RNA提取試驗操作步驟注意事項及問題指引

1、RNA 提取實驗操作步驟、注意事項及問題指南準備試劑：氯仿，異丙醇，75%乙醇，無 RNase的水或0.5% SDS （溶液均需用 DEPC處理 過的水配制） 。操作步驟：1. 勻漿處理a. 植物組織 :以葉片 RNA 提取為例 .取新鮮葉片在液氮中充分研磨或?qū)⑷~片剪碎后直接在 Trizol 中研磨 , 研磨要迅速 ,最好不要超過 1min. ，大約 100mg 葉片使用 1 ml Trizol.b. 動物組織 :以鼠肝臟RNA提取為例.取新鮮或-70 C凍存組織，每50-100mg組織加1ml Trizol,用勻漿儀進 行勻漿處理 .樣品體積一般不要超過 Trizol 體積的 10%.c.

2、單層培養(yǎng)細胞 .直接在培養(yǎng)板中加入 Trizol裂解細胞，每10cm2面積加1ml Trizol.用取樣器吹打幾次.注意 :Trizol 加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定 ,不是由細胞數(shù)決定 .如果 Trizol 加量不足 ,可能導致提取 的 RNA 中有 DNA 污染 .d. 細胞懸液：離心取細胞，每5-10 X 106動物、植物和酵母細胞或每 107細菌細胞加1ml Trizol。加Trizol 前不要洗滌細胞，以免降解 mRNA 。一些酵母和細菌細胞可能需要勻漿儀處理。e. 血液處理：直接取新鮮的血液 ,加入 3 倍體積紅細胞裂解液，混勻后室溫放置 10min， 10 000rpm 離心 1min

3、。棄上清，收集白細胞沉淀。每1ml血液收集的白細胞沉淀中加入1ml Trizol。2. 將勻漿樣品在15-30 C放置5mim，使得核酸蛋白復合物完全分離。3. 可選步驟:4 C 10 000rpm離心10min,取上清。 如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)部分等，可離心去除。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有 RNA。處理脂肪組織樣品時，上層是大量油脂,應除去。取澄清的勻漿溶液進行下一步操作。4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。如不能渦旋混勻,可手動顛倒混勻 2min 代替。5. 4 C 1

4、0 000rpm離心10-15min，樣品會分成三層：紅色的有機相，中間層和上層無色的 水相，RNA主要在水相中，把水相（約600ul，約為所用Trizol試劑的60%）轉(zhuǎn)移到新管中。（如要分離蛋白質(zhì)和 DNA，可保留黃色的有機相）6. 在得到的水相溶液中加入等體積的異丙醇，混勻，-20 C放置20-30min。植物或動物組織 RNA 提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,導致電泳檢測時看不到RNA。可以按以下步驟操作減輕污染：在上清中加入1/2體積的異丙醇，1/2體積的RNA助沉劑,然后進行以下操作。7. 4 °C 10 000rpm 離心 10min，去上清。離心前 RNA 沉淀

5、經(jīng)常是看不見的,離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。8. 加入 1ml 75% 乙醇（ DEPC 水處理過的水配制）洗滌沉淀。每使用 1ml Trizol 至少加 1ml 乙醇。9. 4 C 10 000rpm 離心 2min ,棄上清；短暫快速離心,用移液器小心吸棄上清,注意不要 吸棄沉淀。10. 室溫放置晾干（不要晾得過干, RNA 完全干燥后會很難溶解,大約晾干 2-3min 左右即 可）。加入適量DEPC水（根據(jù)實驗需要， 可加30-100UI水）或0.5%SDS,用槍頭吸打幾次， 充分溶解RNA。如RNA用于酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100 %的去離子甲 酰胺溶解，-70

6、C保存。注意事項：1. 從少量樣品中提取 RNA（1-10mg 組織或 102-104 細胞 ） ：加800ul Trizol，樣品裂解后加氯仿，分層，沉淀 RNA前，力口 5-10ug RNase-free糖原，糖原 會與 RNA 一同沉淀出來， 糖原濃度不高于 4mg/ml 時不會影響反轉(zhuǎn)錄 cDNA 第一鏈的合成， 也不影響 PCR 反應。2. 勻漿后，加氯仿前，樣品可在 -70 C放置一個月以上：RNA沉淀可以保存在 75%酒精中，2-8 C一個星期或-20 C一年以上。如果要長期保存， RNA可以溶解于100%去離子甲酰胺中，-70 C長期保存。預防RNase污染，應注意以下幾個方面

7、：1. 經(jīng)常更換新手套。因為皮膚經(jīng)常帶有細菌，可能導致RNase污染。2. 使用無 RNase 的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。3. RNA在Trizol試劑中不會被 RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150 C烘烤4h,塑料器皿可在 0.5M NaOH中浸泡10min, 然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。4. 配制溶液應使用無 RNase 的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC 至中濃度0.1%（v/v），放置過夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。不同組織或細胞 RNA 提取預期得率植物葉片 100-2

