gòu)tfpi是一種全長由276個氨基酸殘基組成的耐熱單 鏈糖蛋白,含ki、k2和k3三個kunitz結(jié)構(gòu)域,另外還包 括2個連接區(qū)以及一個富含酸性氨基酸的n末端和一個富含 堿性氨基酸的c末端。tfpi的空間結(jié)構(gòu)比較復雜,所含18 個半胱氨酸殘基構(gòu)成9對二硫鍵,參與維持其二級結(jié)構(gòu),此 外該蛋白還在117、167和228位的n原子上有糖基化修飾。 結(jié)構(gòu)域k1和k2是tf

7、pi發(fā)揮抗凝活性的關(guān)鍵部位,k3在該 作用中并非必需,但它的存在可以使tfpi更好地抑制凝 血。近年來有不少研究表明,k3和c末端可以和肝素、膜表 面糖蛋白及多糖結(jié)合2,另外該區(qū)域還與tfpi的抗炎作 用有關(guān)。糖基化修飾幾乎與tfpi生物活性無關(guān)。2 tfpi的生理功能生理條件下,tfpi主要由微血管內(nèi)皮細胞合成,大部 分錨著于內(nèi)皮細胞,少量以游離形式存在,或者與脂蛋白、 血小板結(jié)合后進入血流循環(huán)otfpi的恒定表達對于內(nèi)皮細胞 的抗凝血功能及維持血液的正常流動非常重要。經(jīng)典凝血理論將凝血途徑分為外源性凝血途徑和內(nèi) 源性凝血途徑,其中外源性凝血途徑是生理性止血的主要途 徑。血管內(nèi)皮細胞受損時,

8、內(nèi)皮下細胞表面的組織因子 (tissue factor, tf)暴露于血液,外源性凝血途徑立即 啟動。tf與血液中少量的fvu (fvlla)結(jié)合,形成fvha/tf 復合物,而后活化fx和少量fix,活化的fx (fxa)激活 凝血酶原變?yōu)槟?,從而引起凝血,少量flxa對fx的激 活則產(chǎn)生放大作用。但是,2004年genmin lu等人通過反 應動力學實驗發(fā)現(xiàn),生理條件下vda/tf活化的產(chǎn)物中, flxa的活性明顯超過fxa的活性,進而提出外源性凝血 途徑的早期是以fix活化為主,而fxa則更傾向于是 flxa的活化產(chǎn)物3。tfpi是外源性凝血途徑中主要的抑制因子,其抑制 作用是分兩步

9、實現(xiàn)的:首先,tfpi通過k2與活化的fx結(jié) 合,并競爭性地抑制其活性,該過程是一個ca2+非依賴的 可逆性過程;然后,fxa/tfpi復合物中的tfpi通過k1 與fvih/tf復合物中的fvda活性部位結(jié)合,從而實現(xiàn)對 fvda/tf復合物的抑制。fxa輕鏈中谷氨酸殘基上的y- 竣基與ca2+結(jié)合,并通過“鈣橋”結(jié)合于fxa/fvna/tf復 合物中tf附近的磷脂表面,使得fxa/tfpi與vua/tf 形成穩(wěn)固的fxa/tfpi/vha/tf四元復合物,該復合物可以 被單核細胞和內(nèi)皮細胞等吞噬清除。tfpi 和抗凝血酶一iii (anti-thrombin iii, at iii) 都能

10、與fxa結(jié)合并抑制后者的活性。atiii對fxa的抑 制是不可逆的。當外源性凝血途徑激活后,產(chǎn)生大量的 fxa, atin快速與fxa結(jié)合并顯著地抑制其活性3, 所形成的復合物最后被清除。tfpi與fxa的結(jié)合是一個 可逆過程,兩者結(jié)合后一部分fxa的活性受到抑制。更重 要的是,fxa/tfpi復合物能在外源性凝血途徑活化的起始 階段對vda/tf進行抑制,從而在根本上阻斷fx和fix 的大量活化,避免了凝血因子及atiii等抑制因子的大量消 耗。由此可見,tfpi在外源性凝血途徑的負反饋調(diào)節(jié)中起 著非常重要的作用。3 tfpi的抗炎功能感染性疾病患者常出現(xiàn)血液的高凝狀態(tài)。炎癥反應與 凝血反應

11、之間顯然存在著某些聯(lián)系。近年來發(fā)現(xiàn),細菌及其 釋放的內(nèi)毒素一方面刺激某些炎癥細胞產(chǎn)生大量的前炎癥 細胞因子,如ifn-丫、il-1b和tnf-a等,它們均能刺 激內(nèi)皮細胞和單核細胞高度表達tf;另一方面,細菌或內(nèi) 毒素也能直接刺激內(nèi)皮細胞和單核細胞表達tfo fxa和凝 血酶也能刺激激活的單核細胞和內(nèi)皮細胞,合成并釋放 il-6、il-8和其他炎癥反應因子,這些炎癥因子又通過自 分泌或旁分泌的形式,促使tf在這些細胞中高表達4,5。 可見炎癥與凝血是一種相互促進、相互惡化的關(guān)系。炎癥反應主要通過外源性凝血途徑引起血液高凝。 tfpi能從fxa和tf水平阻斷炎癥反應與凝血反應之間 的惡性循環(huán),同

