植物組織培養(yǎng)快繁技術

1、植物組織培養(yǎng)快繁技術摘要：本文簡要介紹植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法，綜述植物脫除病毒的熱處理、莖尖 培養(yǎng)和抗病毒藥劑3種方法的原理、發(fā)展史和技術方法，并介紹了幾種常用的病毒檢測方法。 同時還對植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術的應用前景作了預測分析。關鍵詞：莖尖培養(yǎng)；組織培養(yǎng)；快繁脫毒技術；病毒檢測；應用前景 正文：1植物組織培養(yǎng)研究概況1.1研究簡史自從1943年懷特（white）提出植物細胞“全能性” （totipotency）學說及 諸多后學者（steward, 1958, guha和marteshwari, 1964）相繼證實后，引發(fā)植 物組織和細胞培養(yǎng)快繁技術的快速發(fā)展。我國的專家學者在20世

2、紀70年代后也 在此領域做了大量的研究和開發(fā)工作，創(chuàng)造了很多新方法、新技術，提出不少新 成果，開拓了植物組織培養(yǎng)快繁技術的新局面。目前采用組織培養(yǎng)脫病毒快繁及 離體快繁生產株苗的技術已發(fā)展相當成熟2。脫毒株苗具有無雜菌、適應能力 較強、繁育較快、質量優(yōu)、抗性好、分藥性強、繁殖系數高、大批量生產、周年 供應、便于運輸等優(yōu)點，已得到有關專家的鑒定及高度評價和種植試驗區(qū)、種植 產區(qū)果農的認可。例如脫毒馬鈴薯、脫毒紅薯、脫毒生姜、脫毒大蒜、脫毒草莓、 脫毒苗木、脫毒花卉等，已成為現代農民致富的新寵。1.2植物組織培養(yǎng)利脫毒快繁的定義植物組織培養(yǎng)（plant tissue culture）是指在無菌的條

3、件下，將離體的植物（根、 莖、葉、花、果實、種子等）、組織（形成層、花藥組織、胚乳、皮層等）、細胞 （體細胞和生殖細胞）以及原生質體，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當的 培養(yǎng)條件，使其長成完整的植株。由于培養(yǎng)物是脫離植物母體，在玻璃瓶屮進行 培養(yǎng)，所以也叫做離體培養(yǎng)。其完整過程是：脫分化再分化生長外植體愈傷組 織生長點或根莖葉完整植株發(fā)生胚狀體在有些情況下，再分化也可不經愈傷組 織階段，而直接發(fā)生于脫分化的細胞。植物組織培養(yǎng)脫毒快繁是人工在無菌條件 下利用植物體的一部分，在人工控制的營養(yǎng)和環(huán)境條件下繁殖植物，脫除病毒得 到無毒苗株，繼而在大田快速繁殖的技術。脫毒及離體快繁，這是目前植物組織

4、培養(yǎng)應用最多、最廣泛和是有效的一個方面。主要是進行莖尖培養(yǎng)脫除病毒。對 于脫毒苗、新育成、新引進、稀缺良種、優(yōu)良單株、瀕危植物和基因工程植株等 可通過離體快速繁殖，同時可不受地區(qū)和氣候的影響，比傳統的繁殖方法快數萬 倍。植物組織培養(yǎng)已發(fā)展成為一門富有生命力的學科。追究植物組織培養(yǎng)脫毒快 繁技術的發(fā)展簡史，在11世紀就岀現的熱處理脫毒法，最早解決一些作物的病 毒病害問題。20世紀50年代發(fā)展的植物組織培養(yǎng)技術為脫毒提供了一條有效途徑?，F在 植物的脫毒技術有多種，其中應用最廣泛的有3種：熱處理法、莖尖培養(yǎng)脫毒法、 抗病毒藥劑法，將不同的方法相結合起來應用效果更好，它們的脫毒原理各不相 同。2脫毒技

5、術及其原理2.1熱處理法2.1.1概述熱處理法是利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐性的差異，使植物的生長速度 超過病毒的擴散速度，得到一小部分不含病毒的植物分生組織，然后進行無毒個 體培育。熱處理法屮，最主要的影響因素是溫度和時間。熱處理可通過熱水浸泡 或濕熱空氣進行。熱水浸泡對休眠芽效果較好，濕熱空氣對活躍生長的莖尖效果 較好，既能消除病毒又能使寄主植物有較高的存活機會。熱空氣處理比較容易進 行，把吒盛生長的植物移入到1個熱療室中，在3540°c下處理一段時間即可，處理時間的長短，可由兒分鐘到數月不等4。 熱處理的方法有恒溫處理和變溫處理，處理的材料可以是植株，也可以是接穗。 2.1.

