關(guān)于“DAD秘籍”

1、關(guān)于“DAD秘籍”     二極管陣列檢測(cè)器目前已在高效液相色譜分析中大量使用，一般認(rèn)為是液相色譜最有發(fā)展、最好的檢測(cè)器。隨著DAD檢測(cè)器的普及，我們很多客戶反饋在使用DAD的過(guò)程中有些許疑惑，于是小桂版的DAD秘籍應(yīng)運(yùn)而生，幫助用戶無(wú)憂修煉 :) 要進(jìn)入正題了，好激動(dòng) =1明表象四張圖分清紫外檢測(cè)器（UVD）和二極管陣列檢測(cè)器（DAD）     外觀差不多：   原理有不同:一句話概括：紫外檢測(cè)器先分光，取得單色光再通過(guò)流通池，用光電二極管檢測(cè)，只能獲得特定波長(zhǎng)的

2、信號(hào)；二極管陣列檢測(cè)器復(fù)色光先通過(guò)流通池，再分光，整個(gè)光譜由二極管陣列檢測(cè)，同時(shí)獲得一段光譜范圍內(nèi)信號(hào)。      功能有差異：  DAD譜圖更豐富： DAD是大勢(shì)所趨   一般情況下，二極管陣列檢測(cè)器可以完全替代紫外檢測(cè)器。同時(shí)因?yàn)镈AD可以獲取更多的數(shù)據(jù)信息，用于輔助定性和光譜檢索，因此DAD的使用會(huì)越來(lái)越普遍。 2知用法    DAD再牛，也要會(huì)使用。相對(duì)紫外檢測(cè)器，DAD的設(shè)置和參數(shù)優(yōu)化會(huì)更多一些，對(duì)使用者的要求也高一些。不過(guò)不用怕，只要

3、掌握了下面的秘籍，你也可以輕松玩轉(zhuǎn)DAD。     有硬件就要有軟件，DAD全部由工作站來(lái)控制。下面就以RIGOL UltraChrom 和安捷倫 Chemstation為例，看看工作站方法設(shè)置。（實(shí)驗(yàn)方法是藥典、標(biāo)準(zhǔn)等既定方法規(guī)定的，按照方法中的要求設(shè)定方法。） 1. 下面來(lái)看看 RIGOL Ultrachrom 工作站方法設(shè)置: 這個(gè)方法，用紫外檢測(cè)器得跑三遍，但用DAD可以一次搞定，如何設(shè)置，看下圖： 2. 再來(lái)看看 安捷倫Chemstation工作站方法設(shè)置：

4、0; 【插播】DAD 方法中參數(shù)說(shuō)明：【一般情況下】樣品波長(zhǎng)：按照方法要求選擇檢測(cè)波長(zhǎng)，可以參考下文中的詳細(xì)說(shuō)明。 樣品帶寬：主要影響峰高和基線噪音，因此優(yōu)化帶寬可以獲得最佳信噪比；樣品帶寬選擇的最直接依據(jù)是其吸收光譜中峰的峰寬，詳見(jiàn)后面的解釋。4nm是比較通用的樣品帶寬。 參比波長(zhǎng)：選擇合適的參比波長(zhǎng)可以減小梯度洗脫過(guò)程中的基線漂移，甚至可以通過(guò)優(yōu)化參比波長(zhǎng)對(duì)共流出峰（沒(méi)分開(kāi)的峰）做分別檢測(cè)。一般選擇在靠近樣品信號(hào)的無(wú)吸收或低吸收區(qū)域，請(qǐng)參考下文詳細(xì)說(shuō)明。 參比帶寬：是參比波長(zhǎng)取值的波長(zhǎng)范圍，影響參比波長(zhǎng)設(shè)置的實(shí)際效果。參比帶寬至少要與樣品波

