構(gòu)建表達(dá)載體的實驗流程及其注意事項2014-12

1、構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的實驗流程及其注意事項實驗流程及其注意事項中國農(nóng)業(yè)大學(xué)中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 梁榮奇梁榮奇2把目的基因置于以適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，篩選所需把目的基因置于以適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，篩選所需的細(xì)菌克隆。搖菌后可得到大量含目的基因的表達(dá)載體的細(xì)菌克隆。搖菌后可得到大量含目的基因的表達(dá)載體 注意事項：注意事項：- 選擇合適的載體選擇合適的載體- 載體具有適合的酶切點載體具有適合的酶切點- 適合地連接反應(yīng)適合地連接反應(yīng)- 選擇適合擴(kuò)增質(zhì)粒的菌株選擇適合擴(kuò)增質(zhì)粒的菌株- 篩選、驗證目的克隆篩選、驗證目的克隆- 轉(zhuǎn)化對照轉(zhuǎn)化對照3分子克隆實驗若紙上談兵，似乎輕而易舉；但要付諸實踐，分子克隆

2、實驗若紙上談兵，似乎輕而易舉；但要付諸實踐，卻又舉步維艱，談何容易。大多數(shù)實驗都是步驟繁多，若卻又舉步維艱，談何容易。大多數(shù)實驗都是步驟繁多，若一著不慎，即會陷入困境。一著不慎，即會陷入困境。驗證每步產(chǎn)物，設(shè)置對照以檢查每一反驗證每步產(chǎn)物，設(shè)置對照以檢查每一反應(yīng)的效率，應(yīng)的效率，都是可取的良策。而要對上述問題應(yīng)對自都是可取的良策。而要對上述問題應(yīng)對自如，又必須如，又必須透徹理解每一步實驗流程所涉透徹理解每一步實驗流程所涉及的實驗原理。及的實驗原理。 第一版前言（第一版前言（p11p11）分子克隆實驗指南分子克隆實驗指南 第二版第二版 ，19961996，科學(xué)出版社，科學(xué)出版社45如何閱讀質(zhì)粒圖

3、譜如何閱讀質(zhì)粒圖譜1、質(zhì)粒類型和大?。ㄕ婧?原核/穿梭質(zhì)粒）2、復(fù)制起點（ori）3、篩選標(biāo)記（抗生素標(biāo)記）4、多克隆位點（MCS）5、外源DNA片段的插入（位置、大小、酶切位點）6、表達(dá)系統(tǒng)元件 （啟動子核糖體結(jié)合位點/內(nèi)含子克隆位點轉(zhuǎn)錄終止信號）81、殺菌機(jī)理：、殺菌機(jī)理：四環(huán)素四環(huán)素（tet): 四環(huán)素與核糖體四環(huán)素與核糖體30S亞基結(jié)合，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。亞基結(jié)合，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。 Tet 抗性基因編碼一個抗性基因編碼一個399的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。氨芐青霉素氨芐青霉素（amp)：氨芐青霉素可與細(xì)菌膜上一些與細(xì)胞壁合成有關(guān)的酶結(jié)合：氨

4、芐青霉素可與細(xì)菌膜上一些與細(xì)胞壁合成有關(guān)的酶結(jié)合 并抑制其活性。并抑制其活性。Amp基因可降解氨芐青霉素。基因可降解氨芐青霉素。氯霉素氯霉素（Cm或或cat)：氯霉素與核糖體：氯霉素與核糖體50S亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)的合成。亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)的合成。 Cat 基因編碼一個四聚體細(xì)胞蛋白，催化氯霉素羥乙酰氧衍生物的形成?；蚓幋a一個四聚體細(xì)胞蛋白，催化氯霉素羥乙酰氧衍生物的形成?？敲顾乜敲顾兀╧an)：可與核糖體結(jié)合，抑制蛋白的合成。：可與核糖體結(jié)合，抑制蛋白的合成。 卡那霉素可被氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶卡那霉素可被氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH-II)滅活。滅活。2、溶液配制：、溶液配制： 一般配

5、成一般配成50或或100mg/mL，抽濾，抽濾，-20保存?zhèn)溆帽４鎮(zhèn)溆?。常用抗生素抗性基因常用抗生素抗性基?遺傳轉(zhuǎn)化所用載體（遺傳轉(zhuǎn)化所用載體（1）一、基因槍轉(zhuǎn)化 1、對載體類型無選擇； 2、載體不宜過大，目的基因不宜過大。 3、可以轉(zhuǎn)化 “啟動子-目的基因-終止子” 片段。二、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 1、農(nóng)桿菌載體，含有左右邊界； 2、 可以轉(zhuǎn)化大的目的基因。 10候選基因功能分析候選基因功能分析一、超表達(dá)載體 1、CaMV 35S啟動子； 2、玉米Ubi啟動子； 3、其它。二、RNAi載體 1、含有intron，轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)卡，沉默效率高； 2、 多用其本身啟動子。 1112一、克隆位點的選擇 1、