8、00ug/g 葉片動物組織 200-400ug/g 肝臟組織動植物培養(yǎng)細胞 5-10ug/106 細胞大腸桿菌 2-10ug/mlDH5 a過夜菌 血液 3-5ug/ml 人全血問題指南：低得率A. 樣品裂解或勻漿處理不徹底B. 最后得到的 RNA 沉淀未完全溶解A260/A280<1.65A. 檢測吸光度時，RNA樣品不是溶于TE，而是溶于水。低離子濃度和低pH條件下A280會較高。B. 樣品勻漿時加的試劑量太少。C. 勻漿后樣品未在室溫放置 5min。D. 水相中混有有機相。E. 最后得到的 RNA 沉淀未完全溶解。RNA 降解A. 組織取出后沒有馬上處理或冷凍。B. 樣品或提取的

9、RNA沉淀保存于-5-20 C,未在-60-70 C保存。C. 細胞在胰蛋白酶處理時被破壞。D. 溶液或離心管未經(jīng) RNase 去除處理。E. 電泳時使用的甲酰胺 pH低于3.5。DNA 污染A. 樣品勻漿時加的試劑體積太少。B. 樣品中含有組織溶劑（如乙醇， DMSO 等），強緩沖液或堿性溶液。 蛋白和多糖污染A. 樣品中蛋白、多糖含量高。B. 樣品量太大。C. 水相中混有有機相。D. 第 6 步中加入 RNA 助沉劑可以幫助去除這些污染。RNA 提取一般步驟總結(jié)RNA 提取原理：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機溶劑抽提RNA ，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于 RN

10、A 酶無處不在，隨時可能將 RNA 降解，所以實驗中有 很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。RNA 提取的一般步驟所有 RNA 的提取過程中都有五個關鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋 白復合體變性；對內(nèi)源 RNA 酶的有效抑制；有效地將 RNA 從 DNA 和蛋白混合物中分離； 對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關鍵的是抑制RNA酶活 性。 RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA 與蛋白質(zhì)進入有機相而 RNA 留在水相。第一種提取方法將導致小分子量RNA 的丟失，目前該方法

11、的使用頻率已很低。實驗步驟：破碎組織t分離 RNAt沉淀 RNA t洗滌 RNA宀融解 RNA宀保存 RNA。1、 破碎組織和滅活 RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋 白酶K等破碎組織，加入 3 -ME可以抑制RNA酶活性。2、分離 RNA 一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA 一般分布于上層，與蛋白層分開。3、沉淀RNA 一般用乙醇、3M NaAc (pH-5.2 )或異丙醇。4、 洗滌 RNA 使用 70乙醇洗滌，有時，為避免RNA 被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后 可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。5、融解

12、RNA 一般使用 TE。6、 保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含 RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的 RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的 RNA ，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量 RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存 RNA 樣品的穩(wěn)定性，可以將 RNA 溶解在去離子的甲酰 胺中，存于-70 C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用 RN

13、A 時，可以使用下列方法沉淀 RNA： 加入NaAc至0.3M , 12,000 X g離心5分鐘。氯化鋰法提取總 RNA ：本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制 RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀 RNA，其特別適 合于從大量樣品中提取少量組織 RNA,具有快速簡潔的長處， 但也存在少量 DNA的污染及 RNA 得率不高 ,小 RNA 丟失的缺陷。試驗試劑：1、 氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰 126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L,過濾滅菌】2、懸浮液【 10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】試驗步驟：1、 對于大量組織或細胞，則每克

14、組織或細胞加入510ml 氯化鋰尿素溶液，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細胞(107個細胞/ml),則每克組織或細胞加入 0.5ml氯化鋰尿 素溶液手工勻槳，并轉(zhuǎn)移至 Eppendof 管中。2、 勻槳液在0 4C放置4小時后，12000g離心30分鐘。3、 取沉淀，加入原勻槳液 1/2體積的氯化鋰尿素溶液，重復步驟2。4、 沉淀用原勻槳液 1/2 體積的氯化鋰尿素溶液復溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室 溫放置 1530 分鐘并不時搖動混勻， 4000g 離心 5 分鐘。5、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，20C放置1 小時， 5000g 離心。6

15、、70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7、RNA溶解液溶解沉淀，得 RNA，分裝，于70C保存。蛋白酶熱酚法本方法適合于病毒 RNA 的提取 試驗試劑：1、蛋白酶K (終濃度50ug/ml)2、2X緩沖液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2M naCL 試驗步驟：1、提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶 K,37 C 40-50分鐘。2、 加入等體積65C預熱的酚溶液，輕徭，在65C保溫5分鐘后再輕徭。3、離心，取上清，氯仿抽提一次。4、 取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，20C放置1 小時，5000g 離心（10000g,10mi