6、2原理熱處理脫毒是根據病毒與寄生細胞對高溫的忍耐程度不同，選擇適當的溫度 和處理時間，植物組織中的很多病毒被部分地或完全地鈍化而可控制其的活動， 但很少傷害甚至不傷害寄主組織，從而讓植物細胞加快生長，使生長點附近不帶 病毒，從而達到脫毒的目的。2.1.3簡史用熱處理脫除馬鈴薯卷葉病毒（plrv）是世界上脫除已知病毒最早的例子。 早在1889年，印度尼四亞爪哇人就把繁殖用的甘蔗切斷放在50°c左右的熱水中 浸泡30min來防止枯萎?。ìF已知是病毒?。┑陌l(fā)生。現在世界許多國家在種植 前仍使用這種方法處理甘蔗。但是后來人們發(fā)現熱水對植物的傷害大，bake （1972）研究表明在熱水處理中，

7、由于植物組織經過淋洗，在水中長期浸泡常常 會窒息死亡，并且這種處理也會打破或延長植物的休眠期。所以現在更常用的方 法是將病毒感染的植物用3538°c熱空氣處理1428（1或者更長時間進行 脫毒4。此法尤其適合處理生理干旱的材料和處于休眠狀態(tài)的果樹。熱處理脫 毒法已應用多年，被世界多個國家利用。該項技術要求的設備條件比較簡單，脫 毒操作也比較容易。主要缺點是脫毒時間長，脫毒不完全，例如tmv這類桿狀 病毒就不能用這種方法脫除，因而該方法有一定的局限性。2.2莖尖培養(yǎng)脫毒法2.2.1概述莖尖培養(yǎng)脫毒就是采取莖尖分生組織離體培養(yǎng)的方法獲取無病毒試管苗，其 方法是在解剖鏡下，用鋒利的解剖刀進

8、行迅速準確地莖尖剝離，因為莖尖分生組 織基本不帶病毒，利用植物莖尖分生組織進行離體培養(yǎng)，再結合病毒檢測，就可 以獲得無病毒的植株。莖尖培養(yǎng)中最主要的影響因素就是切取莖尖的大小，一般 要求莖尖長度小于1mm。技術上通常切取莖尖越小，脫毒效果越好，但是莖尖 培養(yǎng)成活率變低。曹為玉等研究發(fā)現葡萄莖尖長度與存活率成正相關，與脫毒率 成反相關。當切取莖尖長度為0.20.3mm時，存活率為21%38%,脫毒 率為91.4%97%；當切取0.5mm以上時，存活率為75%83%,脫毒率僅 為70.6%76.5%。莖尖培養(yǎng)脫毒法脫毒率高，脫毒速度快，能在較短的時 間內得到較多的原種繁殖材料，但這種方法存在的缺點

9、是植物的存活率低。為了 克服這一缺點，現在經常是將莖尖培養(yǎng)與熱處理相結合來使用。莖尖培養(yǎng)與熱處 理相結合之所以能夠提高脫毒效果，是由于熱處理可使植物生長本身所具有的頂 端免疫區(qū)得以擴大，有利于切取較大的莖尖(在1mm左右)，從而能夠提高培養(yǎng) 或嫁接的成活率。如大櫻桃置于45°c的恒溫培養(yǎng)室內，培養(yǎng)35d,再切取0.2 0.4mm的莖尖培養(yǎng)，平均脫毒率為98%o2.2.2原理莖尖培養(yǎng)脫毒的原理是植物體內病毒靠維管束系統移動，分生組織中沒有維 管束存在，病毒只靠胞間連絲移動，速度很慢，難以追上生長活躍的分生組織， 所以旺盛生長的根尖、莖尖一般都無病毒或很少有病毒分布。2.2.3簡史whi

10、te于1943年首先發(fā)現在感染煙草花葉病毒的煙草生長點附近病毒的濃 度很低，甚至沒有病毒。這一發(fā)現為莖尖培養(yǎng)脫除病毒提供了理論依據。懷特 (white, 1934)在體外培養(yǎng)感染了 tmv病毒的馬鈴薯根，并用枯斑寄主法測 定了根不同部位的病毒含量，發(fā)現根尖部位的病毒含量比其他部位少，甚至不存 在病毒。morel等1952年首先從感染了花葉病毒和斑萎病毒的大麗花植株上切 取莖尖，通過組織培養(yǎng)獲得了無病毒的大麗花，證明了前人假設的正確性。此后, 人們采用莖尖培養(yǎng)技術相繼獲得了多種植物的無病毒植株?，F在莖尖培養(yǎng)脫毒法 已經成為植物無毒苗生產屮應用最廣泛的一種方法。據研究，植物體內某一部分 組織器官不