6、首先要對目標(biāo)基因進(jìn)行酶切位點掃描分析，列出其所含酶切位點清單。 2、然后對照質(zhì)粒多克隆位點，所選擇的克隆位點必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點。 二、保護(hù)堿基數(shù)（直接酶切PCR產(chǎn)物） 1、在設(shè)計PCR引物時，引入酶切位點后，常常要加入保護(hù)堿基。 2、 一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就可以正常進(jìn)行； 有些則加3個以上，NdeI就屬這類，需加入至少6個保護(hù)堿基，常用的HindIII也要三個。 13目的基因獲得目的基因獲得一、從已有載體上截取 所選擇的克隆位點必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點 二、PCR法 1、 無內(nèi)含子，可用基因組DNA為模板，有內(nèi)含子則用cDNA。 2、若PCR

7、難度很大，宜將PCR產(chǎn)物連到克隆載體上，測序后，再酶切連接到表達(dá)載體上。不推薦直接酶切PCR產(chǎn)物。 3、在加loading buffer前，可取出幾微升，作為二擴(kuò)模板。 4、設(shè)退火溫度梯度，多做幾管?；厥諘r損失大半。 5、盡管PCR產(chǎn)物只有一條特異帶，電泳挖取目標(biāo)帶也是必要的。三、人工化學(xué)合成 最后的選擇。公司會將合成片段連入克隆載體。需測序驗證。14基因工程所用的酶基因工程所用的酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶從商品目錄上得到有關(guān)信息從商品目錄上得到有關(guān)信息GAATTCCTTAAGEcoR IGCTTAA5p5pCTGCAGGACGTCPst ICTGCAG5p5p3OH3OH3OH3OH注意：注

8、意：1、不同公司的酶，其緩沖液有時是不同的；、不同公司的酶，其緩沖液有時是不同的；2、同一公司的酶，使用相同的緩沖液或不同的緩沖液而、同一公司的酶，使用相同的緩沖液或不同的緩沖液而 不顯著影響酶活性時，可同時做雙酶切。不顯著影響酶活性時，可同時做雙酶切。3、一種酶可能有幾種緩沖液。、一種酶可能有幾種緩沖液。CCCGGGGGGCCCSma I16酶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)酶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)酶活單位：酶活單位：酶量，時間酶量，時間酶的濃度：酶的濃度：10 units/uL; 20 uints/uL等等保存條件保存條件: -20-30 切割位點：切割位點：有無其他活性有無其他活性酶切體系酶切體系: buffer及與其它

9、酶雙切的及與其它酶雙切的buffer等等所用底物：所用底物： DNA量，切后再連接的程度量，切后再連接的程度反應(yīng)溫度：反應(yīng)溫度：一般為一般為37,但許多酶對溫度有特殊要求但許多酶對溫度有特殊要求甲甲 基基 化化：星星 活活 性性: 所加酶量過多所加酶量過多保護(hù)堿基保護(hù)堿基:怎樣使用公司目錄怎樣使用公司目錄不同酶的反應(yīng)緩沖液及活性不同酶的反應(yīng)緩沖液及活性雙酶切雙酶切酶切后具有共同的粘性末端酶切后具有共同的粘性末端17核酸酶操作注意事項核酸酶操作注意事項 通常，不同公司出產(chǎn)的內(nèi)切酶，它的菌株來源、制備工藝、純度及活力、酶切活性的優(yōu)化等都可能存在不同，試劑公司會對自己的內(nèi)切酶進(jìn)行比較全面的分析。因此

10、，說明書及目錄中的技術(shù)資料是最具有針對性的資料。注意事項： a. 內(nèi)切酶如無特殊要求，應(yīng)該保存在-20-30度。 溫度過低：酶會凍結(jié)，反復(fù)凍融，降低酶活 溫度過高： b. 酶在使用時應(yīng)置于冰盒中取酶。 不可用手捏管底部 移液器吸取時，酶管不可離開冰面。 c. 酶使用完后應(yīng)盡快旋緊蓋子。 d. 吸取酶時的tips，最好是長些。 18內(nèi)切酶內(nèi)切酶bufferbuffer鹽離子低-中-高通用promegaABCDTaKaRa LMHKNEB12341、雙酶切時注意buffer的選擇；2、酶在非最優(yōu)buffer中的活性會降低，應(yīng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時間。 19一）酶切不開或酶切不完全一）酶切不開或酶切不完全

11、 ？1 1、質(zhì)粒不純：、質(zhì)粒不純： 雜蛋白（A260/A2801.8 ）；抑制劑（酚、鹽、乙醇 ）2 2、酶失活：、酶失活： 有過期時間（能有效酶切，可繼續(xù)使用 ）；存放、使用不當(dāng)3 3、bufferbuffer： 是否充分化融；雙酶切4 4、保護(hù)堿基：、保護(hù)堿基：5 5、甲基化：、甲基化： 甲基化缺陷的菌株 20二）酶切后電泳時出現(xiàn)二）酶切后電泳時出現(xiàn)smearsmear？1 1、內(nèi)切酶含量過高、內(nèi)切酶含量過高 內(nèi)切酶含量酶切體系的10 2 2、星活性：、星活性： 甘油濃度、離子濃度、反應(yīng)溫度、酶含量、反應(yīng)時間 3 3、污染：、污染： 其它的DNA、其它的內(nèi)切酶或DNA酶 2122過柱法回收

