AKTA蛋白純化系統(tǒng)操作

1、AKTA蛋白純化系統(tǒng)操作AKTA蛋白純化系統(tǒng)是當(dāng)前蛋白純化工作經(jīng)常用到的一組設(shè)備，自動(dòng)化程度很高。AKTA系統(tǒng)依據(jù)不同的配置，可以分為 AKTA EXPLORERAKTA PILOTAKTA PURIFIER多種型號(hào)的設(shè)備。 以下以AKTA EXPLORE的例簡(jiǎn)單介紹AKTA蛋白純化系統(tǒng)的一般操作。1、認(rèn)識(shí)AKTAAKTA explorer是為方法開(kāi)拓及研究應(yīng)用而設(shè)計(jì)的全自動(dòng)液相色譜系統(tǒng)。該色譜系統(tǒng)的分離裝置有三個(gè)主要組件，在底部平臺(tái)的左側(cè)整齊堆起（ Fig 1）。它們是：FIG 1、AKTA EXPLORER機(jī)? Pump-900為雙通道高效梯度泵系列。 在AKTAexplorer 100,

2、流速范圍0.01-100 ml/min , 壓力高達(dá)10 Mpa （泵名為 P-901）。在 AKTA explore10，流速范圍 0.001-10 ml/min ,壓力高 達(dá) 25 Mpa （泵名為 P-903）。? Monitor UV-900,同時(shí)監(jiān)控 190 700 nm范圍內(nèi)高達(dá) 3個(gè)波長(zhǎng)的多波長(zhǎng)紫外-可見(jiàn) （UV-Vis）監(jiān)測(cè)器。（針對(duì)部分 AKTA PURIFIE朗型，尚有UPC-900監(jiān)測(cè)器可供選擇，光源為 汞燈光源，一次可以監(jiān)控一個(gè)波長(zhǎng)，安裝濾光片后，可以在選擇的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行切換。）? Monitor pH/C -900，在線電導(dǎo)和pH監(jiān)測(cè)的組合監(jiān)測(cè)器。AKTA expl

3、orerFig 2、AKTA EXPLORE硬件模式圖AKTA EXPLORER統(tǒng)的主要組成部件可以用模式圖表示（Fig 2）。組成部件，如混合器、柱及不同的閥安裝在右邊部分。打開(kāi)裝閥的門(mén)可全部看到。柱被掛在裝閥的門(mén)的外側(cè)。分離裝置由UNICORN軟件控制。軟件安裝于一獨(dú)立的電腦主機(jī)之中，在電腦與色譜系 統(tǒng)之間的通信由數(shù)據(jù)采集裝置CU950進(jìn)行控制。2、一般操作2.1開(kāi)機(jī)按位于底部平臺(tái)前左側(cè)的 ON/OFF按鈕，打開(kāi)色譜系統(tǒng)，然后打開(kāi)電腦電源。待儀 器自檢完畢（CU950上面的3個(gè)指示燈完全點(diǎn)亮并不閃爍）。雙擊桌面上UNICORN圖標(biāo), 進(jìn)入操作界面。UNICORN的操作界面分為四個(gè)窗口 （

4、Fig 3）Fig & Unicorn的操作界面2.2準(zhǔn)備工作溶液和樣品所有的工作溶液和樣品必須經(jīng)過(guò)0.45的濾膜過(guò)濾，樣品也可高速離心后取上清備用。當(dāng)緩沖液中含有有機(jī)溶劑（如乙睛、甲醇），需在使用前用低頻超聲脫氣10min。2.3清洗及管道準(zhǔn)備首先將A泵的進(jìn)液管道（A1）放入緩沖液或平衡液中，將 B泵的進(jìn)液管道（B1）放入 高鹽溶液中，在 system control窗口點(diǎn)擊工具欄內(nèi)的 manual, 選擇 pumppump wash explorer,選中A1,B1管道為ON, execute。泵清洗將自動(dòng)結(jié)束。 （Fig 4）Fig 4、AKTA Explorer的泵清洗操作2.

