大腸桿菌基因工程——人胰島素202-2PPT

1、大腸桿菌基因工程大腸桿菌基因工程人胰島素的生產(chǎn)人胰島素的生產(chǎn)講 述 人 599小組成員2016.11.71目錄目錄1.利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽2.胰島素的生產(chǎn)方法3.產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略2利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽 由于大腸桿菌繁殖迅速價格低廉，培養(yǎng)代謝易于控制，因此重組大腸桿菌在醫(yī)用蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。盡管有些生物活性嚴(yán)格依賴于糖基化作用的真核生物功能蛋白無法用重組大腸桿菌進(jìn)行生產(chǎn)，蛋白質(zhì)生物合成后加工系統(tǒng)的缺乏使得某些人體蛋白難以折成天然構(gòu)象，但仍有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜的人體蛋白，如

2、富含半胱氨酸的血清清蛋白（含半胱氨酸的血清清蛋白（HSAHSA）、）、尿激酶原（尿激酶原（pro-UKpro-UK）、金屬硫蛋白（）、金屬硫蛋白（MTMT）、二硫鍵共價）、二硫鍵共價交聯(lián)的二聚體蛋白巨噬細(xì)胞集落刺激因子（交聯(lián)的二聚體蛋白巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSFM-CSF）以）以及四聚體的血紅蛋白及四聚體的血紅蛋白(Hb(Hb）等。 本次以重組人胰島素重組人胰島素為例，論述利用大腸桿菌生產(chǎn)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的基本過程。3胰島素的生產(chǎn)方法胰島素的生產(chǎn)方法 人胰島素是一種由兩條多肽鏈 ( A 鏈和 B 鏈) 組成的蛋白質(zhì)。胰島素合成時，最初在胰島 B 細(xì)胞內(nèi)的附著核糖體上形成的是一條單鏈多肽前

3、胰島素原，其進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，信號肽酶切除信號肽形成胰島素原，后者被運輸至高爾基體，在高爾基體中切除連接 序列( C 鏈) 形成 A 鏈和 B 鏈，然后通過二硫鍵將兩者結(jié)合形成有生物活性的胰島素。 工業(yè)上可采用下列四種方法大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素：（1）從人的胰中直接提取胰島素；（2）由單個氨基酸直接化學(xué)合成；（3）由豬胰島素化學(xué)轉(zhuǎn)型為人胰島素；（4 4）利用基因工程菌大規(guī)模大規(guī)）利用基因工程菌大規(guī)模大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)重組人胰島素模發(fā)酵生產(chǎn)重組人胰島素。4產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工 程 菌 的 構(gòu) 建 策 略51 1 A鏈和B鏈的編碼區(qū)由化學(xué)合成，兩個雙鏈DNA片段分別克隆在含有Ptac啟動子和-半乳糖苷酶基因

4、的表達(dá)型質(zhì)粒上，后者與胰島素編碼序列形成雜合基因，其連接位點處為甲硫氨酸密碼子。 重組分子分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞，兩種克隆菌分別合成-半乳糖苷酶-人胰島素A鏈以及-半乳糖苷酶-人胰島素B鏈兩種融合蛋白。經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵后，從菌體中分離純化融合蛋白，再用溴化氫在甲硫氨酸殘基的C端化學(xué)切斷融合蛋白，釋放出人胰島素的A鏈和B鏈。胰島素AB鏈分別表達(dá)法的基本原理AB鏈分別表達(dá)法62 2人胰島素原表達(dá)法雖然上述工藝路線并不比AB鏈分別表達(dá)更為簡捷，而且需要額外使用兩種高純度的酶制劑，但由于其體外折疊成功率相當(dāng)高，在一定程度上彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得產(chǎn)品的生產(chǎn)成本僅為50美元/g。 將人胰島素原cDNA編

5、碼序列克隆在-半乳糖苷酶基因下游，兩個DNA片段的連接處仍為甲硫氨酸密碼子。該雜合基因在大腸桿菌中高效表達(dá)后，分離純化融合蛋白，并同樣采取溴化氫化學(xué)裂解法回收人胰島素原片段，然后將之進(jìn)行體外折疊。由于C肽的存在，胰島素原在復(fù)性條件下能形成天然的空間構(gòu)象，為3對二硫鍵的正確配對提供了良好的條件，使得體外折疊率高達(dá)80%以上。為了獲得具有生物活性的胰島素，經(jīng)折疊后的人胰島素原分子必須用胰蛋白酶特異性切除C肽，可獲得完整的A鏈以及C端帶有精氨酸Arg的B鏈。7AB鏈同時表達(dá)法鏈同時表達(dá)法 這種方法的基本思路是將人胰島素的A鏈和B鏈編碼序列拼接在一起，然后組裝在大腸桿菌-半乳糖苷酶基因的下游。重組子表

6、達(dá)出的融合蛋白經(jīng)溴化氫CNBr處理后，分離傳話A-B鏈多肽，然后再根據(jù)兩條鏈連接處的氨基酸性質(zhì)，采用相應(yīng)的裂解方法獲得A鏈和B鏈肽段，最終通過體外折疊制備具有活性的重組人胰島素。與第一種方法相似，其最大的缺陷仍是體外折疊的正確率較低，因此目前尚未進(jìn)入應(yīng)用階段。3 38 上述三種工程菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所生產(chǎn)的融合型重組蛋白表達(dá)率高，且穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，主要以包含體的形式存在與細(xì)胞內(nèi)。一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列插入到表達(dá)型質(zhì)粒-內(nèi)酰胺酶基因的下游，后者所編碼是降解青霉素的酶蛋白，通常能被大腸桿菌分泌到細(xì)胞外。由此構(gòu)建得到的工程菌同時具備了穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性，為胰島素