12、過柱法回收1 1、PCRPCR產(chǎn)物帶產(chǎn)物帶 2 2、酶切片段、酶切片段 注意：1） 電泳的帶要亮：要求電泳的帶要亮：要求PCR體系、酶切體系要大。體系、酶切體系要大。2） 柱子上的樹脂吸附能力有限柱子上的樹脂吸附能力有限3）盡量讓酒精等揮發(fā)徹底，以免影響后續(xù)的連接反應(yīng)。盡量讓酒精等揮發(fā)徹底，以免影響后續(xù)的連接反應(yīng)。4）凝膠回收試劑盒是否失效（鹽離子濃度：）凝膠回收試劑盒是否失效（鹽離子濃度：KI）5）洗脫液體積一定大于臨界值。預(yù)熱。洗脫液體積一定大于臨界值。預(yù)熱。2324連接反應(yīng)連接反應(yīng)1 1、連接方法、連接方法 1）4 ，2-3d：酶活低，粘性末端的氫鍵結(jié)合穩(wěn)定 2）37 ，2hr：酶活高，

13、氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定。5ligation buffer 3 3）16 16 ，過夜：，過夜：發(fā)揮酶活性，兼顧粘性末端短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定2 2、反應(yīng)體系、反應(yīng)體系 10 ligation buffer1.0 LT4 ligase（5U/L）0.2 L載體片段目的片段滅菌的雙蒸水補(bǔ)足到10.0L25注意： 1、 一定要檢測回收效果，帶亮（濃度高）方可用于下一步連接帶亮（濃度高）方可用于下一步連接。 通常，重組分子只有幾十萬分之一。通常，重組分子只有幾十萬分之一。 回收片段中無酒精等影響連接的殘留回收片段中無酒精等影響連接的殘留。 2、將目標(biāo)片段、載體片段的泳道相鄰，根據(jù)亮度估測其濃度。 連接時，目的：載

14、體=3：1（分子個數(shù)） 別忘記長片段插入的EB多。分子個數(shù)一樣多時，長片段更亮。 3、 如果是單酶切，為了防止載體自身環(huán)化，可以用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）處理，去掉酶切后5端的磷酸。 酶切結(jié)束，向酶切體系中加入1.0L CIP，37 0.5-1hr即可。 4、 對照質(zhì)粒生長，而連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化不成功，這說明你的連接是不成功。 5、連接液不能反復(fù)多次凍溶，因為里面含有連接液不能反復(fù)多次凍溶，因為里面含有ATP。建議不要使用生產(chǎn)日期不明的連接酶和連接液（看似很會過日子，實際是個敗家子）。2627熱激轉(zhuǎn)化熱激轉(zhuǎn)化1. 手持冰盒到-80 冰箱前，取出感受態(tài)管，插入冰中。2. 手指捏感受態(tài)管底2-4sec

15、使其融化后，加入連接產(chǎn)物，槍尖溫和攪勻，于冰上30min。3. 42水浴90sec（一定要準(zhǔn)確，不要時間過長一定要準(zhǔn)確，不要時間過長）。4. 冰浴min后，加入800L的的LB在37 振蕩3045min。5. 取200L涂布于含Amp(50g/mL)等相應(yīng)抗生素的抗生素的 平板平板， 37培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果6. 將150mL錐形瓶中放入510mL培養(yǎng)基，加入抗生素培養(yǎng)基，加入抗生素，挑取菌斑，250轉(zhuǎn)/min振蕩培養(yǎng)過夜。（搖菌前可先做菌液PCR）7. 提取質(zhì)粒，電泳，酶切28重組質(zhì)粒篩選重組質(zhì)粒篩選1 1、抗生素篩選法、抗生素篩選法 2 2、互補(bǔ)法、互補(bǔ)法 藍(lán)白斑篩選： PUC系列載體含有半

16、乳糖苷酸基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭個氨基酸偏碼區(qū)。 DH5含編碼半乳糖苷酶端的序列。3 3、PCRPCR、酶切、酶切 29質(zhì)粒提取：堿裂解法質(zhì)粒提?。簤A裂解法收獲細(xì)菌：含有質(zhì)粒的DH5、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。溶液： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖溶液： NaOH, SDS 冰上3-5min，時間過長會： 質(zhì)粒斷裂；羥基化影響酶切溶液：乙酸鉀，冰乙酸 迅速顛倒3次混勻后，置于冰上TER： （ TE，pH 8.0，含RNase 20g/mL） 去除RNA30質(zhì)粒純化：質(zhì)粒純化：1、PEG純化純化 缺點：搖菌液幾百毫升，耗時長，步驟繁多 優(yōu)點：質(zhì)粒純度高（不含線狀DNA） 濃度大2、過柱法：、過柱法： 缺點：柱子吸附能力