綿羊肺炎支原體RPA檢測(cè)技術(shù)的建立

1、綿羊肺炎支原體RPA檢測(cè)技術(shù)的建立摘要：【目的】建立一種快速簡(jiǎn)便檢測(cè)綿羊肺炎支原體Mycoplasmaovipneumoniae，Mo的方法?！痉椒ā扛鶕?jù)Mo膜蛋白P80基因序列，利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)并篩選出特異性擴(kuò)增引物，通過(guò)條件優(yōu)化建立檢測(cè)Mo的RPA方法?！窘Y(jié)果】該方法可特異性擴(kuò)增Mo，對(duì)其他羊常見(jiàn)病原無(wú)特異性擴(kuò)增，對(duì)Mo核酸的檢測(cè)靈敏度為70fg·L-1，與常規(guī)PCR敏感性一致。批內(nèi)和批間結(jié)果顯示Mo陽(yáng)性樣品均能擴(kuò)增條帶，而陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明重復(fù)性好。對(duì)186份臨床樣品應(yīng)用建立的RPA方法和常規(guī)PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其中40份肺臟樣品進(jìn)行支原體的別離鑒定，結(jié)果顯

2、示別離鑒定出的13份Mo陽(yáng)性樣品及常規(guī)PCR法檢測(cè)出的95份陽(yáng)性樣品經(jīng)RPA檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性?！窘Y(jié)論】建立的MoRPA方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為Mo的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查的一項(xiàng)候選技術(shù)。關(guān)鍵詞：綿羊肺炎支原體;重組聚合酶擴(kuò)增;等溫?cái)U(kuò)增中圖分類號(hào)：S852.62文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384202104-416-06Abstract：【Objective】TodeveloparapiddetectingmethodforMycoplasmaovipneumoniaeMo.【Method】BasedontheP80genesequence，specificprimerswere

3、designedusingOligo7software.ConditionsoftherecombinasepolymeraseamplificationRPAmethodwereoptimizedfortheapplication.【Result】ThenewassaydetectedP80geneinMospecifically，notanyothercommonpathogensofsheepandgoats.Thedetectionsensitivitywas70fg·L-1，whichwasthesameasprovidedbyconventionalPCR.Theinte

4、r-andintra-batchtestsshowedthatthemodifiedmethodcouldamplifythebandsonMo-positivesamples，notonMo-negativespecimens，indicatinganacceptablerepeatabilityofthemethodology.Furthermore，theRPAassayandconventionalPCRmethodsweresimultaneouslyusedon186clinicsamples，aswellastheMycoplasmaisolationandidentificat

5、ionon40lungsamples，toshowthattheRPAassaypositivelyidentifiedall13Mo-positivesamplesdetectedbyMycoplasmaisolationandidentificationand95positivesamplesdetectedbytheconventionalPCR.【Conclusion】ThenewlydevelopedRPAmethodhaddesirablespecificityandrepeatabilityonModetection.Itcouldbeappliedforrapiddetecti

6、ngandepidemiologicalstudiesonMo.Keywords：Mycoplasmaovipneumoniae;recombinasepolymeraseamplification;isothermalamplification0引言【研究意義】綿羊肺炎支原體Mycoplasmaovipneumoniae，Mo屬于軟膜體綱Mollicutes，支原體目Mycoplasmatales，支原體科Mycoplasmaceae，支原體屬M(fèi)ycoplasma，已被確認(rèn)為引起綿羊和山羊支原體性肺炎Mycoplasmapneumoniaofgoatsandsheep，MPGS的主要病原之一

7、1-4。Mo的臨床病癥表現(xiàn)為氣喘、高熱、咳嗽、漸進(jìn)性消瘦和肺間質(zhì)增生性炎癥5-7，該病發(fā)病率為20%30%，在急性發(fā)病過(guò)程中，病死率可達(dá)30%50%8-9。近年來(lái)，隨著養(yǎng)羊業(yè)的開(kāi)展，該病在國(guó)內(nèi)各省市均有流行發(fā)生的報(bào)道，給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為制約養(yǎng)羊業(yè)健康開(kāi)展的重要疫病之一10-12。因此，建立一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于該病的防控與及時(shí)治療具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PCR技術(shù)在檢測(cè)病原體的方法中，被認(rèn)為優(yōu)于別離培養(yǎng)法、免疫熒光檢測(cè)法和ELISA法等，以其能夠檢測(cè)微量的病原DNA而被作為診斷多種疫病的常用方法13。然而PCR反應(yīng)需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備，很多基層單位不具備檢測(cè)條件。重