5、長(zhǎng)的帶寬相等，許多情況下選擇100nm作為缺省值，如果在不想用參比波長(zhǎng)的情況下，也可以直接將帶寬設(shè)置為0（或去掉參比波長(zhǎng)前面的勾，如Agilent儀器）。 波長(zhǎng)范圍：是工作站采集3D光譜數(shù)據(jù)的波長(zhǎng)范圍。一般按照方法要求，沒(méi)有要求則需要包含所有被測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)，但是較寬的波長(zhǎng)范圍采集會(huì)占用更多的磁盤空間。 步進(jìn): 一般選擇1nm，步進(jìn)的選擇對(duì)譜帶數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)有影響。 采樣率/峰寬：采樣率和峰寬是同一目的的兩種不同實(shí)現(xiàn)方式，其目的都是為了真實(shí)的采集到一個(gè)色譜峰。一般選擇10Hz。采樣率高能更真實(shí)的還原峰型，但會(huì)帶來(lái)更大的基線噪音。反之過(guò)低的采樣率會(huì)導(dǎo)致峰變形，

6、但基線噪聲更小。選擇合適的采樣率以獲得最佳的信噪比。 曝光時(shí)間：這是RIGOL L-3520 DAD的一項(xiàng)高級(jí)參數(shù)設(shè)置，一般選擇20ms濾波設(shè)置: 這是RIGOL L-3520 DAD的一項(xiàng)高級(jí)參數(shù)設(shè)置，快/正常/慢/無(wú)，一般選擇正常 要弄明白一般為什么這樣設(shè)置，請(qǐng)您接著看每個(gè)參數(shù)的意義 3懂原理1.  樣品和參比波長(zhǎng)及帶寬簡(jiǎn)單說(shuō)：你看到的色譜圖上的最終吸光度值是這么來(lái)的： 吸光度=以樣品波長(zhǎng)為中心在樣品帶寬范圍內(nèi)的所有波長(zhǎng)吸光度平均值-以參比波長(zhǎng)為中心在參比帶寬范圍內(nèi)的所有波長(zhǎng)吸光度平均值這個(gè)吸光度是實(shí)時(shí)計(jì)算的，你看到的色

7、譜圖中的每一個(gè)點(diǎn)，都是這個(gè)公式計(jì)算來(lái)的。（當(dāng)然如果關(guān)閉了參比波長(zhǎng)，就沒(méi)有后半截了） 暈了吧？ 打個(gè)比方，檢測(cè)器方法中的信號(hào) A 設(shè)置為樣品 254.0/4、參比360.0/100，即從 252到 256 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的平均吸光度減去從 310 到 410 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的平均吸光度。有什么用？想一想，我們?cè)谧咛荻?，流?dòng)相的組成時(shí)時(shí)變化，導(dǎo)致基線漂移，大家應(yīng)該經(jīng)常遇到。為啥會(huì)這樣？主要因?yàn)榱鲃?dòng)相變化時(shí)：（1）流動(dòng)相組成變化導(dǎo)致背景吸收變化（尤其是檢測(cè)波長(zhǎng)比較短的時(shí)候，如203nm）；（2）流動(dòng)相組成變化導(dǎo)致折光系數(shù)改變（這個(gè)是流通池里面光折射的物理的影響）。現(xiàn)在回顧下上

8、面的公式，其實(shí)：吸光度=(樣品吸收+背景吸收)-(參比吸收+背景吸收)如果我們把參比波長(zhǎng)選在一個(gè)樣品沒(méi)吸收的地方，則：吸光度=(樣品吸收+背景吸收)-(0+背景吸收)換句話說(shuō)，背景變化被扣掉了所以基線不飄了！就像下面這樣：（此圖片來(lái)源于Agilent用戶手冊(cè)）所以，小伙伴們，用DAD時(shí)，正確選擇參比波長(zhǎng)，是糾正基線漂移的法寶。 還有，一般參比帶寬都選的那么寬，為啥？因?yàn)椋瑤捲綄挘黄骄臄?shù)據(jù)點(diǎn)越多，偶然性變化帶來(lái)的影響越低，背景扣除越準(zhǔn)確穩(wěn)定。100nm是比較常用的參比帶寬。但參比帶寬范圍內(nèi)注意不要有吸收，否則會(huì)降低峰高，搞不好出來(lái)一堆倒峰。 樣品帶寬為啥多數(shù)是4nm？樣