5、4安裝層析柱在 manual里選擇 pumpflow rate，輸入一定的低流速 （ Fig 5）, insert;選擇 Alarm&mon alarm pressure，設(shè)置high alarm （輸入填料或?qū)游鲋哪褪軌毫?，以較低 者為設(shè)置值，具體可在填料說(shuō)明書(shū)或?qū)游鲋f(shuō)明書(shū)中查到），insert, execute （Fig 6）<待InjectionValve的1號(hào)位管道流出水后接入柱子的柱頭，稍微擰緊后將柱下端的堵頭卸掉接入管道連上紫外流動(dòng)池。Fig 5 AKTA Explorer的流速設(shè)定操作Fig 6 AKTA Explorer的限壓設(shè)定操作2.5開(kāi)始純化：1）在柱子

6、平衡好之后（電導(dǎo)， pH的數(shù)值和變化趨勢(shì)穩(wěn)定）即開(kāi)始上樣了。此時(shí)應(yīng) 將紫夕卜調(diào)零（Fig 7），選擇 Alarm&mon autozero , exectue。Fig 7、AKTA Explorer的紫外調(diào)零操作2）具體上樣方式：AKTA系統(tǒng)的上樣方式比較靈活，可以根據(jù)具體樣品的條件進(jìn)行 上樣，包括用樣品環(huán)上樣、用系統(tǒng)泵上樣、用樣品泵上樣等，這里以用系統(tǒng)泵上樣為例簡(jiǎn)單介紹上樣過(guò)程。點(diǎn)擊pause,將A1放入樣品中，點(diǎn)擊 countine ,待樣品上完后，再將A1放入到平衡液中繼續(xù)清洗柱子。3） 洗脫：上樣后用緩沖液盡量將穿透峰洗回基線。在manual里選擇pumpgradient,按照

7、自己的工藝選擇 targetB (100%)和 length (10CV (Fig 8)。Fig & AKTA Explorer的洗脫條件設(shè)定操作4)設(shè)定收集：選擇 Frafractionation_900，輸入每管收集體積，exectue (Fig 9)。結(jié)束固定體積收集選擇Frafractionation_stop_900 , exectue (Fig 10)。Fig 9K AKTA Explorer的組分收集設(shè)定操作Fig 10、AKTA Explorer的組分收集停止設(shè)定操作5) 清洗泵及卸下層析柱：將A1和B1入口放入純水中，啟動(dòng) pump wash purifier功能沖洗

8、 A泵和B泵及整個(gè) 管路。然后再將A1和B1入口放入20%乙醇中，同樣操作將乙醇沖滿整個(gè)管路保存。再給柱子一個(gè)慢流速，設(shè)置系統(tǒng)保護(hù)壓力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的時(shí)候?qū)⒍骂^ 擰上，再拆柱子的上端，最后擰上上端的堵頭。整個(gè)過(guò)程中應(yīng)防止氣泡進(jìn)入。6) 關(guān)閉電源：從軟件控制系統(tǒng)的第一個(gè)窗口unicorn manager點(diǎn)擊退出，其他窗口不能單獨(dú)關(guān)閉。然后關(guān)閉AKTA主機(jī)電源，關(guān)閉電腦電源。3、程序設(shè)定操作在method editor窗口點(diǎn)擊工具欄內(nèi)的method wizard，彈出窗口界面如 Fig 11所示，可以分別在 main selection、column以及column positio

9、n三個(gè)下拉菜單中選擇所要用到的層析方法、所用到的層析柱的參數(shù)以及所安裝的層析柱在柱位選擇閥的位置，選好之后，點(diǎn)擊next按鈕進(jìn)入下一步波長(zhǎng)和溶液進(jìn)口的設(shè)定（Fig 12）,在此可以設(shè)定檢測(cè)的波長(zhǎng)，針對(duì)AKTAEXPLORE時(shí)以一次選擇三個(gè)波長(zhǎng)共同進(jìn)行監(jiān)控，并在此設(shè)定A泵和B泵的溶液進(jìn)口，設(shè)定好之后，點(diǎn)擊next，出現(xiàn)如Fig 13所示窗口，可以在此設(shè)定對(duì)層析柱進(jìn)行平衡的條件。Fig 11Fig 12Fig 13Fig 14完成之后，點(diǎn)擊 next出現(xiàn)Fig 14的窗口，在此可以設(shè)定上樣的條件，可選擇的條件包 括上樣的方式，如上樣環(huán)上樣以及樣品泵上樣，對(duì)上樣的體積也要進(jìn)行設(shè)定。如果利用系統(tǒng)泵上樣