8、組聚合酶擴(kuò)增RecombinasePolymeraseAmplification，RPA技術(shù)英國(guó)公司TwistDxInc研發(fā)主要依賴于3種酶：能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶，模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制，在常溫反應(yīng)0.5h左右即可完成對(duì)目的片段的擴(kuò)增，操作簡(jiǎn)單，尤其適用于基層使用14。目前，RPA技術(shù)已經(jīng)在病毒、支原體、衣原體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等病原檢測(cè)方面得到了廣泛開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，如口蹄疫病毒15、非洲豬瘟16、山羊支原體山羊亞種17、動(dòng)物衣原體18、結(jié)核分枝桿菌19、瘧原蟲(chóng)20等。【本研究切入點(diǎn)】迄今為止，尚未見(jiàn)RPA技術(shù)應(yīng)用于Mo的檢測(cè)。P80基因編碼的膜蛋白在免疫特性方面雖

9、未有深入研究，但已應(yīng)用于遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，且以該基因?yàn)榘谢蚪⒌脑\斷方法已有常規(guī)PCR和熒光定量PCR方法9，21?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究根據(jù)Mo膜蛋白P80基因序列，利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)并篩選出特異性的擴(kuò)增引物，建立Mo快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，為基層工作者在Mo臨床樣品的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供一種新的技術(shù)支持。1材料與方法1.1菌株及臨床樣品山羊支原體山羊肺炎亞種Mycoplasmacapricolumsubsp.capripenumoniae，MccpF38株、綿羊肺炎支原體Mycoplasmaovipenumoniae，MoY98株、山羊支原體山羊亞種Mycoplasmacapr

10、icolumsubsp.capricolum，MccCaliformiaKid株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所儲(chǔ)岳峰研究員饋贈(zèng)。絲狀支原體絲狀亞種LC型Mycoplasmamycoidessubsp.mycoidesLC，MmmLCY-goat株、無(wú)乳支原體Mycoplasmaagalactiae，M.agalactiaePG2株由西南民族大學(xué)湯承教授饋贈(zèng)。牛支原體Mycoplasmabovis，M.bovis、大腸桿菌Escherichiacoli，Ec、精氨酸支原體Mycoplasmaarginine，M.arginini、溶血性曼氏桿菌Mannheimiahaemolytica，Mh、巴

11、氏桿菌Pasteurellamultocida，Pm、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus，SA、萊氏無(wú)膽甾原體Acholeplasmalaidlawii，AL、MoFJ-CL01株、MoFJ-ND株、羊口瘡病毒orfvirus，ORFV及絲狀支原體山羊亞種Mycoplasmamycoidessubsp.capri，Mmc為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所別離、鑒定和保存。186份臨床樣品均為臨床上疑似羊支原體性肺炎病羊的肺組織和鼻拭子，發(fā)病羊表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、流鼻涕，剖檢見(jiàn)胸膜肺炎。1.2主要試劑組織/細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程上海;Nanodrop2000購(gòu)自

12、賽默飛美國(guó)公司;TwistAmpBasic試劑盒購(gòu)自TwistDx英國(guó)公司;膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)吳江;ExTaqDNA聚合酶、DL2000、DL1000Marker均購(gòu)自寶生物工程大連。1.3引物設(shè)計(jì)合成參照RPA引物設(shè)計(jì)原那么，下載GenBank中登錄號(hào)為KM435069.1的MoP80基因序列，利用Oligo7.9軟件設(shè)計(jì)引物，通過(guò)BLAST在線軟件比對(duì)分析，初步驗(yàn)證其特異性。MoRPA引物的核苷酸序列為：P1：5-CTTAATGATGAGCGTAGTAGATACCAAACCAC-3/P2：5-GCTGAGGTCGGATTTGGACTAACAATATTTG-3。擴(kuò)增片段大小為353

13、bp。常規(guī)PCR引物參照林裕勝等22的方法，引物均由生工生物工程上海股份合成。1.4支原體和細(xì)菌核酸抽提利用組織/細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取供試支原體和細(xì)菌的DNA，用作RPA和PCR反應(yīng)的模板。1.5RPA的反應(yīng)條件及優(yōu)化參照TwistAmpBasic試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的RPA擴(kuò)增反應(yīng)體系：取1LMoY98DNA作為模板，10mol·L-1上游引物和10mol·L-1下游引物各2.4L、RehydrationBuffer29.5L、無(wú)核酸酶純水12.2L和280mmol·L-1醋酸鎂2.5L，總反應(yīng)體積為50L，同時(shí)以無(wú)菌去離子水作為空白對(duì)照，并以試劑盒提