11、帶病毒的原因是：分生組織的細胞生長速度快，病毒在植物體內繁殖 的速度相對較慢，而且病毒的傳播是靠篩管組織進行轉移或通過細胞間連絲傳遞 給其他細胞，因此病毒的傳遞擴散也受到一定限制，這樣便造成植物體的部分組 織細胞沒有病毒。根據這個原理，可以利用莖尖培養(yǎng)來培育無病毒苗木。2.3抗病毒藥劑法2.3.1概述抗病毒藥劑法，這是一種新的脫毒方法，運用一些抗病藥劑的作用影響病毒 rna的復制形成，干擾病毒的正常生長，從而達到除去病毒的目的。常用的抗 病毒化學藥物有三氮呼核昔(病毒卩坐)，5二氫尿卩密旋(dht)和雙乙酰二氫亠 氮尿卩密唳(da-dht)o這些藥物常常通過直接注射到帶病毒的植株上，或者加 到

12、植株生長的培養(yǎng)基上。這種方法一般要與莖尖培養(yǎng)相結合應用。經過抗病毒藥 劑處理的嫩莖，切取莖尖，再進行組織培養(yǎng)，就會提高脫毒率和成活率。采用病毒抑制劑與莖尖培養(yǎng)相結合的脫毒方法，可以較容易的脫 除多種病毒，而且這種方法對取材要求不嚴，接種莖尖可大于1mm,易于分化 出苗，提高存活率。2.3.2原理抗病毒藥劑法的作用原理是抗病毒藥劑在三磷酸狀態(tài)下會阻止病毒rna帽 子結構形成而達到除去病毒的效果。2.3.3簡史羅曉芳等于1996年曾在培養(yǎng)基屮加入病毒卩坐,脫除了 2種蘋果潛隱病毒1。 除了以上3種脫毒方法以外，花藥培養(yǎng)法、莖尖嫁接脫毒、愈傷組織培養(yǎng)法、胚 珠培養(yǎng)法也可用于植物組織培養(yǎng)快繁脫毒。3脫

13、毒效果的檢測方法經過脫毒處理的植株是否還存在病毒，必須經過病毒學檢測才能確定。可靠 的病毒檢測方法與建立有效的脫毒方法同等重要。傳統上一直沿用的檢測方法是 目測法，但是這種方法無法剔除潛隱性病毒。后來出現的指示植物法，擴大了檢 測范圍。近年來隨著生物科學的快速發(fā)展，免疫學方法、分子生物學方法等許多 先進的理化技術的應用，促進了病毒檢測技術的改進與發(fā)展。下面簡要介紹幾種 檢測脫毒苗的方法。3.1植株直接測定法直接觀察植株莖葉有無某種病毒引起的可見癥狀，是最簡單的測定方法。不 過，由于某些寄主植物感染病毒后需要較長的時間才出現癥狀，有的并不能使寄 主植物出現可見的癥狀，因而無法快速檢驗。3.2指示

14、植物法此法最早是美國的病毒學家holmes 1929年發(fā)現的。利用病毒在其他植物上 出現癥狀的特征，作為鑒別種類的標準。當原始寄主的癥狀不明顯時，就可用指 示植物法，這是因為指示植物比原始寄主更容易表現癥狀。具體做法是將病葉研 磨,把汁液接種到寄主植物上，對于木木植物，是將原始寄主嫁接到指示植物上。 指示植物法簡便易行，成本低，但它靈敏性差，所需時間長，難以區(qū)分病毒種類。 3.3血清學方法抗血清鑒定法要進行抗原的制備(包括病毒的繁殖，病葉研磨和粗汁液澄清 等)，抗血清的采收、分離等。血清可分裝到小玻璃瓶屮，貯存在15-25°c 的冰凍條件下。測定時，把稀釋的抗血清與未知的病毒植物在小

15、試管內混合，這 一反應導致形成可見的沉淀，然后根據沉淀反應來鑒定病毒。此法靈皺度高，獲 得檢測結果迅速，是目前檢測病毒的一種最好方法。此外，pcr微量板雜交法5、 蛋白質電泳法、嫁接檢測法、電子顯微鏡檢定法、病毒癥狀學診斷法等也可以 用來檢測植物病毒。4植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術應用前景的簡述植物組織培養(yǎng)技術在作物上主要用于育種和良種繁殖，其次用于無性繁殖作 物的脫毒和快繁以及種質的保存等，可見植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術對于農作物 苗木的生產具有極其重要的地位。一些農作物或是花卉植物等因長期的栽培和種 植，植物體內被侵染攜帶病毒、種性退化現在能利用組織培養(yǎng)及快繁脫毒方法開 發(fā)出的植物脫毒新品種有馬鈴薯、甘薯、生姜、大蒜、草莓