16、n）。5、70乙醇洗沉淀一次。真空干燥。6、 RNA溶解液溶解沉淀，得 RNA，分裝，于70C保存。RNA 提取實驗經(jīng)驗心得總結(jié)一：實驗的準備 實驗之前必須先準備好相關的試劑和實驗用品試劑：1 .TRIZOL, 步法提取 RNA 用的，最好是 INVITROGENE 的，10 0 ml850RMB, 不過也有國產(chǎn)的， 便宜些 這個試劑是非常關鍵的， 也是不能省的， 經(jīng)常有很多朋友不想買 這個， 嫌貴， 個人感覺是非買不可， 不然用其他辦法自己配的話也不便宜， 而且配的過程中 很毒2異丙醇，無水乙醇，三氯甲烷（氯仿），DEPC3 .逆轉(zhuǎn)錄酶等一般如果做的次數(shù)不是很多的話可以買試劑盒的，里面什么都

17、有，PROMEGA的也不是很貴， 記得是30次的600多. 但是如果實驗室做得比較多的話， 還是 自己分開買的比較好. MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶個人覺得PROMEGA的最好，而且不貴，其他公司我用得也不多， 反正一直用PROMEGA, 還有DNTP, oligod（T） n,RNA 酶抑制 劑，除了逆轉(zhuǎn)錄酶買 PROMEGA的，其他的幾樣我都是買的TAKARA的，因為promega的其他幾樣都很貴，這樣配起來用一點也不比原裝的差.當然實驗室比較富裕的也 可以買好的， 不過話說回來， 咱們花的經(jīng)費大多數(shù)還是民脂民膏， 這些不太關鍵的地方省著 點比較好（我是不是太羅嗦了！ ）4 .用具.各種大小的槍頭和E

18、P管。由于RNA提取過程中對于 RNA酶是非常敏感的，所以槍頭和管子都要做滅酶處理。滅酶的正常程序是用加入 DEPC 的水泡槍頭和管子，過夜。 DEPC 的濃度是 0.1%。 DEPC 是強致癌物，做的時候要戴手套口罩，作好防護措施。泡好后再高 壓，烘干。滅酶除了用 DEPC 處理外，還可以用氯仿泡槍頭和管子，不用泡過夜，1-2小時就行，也沒有 DEPC 那么恐怖，泡后也是高壓烘干。5. 水。實驗用的水也是很關鍵的，必須用 DEPC 處理滅過酶的水才可以。具體做法是將去 離子水中加入 0.1%DEPC ，搖過夜，之后再高壓。高壓這步是不能省的，因為必須用高壓把 殘留的 DEPC 分解掉，不然會

19、影響后續(xù)的反應。二實驗步驟TRIZOL 提取 RNA 的原理就是利用變性劑將細胞裂解，釋放出蛋白質(zhì)，DNA ，RNA ，之后根據(jù)它們在不同 PH 值和不同極性溶劑中溶解度不一樣。而把 RNA 提取出來。詳細的原理 可以自己查一查，在這里不做贅述。1. 樣品處理對于組織樣品， 書上說的辦法是勻漿后加 TRIZOL ，但是我的經(jīng)驗是用勻漿器勻漿的話很多 組織都是沾在勻漿器的壁上了， 所以我一般都是用小剪刀剪， 剪的時候要耐心， 剪得很碎才 行。一般樣品其始量大概黃豆那么大一坨就行了， 加 1mlTRIZOL ，然后在 EP 管中剪碎。 樣 品盡量用新鮮的， 不是新鮮的泡在 PBS 中一段時間也行。

20、 樣品泡在 TRIZOL 里面后 RNA 就 基本不會降解，這一步可以放在冰箱里面凍起來，可以保存一段時間2. RNA 提取。往第一步中的剪碎的樣品和 TRIZOL 中加入 0.2ml 的氯仿，之后劇烈搖晃。震蕩，此時整個 液體的顏色應該變成一種粉紅色的。之后靜置 10 分鐘，靜置后可以看到液體分層了。12000 轉(zhuǎn) 4 度離心 10 分鐘，可以看見液體分層很明顯，最上面的是無色的水相， RNA 就溶解在里面，中間一層是白色的固體，這層是蛋白質(zhì)和 DNA 形成的復合體，下面是紅色 的酚相。 把上層水相吸到另外一個管子里面， 注意不要把下面的兩層吸出來了， 寧愿少一下 沒關系。往水相液體中加入

21、500ul 的無水乙醇或者是異丙醇， 上下顛倒混勻， 此時如果 RNA 量多 的話可以看見一些油一樣的東西， 反正就是感覺怪怪的那種， 不過一般都不會出現(xiàn)明顯的沉 淀的。之后 12000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘，離心之后就可以看見管底有點半透明的東西了，那就是 我們要 RNA 。倒掉無水乙醇或者異丙醇， 加入 500ul 用 DEPC 處理水配制的 70%乙醇， 以洗滌 RNA， 加入后把管子敲一敲，盡量使 RNA 沉淀飄起來。之后在 7500 轉(zhuǎn)離心 8 分鐘，到掉乙醇， 倒扣在干凈的吸水紙上面，空氣室溫干燥，時間可以稍長點， 40 分鐘到 1 小時，以看不見 明顯的液滴為準。干后用20ul或者30UIDEPC水溶解RNA , 50度保溫1小時。之后得