14、供的引物和模板作為陽(yáng)性對(duì)照，用以監(jiān)控?cái)U(kuò)增反應(yīng)是否正常。采用矩陣法，優(yōu)化反應(yīng)溫度36、38、40、42和反應(yīng)時(shí)間20、25、30、35、40min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增目的片段由生工生物工程上海股份進(jìn)行測(cè)序。1.6Mo常規(guī)PCR及別離鑒定常規(guī)PCR反應(yīng)體系為：PremixTaqTMVersion2.0plusdye10L、上下游引物10pmol·L-1各1L、MoDNA2L、無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至20L。反應(yīng)條件：942min;9430s、58.515s、7215s，30個(gè)循環(huán);7210min。Mo別離鑒定法參照江錦秀等23的方法進(jìn)行。1.7特異性試驗(yàn)分別以MoY98株

15、以及FJ-CL01和FJ-ND株的DNA、Mcc、M.arginini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、MmmLC、AL、Ec、SA、Pm的核酸作為模板，采用建立的MoRPA方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后，利用PCR純化試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物，然后經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。RPA擴(kuò)增反應(yīng)的加樣順序和反應(yīng)條件為：首先將RPA反應(yīng)體系中除了醋酸鎂之外的成分參加到TwistAmpBasic試劑盒提供的凍干酶復(fù)合物反應(yīng)管中，然后將醋酸鎂參加到反應(yīng)管蓋子內(nèi)，蓋上蓋子瞬時(shí)離心，使醋酸鎂進(jìn)入反應(yīng)體系中，然后將反應(yīng)管放入38恒溫水浴鍋中孵育30min。1.8敏感

16、性試驗(yàn)利用Nanodrop2000測(cè)定提取的MoDNA濃度，將其10倍倍比稀釋1011010，分別以稀釋后的不同濃度的DNA為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，以確定該引物的靈敏度，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，比較兩者之間的敏感性。RPA反應(yīng)體系和條件同特異性試驗(yàn)。1.9重復(fù)性試驗(yàn)利用建立的MoRPA方法對(duì)2份Mo陽(yáng)性樣品、Mcc、M.arginini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、MmmLC、AL、Ec、SA、Pm各1份作陰性對(duì)照，反應(yīng)條件和體系參照特異性試驗(yàn)。進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，上述樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù);進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，上述樣品間隔3d檢測(cè)1次，共測(cè)定3次。1.

17、10臨床樣品檢測(cè)利用建立的RPA方法對(duì)186份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行PCR檢測(cè)，并對(duì)其中40份肺臟樣品進(jìn)行支原體的別離鑒定，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算檢出率及符合率。2結(jié)果與分析2.1RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化及擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定經(jīng)優(yōu)化后，50L反應(yīng)體系最正確反應(yīng)時(shí)間和溫度為38反應(yīng)30min。應(yīng)用優(yōu)化后的體系對(duì)MoY98株進(jìn)行擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，MoY98經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出一條約350bp的目的片段，與預(yù)期大小一致圖1。測(cè)序結(jié)果顯示，RPA擴(kuò)增的MoP80基因序列長(zhǎng)度為353bp，與參考的KM435069.1株序列同源性為99.8%，與預(yù)期結(jié)果相符。2.2特異性擴(kuò)增利用建立的RPA檢測(cè)方

18、法對(duì)相應(yīng)細(xì)菌的核酸進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。結(jié)果顯示，僅MoY98株以及本研究室別離株FJ-CL01和FJ-ND株的DNA擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶，而Mcc、M.arginini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、MmmLC、AL、Ec、SA、Pm和去離子水樣品均為陰性圖2，說(shuō)明建立的RPA方法具有良好的特異性。2.3敏感性試驗(yàn)經(jīng)測(cè)定，Mo核酸質(zhì)量濃度為70ng·L-1，以10倍系列稀釋成7ng·L-1、700pg·L-1、70pg·L-1、7pg·L-1、700fg·L-1、70fg

19、·L-1、7fg·L-1、700ag·L-1、70ag·L-1進(jìn)行RPA和常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示：建立的MoRPA方法與常規(guī)PCR方法的檢測(cè)限均為70fg·L-1，說(shuō)明RPA與常規(guī)PCR方法的敏感性一致圖3。2.4重復(fù)性試驗(yàn)利用建立的MoRPA方法對(duì)2份Mo陽(yáng)性樣品，Mcc、M.arginini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、MmmLC、AL、Ec、SA、Pm各1份作陰性對(duì)照進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間試驗(yàn)結(jié)果均一致圖略，即除了2份Mo陽(yáng)性樣品有擴(kuò)增條帶，其余樣品均無(wú)擴(kuò)增