9、品帶寬決定了樣品信號(hào)平均的波長(zhǎng)范圍，顯然帶寬越寬，平均的越多，基線越穩(wěn)定。但如果太寬了，峰的高度和光譜的分辨率都會(huì)受影響，后面小編會(huì)通過(guò)專題講這是為啥，敬請(qǐng)期待！這里只要記住，帶寬寬，基線噪聲小，峰高降低；帶寬窄，基線噪聲大，峰高受影響小。如下圖：一般4nm就可以了（此圖片來(lái)源于Agilent用戶手冊(cè)） 2. 步進(jìn)就是采集光譜時(shí)，離多遠(yuǎn)采集一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。步子大了，得到的光譜圖清晰度不夠；步子小了，會(huì)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)迅速填滿你的磁盤。而光譜圖的清晰度，又會(huì)影響峰純度分析時(shí)的準(zhǔn)確性，所以選擇什么樣的步進(jìn)，還要看看以后的用途。 3采樣率/峰寬：采樣率和峰寬是同一目的的兩種不

10、同實(shí)現(xiàn)方式，其目的都是為了真實(shí)的采集到一個(gè)色譜峰。一般選擇10Hz，采樣率高能更真實(shí)的還原峰型，但會(huì)帶來(lái)更大的基線噪音。反之過(guò)低的采樣率會(huì)導(dǎo)致峰變形，但基線噪聲更小。選擇合適的采樣率以獲得最佳的信噪比。來(lái)張圖就明白了4.曝光時(shí)間曝光時(shí)間屬于RIGOL L-3520 DAD高級(jí)選項(xiàng)，曝光時(shí)間與采樣率有負(fù)相關(guān)，同時(shí)也跟曝光次數(shù)有關(guān)。一般選擇20ms就可以滿足要求了，不需要用戶做過(guò)多設(shè)置。 5. 濾波濾波屬于RIGOL L-3520 DAD高級(jí)選項(xiàng)，濾波是針對(duì)采集后的基線做了微小的處理。濾波目前有四種速度，分別是快、正常、慢和無(wú)。濾波速度越慢濾波相對(duì)效果會(huì)好一些，但是平常使用選擇

11、正常就可以了。  4懂?dāng)?shù)據(jù) PDA視圖分析按照正確的設(shè)置方法，待測(cè)物質(zhì)分析完畢，則需要使用PDA視圖：3D譜圖可以比較直觀地查看 信號(hào)-時(shí)間-波長(zhǎng) 三維視圖，通過(guò)調(diào)整等高圖中橫軸(波長(zhǎng)軸)即樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)，縱軸(時(shí)間軸)即保留時(shí)間，可以得到合適的色譜圖和光譜圖，通過(guò)峰純度可以確定檢測(cè)峰是否含有其它物質(zhì)。確切地說(shuō)，每種一定濃度范圍內(nèi)的具有紫外吸收的物質(zhì)都會(huì)有其獨(dú)特的光譜圖，通過(guò)比較對(duì)照品與供試品譜圖目標(biāo)峰的保留時(shí)間范圍內(nèi)的光譜圖，如不相同則不含待測(cè)物質(zhì)。 5解難題 DAD常見(jiàn)問(wèn)題分析:1.濃度太高超量程平頭了2.濃度太低噪聲已經(jīng)掩蓋了部分峰形這兩種情況的處理方法：適當(dāng)?shù)卦鰷p樣品的濃度，保證光譜圖在合適的濃度范圍內(nèi)顯示。同時(shí)也需要考慮到流動(dòng)相的溫度、成分或PH值的變化。 以下是一