12、時發(fā)揮抗凝抗炎的作用。動物實驗發(fā)現(xiàn),靜 脈注入外源性tfpi,可以降低血漿中il-6和il-8等炎 癥因子的水平,動物的存活率或存活時間都有所改善6。tfpi也具有直接的抗炎癥作用。脂多糖 (lipopolysaccharide, lps)進入體內(nèi)引起炎癥反應時需 要有脂多糖結(jié)合蛋白(lps binding protein, lbp)的存在。 lbp不僅介導lps與cd14結(jié)合,導致炎癥反應,而且還 能增加單核細胞及分葉細胞對lps的敏感性。tfpi可以干 擾lps與lbp的結(jié)合,或者通過其k3及c末端與lps 直接結(jié)合,競爭性抑制lps與lbp的結(jié)合7,最終發(fā)揮 抗炎作用。4 tfpi與細胞

13、凋亡和增殖tsutomu ilamuro首次發(fā)現(xiàn)tfpi可以誘導血管內(nèi)皮 細胞產(chǎn)生凋亡8o目前認為tfpi誘導凋亡的結(jié)構(gòu)主要集 中在c末端,與其抗凝作用無關(guān)。tfpi誘導凋亡可能與極 低密度脂蛋白(vldl)受體有關(guān),但僅有tfpi與vldl受 體結(jié)合并不足以啟動細胞凋亡,因此推測還有其他分子在起作用9o此外,有研究發(fā)現(xiàn)tfpi的c末端能抑制平滑 肌細胞的增殖10,其機制尚不清楚。tfpi誘導內(nèi)皮細胞 凋亡和抑制平滑肌細胞增殖對血管形成是一種負調(diào)節(jié),有可 能是其抑制腫瘤生長的機制之一。5 tfpi的應用價值 5. 1 tfpi與動脈粥樣硬化tf的暴露或髙表達與許多血栓性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

14、其中,對動脈粥樣硬化(atherosclerosis, as)的研究較多。在as患者增厚的內(nèi)膜、斑塊部位的間質(zhì)和細 胞都能檢測到tf的高表達,而且越靠近斑塊脂質(zhì)核心tf 表達水平越高。作為對tf升髙的一種代償性調(diào)節(jié),tfpi在as中表達水平也是升高的,它和tf同時出現(xiàn)在斑塊區(qū)內(nèi)皮細胞、壞死區(qū)周圍的巨噬細胞和平滑肌細胞中,但tfpi的數(shù)量遠遠達不到抑制tf的水平。一旦斑塊破裂,大量tf 露并激活外源性凝血途徑最終在局部形成血栓,是引起急性冠脈綜合征或腦梗死根本原因。臨床觀察發(fā)現(xiàn)tf與急 性心肌梗死和不穩(wěn)定性心絞痛有明顯的相關(guān)性11,因此 抑制tf活性對as及急性冠脈綜合征的防治有著重要的 意義。

15、badimon等通過離體實驗發(fā)現(xiàn),重組tfpi能顯著降 低血小板及纖維蛋白在斑塊破裂部位的沉積12,證實了 tfpi在治療as中的有效性,動物實驗也顯示出同樣的效果。除了容易形成血栓外,內(nèi)膜增生也是as發(fā)病過程中 的一個重要方面。內(nèi)膜過度增生所導致的遠端供血不足是不 穩(wěn)定性心絞痛發(fā)作的重要原因。pierre等人將tfpi基因 局部轉(zhuǎn)染到經(jīng)球囊損傷的as血管,發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增生受到明顯 抑制13。因此,tfpi的抗凝及抑制內(nèi)膜增生的作用可能 在as和冠脈綜合征的治療中發(fā)揮作用。5.2 tfpi與深靜脈血栓手術(shù)過程中對組織的損傷使大量的tf暴露于血液,容易形成高凝狀態(tài)或急性血栓。dahm等發(fā)現(xiàn)游離型和總

16、tfpi的減少是深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis,dvt)的危險因素14。tf與tfpi之間的失衡,即tfpi對外源性凝血的調(diào)控不足是dvt發(fā)生的重要原因。重組人tfpi1-161 (即缺乏k3和c末端的tfpi)在治療兔頸靜脈血 栓時,有著與肝素同樣的效力,但出血等不良反應明顯減少 15o因此,tfpi有可能取代肝素應用于術(shù)后dvt的預防和治療。5.3 tfpi與感染性疾病血液髙凝狀態(tài)與炎癥反應是感染性疾病的兩大病理特征,常導致病情惡化甚至引發(fā)多功能臟器衰竭,從而直接 威脅患者的生命,因此抗凝抗炎在嚴重感染性疾病的治療中 越來越受到人們的重視。動物實驗發(fā)現(xiàn),tfp