20、條帶，說(shuō)明重復(fù)性好。2.5臨床樣品檢測(cè)結(jié)果利用建立的RPA方法對(duì)186份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行PCR檢測(cè)，并對(duì)其中40份肺臟樣品進(jìn)行支原體的別離鑒定。結(jié)果顯示表1，RPA方法Mo陽(yáng)性率為51.1%95/186，PCR方法檢測(cè)Mo陽(yáng)性率為51.1%95/186，同時(shí)，別離鑒定法的13份Mo陽(yáng)性樣品及常規(guī)PCR法檢測(cè)出的95份陽(yáng)性樣品經(jīng)RPA檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明建立的RPA方法與常規(guī)PCR方法的符合率為100%，可作為臨床樣品中Mo快速檢測(cè)的候選技術(shù)。3討論與結(jié)論RPA是近年來(lái)新興起來(lái)的一種常溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)的檢測(cè)原理是在目的DNA片段擴(kuò)增過(guò)程中，重組酶與引物結(jié)合形成的復(fù)合物與DNA結(jié)合

21、，并沿著DNA鏈尋找引物的同源序列，一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成24。同傳統(tǒng)的PCR方法相比，該技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：首先是試劑使用方便，方便保存;其次是反應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)過(guò)程一般在40min內(nèi);最后是對(duì)設(shè)備要求低，僅需一臺(tái)水浴鍋即可完成反應(yīng)，無(wú)需高昂儀器設(shè)備。由于該項(xiàng)技術(shù)的這些優(yōu)點(diǎn)，有利于基層單位以及遙遠(yuǎn)山區(qū)的推廣應(yīng)用。因此本研究建立了一種以BasicRPA為根底的快速檢測(cè)Mo的方法。任何一種的檢測(cè)技術(shù)，都存在優(yōu)缺點(diǎn)。RPA方法作為一種新型的檢測(cè)技術(shù)，也存在一定的缺乏，比方引物的設(shè)計(jì)就沒(méi)有專門(mén)的軟件，而且RPA引物相比于常規(guī)PCR或熒光定量PCR引物要長(zhǎng)1020個(gè)

22、堿基，還不能出現(xiàn)連續(xù)重復(fù)序列以及發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且GC含量要控制在30%70%25。由于支原體基因組GC含量偏低，加上RPA引物設(shè)計(jì)具有以上缺乏，這就給本研究引物設(shè)計(jì)造成困難，然而本研究團(tuán)隊(duì)在前期建立Mo實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR的過(guò)程中，找到了符合RPA引物設(shè)計(jì)特性的基因P80，利用Oligo7.9軟件針對(duì)P80保守性序列設(shè)計(jì)多對(duì)引物，隨后通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及體系優(yōu)化篩選到1對(duì)效果較好的引物。反應(yīng)條件優(yōu)化方面，由于RPA反應(yīng)體系已經(jīng)是比較成熟的，因此本研究?jī)H對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的最正確反應(yīng)條件為38孵育30min。特異性驗(yàn)證方面，本研究建立的MoRPA檢測(cè)方法對(duì)Mcc、M.argi

23、nini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、MmmLC、AL、Ec、SA、Pm等均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明建立的RPA方法特異性強(qiáng)。靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示，建立的MoRPA檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限為70fg·L-1，與常規(guī)PCR結(jié)果一致，然而本研究建立的方法在靈敏度方面與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道還是有一定的差距，如劉占旭等26建立的豬嵴病毒RPA診斷方法最低檢測(cè)限到達(dá)了3.36×102copies·L-1，比常規(guī)PCR靈敏度高100倍;Wang等27建立的豬圓環(huán)病毒型的qRPA方法最低檢測(cè)限到達(dá)了100copies·L-1，比常規(guī)PCR靈

24、敏度高10倍;Yang等28建立的羊口瘡病毒qRPA方法最低檢測(cè)限為100copies·L-1，樊曉旭等29建立的塞尼卡病毒RPA-LFD檢測(cè)方法最低檢限為56copies·L-1。本研究RAP方法敏感性較低的原因可能是由于Mo基因組GC含量偏低，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低下;此外引物長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，也可能是影響敏感性較低的一個(gè)原因。重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果顯示，本研究建立的RPA方法可重復(fù)性較好。因此，本研究成功建立了一種具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便的MoRPA臨床快速檢測(cè)方法，為Mo的臨床快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的手段。參考文獻(xiàn)：【1】BESSERTE，F(xiàn)RANCESCASSIRERE，

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