db3t455—2019動(dòng)物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅殘留的檢測方法

1、db33-t 455 2019動(dòng)物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅殘留的檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)由嘉興市衛(wèi)生監(jiān)督所提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由嘉興市衛(wèi)生監(jiān)督所、浙江省疾病預(yù)防控制中心、浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心、嘉興市疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳小龍、吳平谷、宣士榮、葛志堅(jiān)、鄒忠明、汪剛、王明龍、吳新民。動(dòng)物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅殘留的檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以酶聯(lián)免疫吸附ELISA法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用GC/MS法測定動(dòng)物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅的方法，規(guī)定氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法為仲裁法。本方法適用于動(dòng)物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅殘留量的測定與仲裁。2規(guī)范性引用文件以下文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡

2、是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單不包括勘誤的內(nèi)容或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。DB33/T307-2001可食性動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅殘留量的檢測方法DB33/T308-2001飼料中鹽酸克倫特羅含量的檢測方法DB33/T309-2001動(dòng)物尿液中鹽酸克倫特羅殘留量的檢測方法3酶聯(lián)免疫吸附法3.1 原理利用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，將鹽酸克倫特羅特異性抗體（羊抗兔igG）包被于聚苯乙烯微量反應(yīng)板中，加入毛發(fā)提取液、鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)記物、鹽酸克倫特羅抗體于微孔中，使毛發(fā)提取液

3、未知抗原和酶標(biāo)記物中的鹽酸克倫特羅抗原抗原與抗體進(jìn)行免疫競爭反應(yīng)，未反應(yīng)的酶記標(biāo)物在洗 滌中被清除，結(jié)合了的酶可以由顯色物顯示出來。用目測法或酶標(biāo)法來判斷。顯色的強(qiáng)弱與樣品中的鹽酸克倫特羅濃度成反比。3.2 試劑和材料以下所用的試劑和水，除特別注明者外均為分析純試劑，水為重蒸水。3.2.1 鹽酸克倫特羅固相酶聯(lián)免疫試劑盒德國 r-Biopharm公司或類似產(chǎn)品。3.2.1.1 預(yù)包被微孔條。3.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品6 瓶X 300 卩 L/ 瓶，濃度分別為 0ppt、100ppt、300ppt、900ppt、2700ppt、8100ppt。3.2.1.3 鹽酸克倫特羅酶標(biāo)記物。3.2.1.4 鹽

4、酸克倫特羅抗體。3.2.1.5 基質(zhì)液。321.6 終止液。321.7 緩沖液。3.2.2 1%吐溫-80、體積分?jǐn)?shù)為3聽醇/乙酸乙酯、體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇/乙酸乙酯、乙酸乙酯、50%鹽酸、1mol/L氫氧化鈉、飽和氯化鈉、體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇/乙酸乙酯。3.2.3 鹽酸克倫特羅 SLH凈化柱1000mg/5mL, SLH小柱為商品名，給出這一信息是為了給本行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)的使用者提供方便，而不是標(biāo)準(zhǔn)主管部門對(duì)這一產(chǎn)品的認(rèn)可或同等效果的凈化柱。3.3 設(shè)備與器材3.3.1 酶標(biāo)儀。3.3.2 洗板機(jī)。3.3.3 離心機(jī)3000r/min-4000r/min。3.3.4 超聲清洗儀。3.3.5 振蕩器。

5、3.3.6 水浴鍋。3.3.7 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。3.4 樣品處理3.4.1 清洗：取毛發(fā)加1%吐溫-80溶液在超聲清洗儀中洗滌20min，然后用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干；將毛發(fā)在 50C干燥2h，放在干燥器中待測。3.4.2 水解：將毛發(fā)剪碎混合均勻，準(zhǔn)確稱取0.1 g,加入1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL,在80C水浴中保溫1 h后冷卻。3.4.3 萃?。涸谒庖褐屑? mL飽和氯化鈉溶液，用 50%鹽酸調(diào)節(jié)PH至10左右，加5 mL乙酸乙酯 振蕩，離心分出乙酸乙酯相，乙酸乙酯相用氮?dú)獯蹈伞?.4.4 凈化：加2m L體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇/乙酸乙酯溶液溶解剩余物，移到預(yù)先用體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇/

6、乙酸乙酯溶液淋洗的鹽酸克倫特羅SLH凈化柱上，然后用5 mL體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脫除雜，最后用10mL體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脫，收集該洗脫液，用氮?dú)獯蹈伞Ｓ盟?mL溶解剩余物，待測。3.5 測定或參考類似產(chǎn)品說明書將試劑盒各組分取出，平衡至室溫(20 C -25 C )。3.5.1 以1： 11的比例吸取鹽酸克倫特羅抗體加入到緩沖液中，待用。3.5.2 以1： 11的比例吸取鹽酸克倫特羅酶標(biāo)記物加入到緩沖液中，待用。3.5.3 每孔加入已稀釋鹽酸克倫特羅抗體100卩L, 15min后洗板。3.5.4 分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品(標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩孔平行試驗(yàn) )各20卩L