17、i能夠顯著改 善嚴重感染動物的癥狀并提高其存活率6, 16。國外對重組人 tfpi (recombinant tfpi, rtfpi)治 療敗血癥(sepsis)進行了 一系列的臨床研究。i期臨床試 驗證實健康志愿者在接受rtfpi注射后表現(xiàn)出很好的耐受 性,ii期臨床試驗中治療組28天死亡率相對安慰劑組降低 約20%,同時也顯示出一定的抗炎作用。盡管iii期臨床試驗 的結(jié)果不如ii期理想,但仍發(fā)現(xiàn)rtfpi能顯著降低輕度敗 血癥患者28天的死亡率(12%vs22.9%)。目前對rtfpi治 療敗血癥的iii期臨床試驗方案的設計存在爭議,因此rtfpi 在敗血癥治療中的作用有待于進一步研究17

18、。社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia, cap)是一種多發(fā)性感染性疾病,盡管使用了足量的抗生素, 但病情嚴重的患者死亡率仍然很高。tf在肺部的高表達與 高凝狀態(tài)及炎癥反應密切相關(guān),因此tfpi有望成為控制嚴 重肺炎的藥物。目前,由chiron公司推出的rtfpi治療 嚴重社區(qū)獲得性肺炎的iii期臨床試驗正在進行當中18。5.4 tfpi與惡性腫瘤許多惡性腫瘤,如結(jié)腸癌、癌、肺癌、乳腺癌、胰癌等,都伴有不同程度的凝血功能紊亂,該現(xiàn)象稱為特魯索綜合征(trousseau syndrome),發(fā)生機制尚不清楚。研究 發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細胞表面都有tf的髙表達,因此有學

19、者推測 可能是腫瘤細胞膜表面的tf脫落到血液中,引起患者出現(xiàn) 高凝狀態(tài)。tf不僅與惡性腫瘤的高凝有關(guān),它還可以作為 膜表面的受體分子與其配體fviia結(jié)合,引起細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn) 導,從而導致腫瘤細胞的行為發(fā)生改變19。有研究表明tf 可以促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成,而這種效應與凝血作 用無關(guān)。tfpi同樣也可以抑制由tf/fvba引起的非凝血效 應。todd給接種了黑色素瘤細胞的老鼠注入人tfpi,發(fā)現(xiàn) 腫瘤生長、血管生成受到明顯抑制20。此外,amirkhosravi 用老鼠動物模型證實皮下注射鼠源tfpi可以顯著抑制黑 色素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移;將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 tfpi基因的黑色素瘤細 胞注入老鼠后,

20、其侵襲性明顯下降21。隨著tf和tfpi 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機制日見闡明,tfpi有可能在將來 的腫瘤治療中發(fā)揮一定的作用。5.5 tfpi與其他疾病有學者發(fā)現(xiàn)特異性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, ipf)患者的支氣管肺泡灌洗液中存 在大量的tf和tfpi,而且它們的水平與ipf病情呈正相關(guān)。 免疫組織化學顯示tf和tfpi在增生的立方形柱狀上皮細胞 上有高表達,但它們之間的不平衡促使局部形成高凝環(huán)境, 從而導致纖維蛋白在肺間質(zhì)的沉積22。成人呼吸窘迫綜 合征(adult respiratory dis tress syndrome, ards)是

21、 另一種與纖維蛋白在肺部沉積相關(guān)的疾病,研究發(fā)現(xiàn)tf在 該疾病中同樣有高表達,而tfpi水平正?;蜉p度升高,tfpi 對tf的調(diào)控不足可能與ards的發(fā)展有關(guān)23。另外,還 發(fā)現(xiàn)tfpi在腎病綜合征、1型糖尿病早期患者的血漿中有 較高水平;胎盤早剝的子宮肌層、胎盤24也有較高水平 的tf及tfpi表達;系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞氏病血漿中游離 型和總tfpi均降低。tf與tfpi水平的變化可能為這些疾 病的診斷和治療提供一些有用的依據(jù)。6展望在對tfpi生理學基礎(chǔ)及分子生物學特性有了深度 認識的今天,人們逐步將研究的重點轉(zhuǎn)移到該分子與臨床疾 病的關(guān)系上。許多疾病與tfpi表達降低或缺少有關(guān),加入 外

22、源性tfpi可以不同程度地改善疾病狀況。其中,在血栓 性疾病、感染性疾病治療和血管再狹窄的預防等方面已有大 量的動物實驗甚至臨床試驗,因此tfpi也正在向臨床新藥 的方向快速發(fā)展。盡管目前人們已經(jīng)可以通過基因工程的方 法獲得大量重組的人tfpi,但是過短的半衰期成為臨床應用 的瓶頸。近期,我們實驗室研制的重組長效tfpi已獲成功 25,該突變體的半衰期為野生型的4倍,有望為tfpi的 臨床應用提供更加廣闊的空間?!緟⒖嘉墨I】bajaj ms, tyson dr, steer sa, et al. role of gata motifs in tissue factor pathway inhi

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