10、，在此無(wú)法進(jìn)行設(shè)置，不過(guò)可以利用A泵和B泵的兩個(gè)進(jìn)口在后面的步驟中進(jìn)行設(shè)置。在上步設(shè)置完成之后，點(diǎn)擊NEXT出現(xiàn)如Fig 15所示窗口，這里是針對(duì)流穿組分收集所進(jìn)行一些設(shè)置，針對(duì)安裝的不同的收集器，具體內(nèi)容可能有些差異，這里顯示的界面是在安 裝了 Frac-950收集器之后所出現(xiàn)的界面，設(shè)置完成點(diǎn)擊NEXT出現(xiàn)如Fig 16所示的窗口，設(shè)置目標(biāo)組分收集的一些參數(shù)，點(diǎn)擊NEXT,出現(xiàn)如Fig 17所示的窗口，針對(duì)具體的洗脫條件可以進(jìn)行設(shè)置。當(dāng)全部設(shè)置完成之后，點(diǎn)擊finish，彈出Fig 18所示的窗口，可以再一次對(duì)所進(jìn)行的設(shè)置進(jìn)行進(jìn)一步的修改，完成之后點(diǎn)擊 里L(fēng)按鈕，完成程序存盤(pán)操作。至此完成

11、洗脫程序的設(shè)定工作，在應(yīng)用自動(dòng)洗脫程序時(shí)， 可在SYSTEM CONTROL口點(diǎn)擊文件菜單欄中的 FILARun, 在彈出的對(duì)話框中選擇目標(biāo)洗脫程序所在的位置并執(zhí)行，之后會(huì)依次彈出一些對(duì)話框， 主要是再次確認(rèn)程序的設(shè)置條件， 并選擇洗脫結(jié)果文件的保存位置， 全部設(shè)置完之后，洗脫將自 動(dòng)進(jìn)行，結(jié)果將自動(dòng)的保存在設(shè)定的文件夾中。KTTli tj-K Ml k- Li. ft lb« EWJ-iL FaIpiIElui【虹+3 ap|iLiii E2 CflFracTWtri "上i I - ?醇1 nFig 16Fig 15 iil L*vLh Lli -IV"I i

12、Uta* r4Btafl uR CbB<R £. fl-t* S tf>dl IlLap FjTgdV I kEOn-Hb ba«t mtL» 砒 an* q b cnHfetM4wJ.l.hraii-n alWsr UhIi* 白 CPJdx %<! *!Fig 18Fig 174、結(jié)果的瀏覽與簡(jiǎn)單處理在純化完成后，Unicorn軟件會(huì)自動(dòng)的按照預(yù)先的設(shè)置保存結(jié)果文件，如果沒(méi)有指定，那么結(jié)果文件會(huì)保存于一個(gè)文件名以manual N開(kāi)頭的文件中，N為系統(tǒng)依次生成的一個(gè)1-10之間的數(shù)字。對(duì)于結(jié)果的瀏覽應(yīng)在 evaluation窗口（ Fig 19

13、）中進(jìn)行，打開(kāi)文件及對(duì)文件進(jìn)行普通編 輯的菜單如Fig 20所示。r* 遙，ci# i-JJt+T昔理 呂吁圳據(jù)利艾字H”心圖MM提、-，,，親 <bicn ilQ9wLi-»<x£.LriMt k”.E (ifefli HnpwYOvivViilWi: ana1! Uvfct"PFFig 20純化結(jié)果普通編輯菜單這里已經(jīng)選擇了一個(gè)純化文件， 可以彈出如Fig 21所示的操作菜單， 軸或縱軸的顯示區(qū)間，進(jìn)行文本文件的編輯等等。在結(jié)果瀏覽窗口點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，選擇properties , 如改變曲線的顏色，設(shè)定橫打開(kāi)后，可以分別對(duì)結(jié)果進(jìn)行編輯,選擇或設(shè)器瀏覽

14、內(nèi)容】口人H、Fig 21Hradri.1%： LCwvt Nioks; I加 E FYi：.|X Axii：XTI選殲曲戲PeakTabl#:設(shè)定飄分表內(nèi)容Curve Style d colcrnr ：ll|-1.找形及領(lǐng)色Et Test潟雄tM牢Lavout Library:保有刻翼橋式4、AKTA蛋白純化系統(tǒng)的日常維護(hù)4.1每天，當(dāng)實(shí)驗(yàn)完成系統(tǒng)使用結(jié)束后，應(yīng)盡可能避免保存于緩沖液中過(guò)夜，尤以高鹽濃度洗脫緩沖液為甚！假如，不能避免，則緊記次日盡早用 System Wash Method 完成以蒸儲(chǔ)水將系統(tǒng)徹底清洗，再予以保存或再更新使用其它緩沖液，再次投入使用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。用蒸£留水將余下的緩沖液徹底沖洗出系統(tǒng)，這步驟至關(guān)重要。此 舉不但可以避免緩沖液對(duì)系統(tǒng)造成腐蝕機(jī)會(huì)，甚或因使用高鹽濃度緩沖液保存過(guò)久