7、。3.5.5 每孔加入已稀釋鹽酸克倫特羅酶標(biāo)記物100卩L, 30min后洗板。3.5.6 加入100卩L基質(zhì)液避光顯色 15min，加入終止液 100卩L。3.5.7 酶標(biāo)儀450nm測定。3.6 結(jié)果計(jì)算3.6.1 計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品平均吸光度值。3.6.2 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品平均吸光度值除以 0ppt的吸光度值再乘以100。以標(biāo)準(zhǔn)品的百分比形式的吸 光度值為縱座標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫座標(biāo)， 繪成一個(gè)半對(duì)數(shù)座標(biāo)系統(tǒng)曲線圖， 相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的相 對(duì)濃度卩g/Kg丨可以以樣品平均吸光度值從曲線上查出，乘以樣品稀釋倍數(shù)，即為其實(shí)際濃度。3.7 檢測限本方法的檢測限:8.0卩g/Kg。4氣相色譜

8、-質(zhì)譜聯(lián)用法仲裁法4.1 原理毛發(fā)樣品經(jīng)過堿水解，然后用乙酸乙酯提取；提取液濃縮后經(jīng)SLH柱凈化，凈化洗脫液經(jīng)過雙三甲基甲硅烷三氟乙酰胺BSTFA +1% $丨三甲基氯硅烷TMCS衍生，然后用GC/MS!測定。4.2 試劑和材料 以下所用的試劑和水，除特別注明者外均為分析純試劑，水為重蒸水。4.2.1 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品。4.2.2 1 %吐溫-80 、體積分?jǐn)?shù)為 3%乙醇/乙酸乙酯、體積分?jǐn)?shù)為 5%乙醇/乙酸乙酯、 50%鹽酸、 1mol/L氫氧化鈉、飽和氯化鈉、體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇/乙酸乙酯、乙醇、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、鹽酸、氫氧化鈉、濃氨水、無水硫酸鈉。4.2.3 BSTFA+1%$ T

9、MCS。424 SLH凈化柱1000mg/5mL或同等效果的凈化柱。4.2.5 美托洛爾metoprolol丨內(nèi)標(biāo)：使用時(shí)用甲醇配成10卩g/mL溶液。4.2.6 4% $氨化甲醇：取 4mL濃氨水，用甲醇定容至 100mL。4.2.7 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液100mg/L：稱取11.3mg鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品于 100mL容量瓶中，用4%氨化甲醇溶解并定容至刻度，存放于4 C冰箱中備用。4.3 設(shè)備與器材4.3.1 氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用儀。4.3.2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。4.3.3 超聲清洗儀。4.4 實(shí)驗(yàn)條件4.4.1 色譜條件色譜柱：HP-5MS5苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱(30mX 0.2

10、5mmX 0.25卩m);進(jìn)樣口溫度300 C,柱溫程序：初溫120 C,保持3mi n,然后以10 C/min升至230C，保持10min, 再以20C/ min升至270 C保持10min。載氣為高純氦氣 99.999%,流速 0.9mL/min ,不分流進(jìn)樣。4.4.2 質(zhì)譜條件EI源，源溫230 C；電子能量70eV;接口溫度280C；電子倍增器電壓1388V;質(zhì)量掃描范圍35U350U;選擇離子監(jiān)測方式SIM；鹽酸克倫特羅監(jiān)測離子 m/z： 86、243、262、333美托洛爾監(jiān)測離 子 m/z： 72。溶劑延遲： 5min 。4.5 樣品處理4.5.1 取毛發(fā)加1%吐溫-80溶液在

11、超聲清洗儀中洗滌 20min，然后用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干；將毛發(fā)在50C干燥2小時(shí)，放在干燥器中待測。將毛發(fā)剪碎混合均勻，準(zhǔn)確稱取0.2g-1.0g ，加入1mol/L 氫氧化鈉溶液2mL,在80C水浴中保溫1h后冷卻。在水解液中加 1mL飽和氯化鈉溶液，用 50%鹽酸調(diào) 節(jié)PH至10左右，然后加5mL乙酸乙酯振蕩，離心分出乙酸乙酯相，乙酸乙酯相過無水硫酸鈉，用氮?dú)獯蹈伞＜?mL體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇/乙酸乙酯溶液溶解剩余物，移到預(yù)先用體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇/乙酸乙酯溶液淋洗的SLH凈化柱上，然后用 5mL體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脫除雜，最后用 10mL體積 分?jǐn)?shù)為50%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脫，收集該洗脫液，加美托洛爾內(nèi)標(biāo)20卩L,用氮?dú)獯蹈伞?.5.2 蒸發(fā)剩余物加0.1mLBSTFA+1 $TMCS加蓋于旋渦混合器上震蕩，在80C烘箱中加熱1h,然后用氮?dú)獯蹈?，?0.1mL甲苯溶解。同時(shí)取 20卩L0.5卩g/mL克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作液，加美托洛爾內(nèi)標(biāo)20卩L,吹干后同時(shí)進(jìn)行衍生化。取1.0卩L甲苯溶液進(jìn)行 GC/MS分析。4.6 測定定性采用保留時(shí)間、 標(biāo)準(zhǔn)鹽酸克倫特羅棒圖對(duì)照進(jìn)行 NIST98 圖庫檢索。