論TSA對甲狀腺鱗癌細胞株SW579增殖的影響

1、論 TSA對甲狀腺鱗癌細胞株SW579增殖的影響摘要：目的 探討曲古抑菌素A（trichostatinA， TSA）對甲狀腺鱗癌細胞株SW579生長增殖的影響。方法分別以終濃度為25、50、 100、200、400nmol/L的 TSA作用于SW579細胞株，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)變化；采用四甲基偶氮唑藍比色法（MTT）檢測細胞的體外增殖、吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)及細胞凋亡、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率的改變。結(jié)果TSA作用后對細胞的增殖有抑制作用；吖啶橙染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有典型的凋亡小體生成；流式細胞儀分析凋亡率隨TSA濃度的升高而升高 (P ) 。結(jié)論 不同濃度的 TS

2、A可抑制 SW579細胞增殖，促進細胞凋亡，且呈劑量依賴性。關(guān)鍵詞：曲古抑菌素 A 甲狀腺鱗癌細胞增殖細胞凋亡曲古抑菌素 A(Trichostatin A，TSA)源自鏈霉素代謝產(chǎn)物，是一種氧肟酸類非競爭性可逆的組蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylase ，HDAC)抑制劑，也是四大類 HDAC抑制劑的代表藥物之一。有研究表明， HDAC抑制劑 TSA和丁酸鈉均可使人結(jié)腸癌細胞系 SW1116和人直腸癌細胞系 Colo-320 的細胞周期阻滯于G1期。TSA在低于微摩爾濃度時即可通過提高 p21waf1 的轉(zhuǎn)錄阻滯細胞周期、 誘導細胞凋亡，以抑制胰腺癌細胞的生長， TSA還可活

3、化胰腺癌細胞系 BxPC-3和 MIA PaCa-2 中的轉(zhuǎn)化生長因子 受體 II(T RII) 。TSA可在體外抑制人肝癌細胞系 HepG2細胞增殖，使 Huh-7 細胞的細胞周期阻滯于 G0 G1期并誘導凋亡。另外，人們在對人類膀胱癌細胞 T24 的研究中發(fā)現(xiàn)，HDAC抑制劑 SAHA可誘導 CDK抑制因子 P21/WAF1的轉(zhuǎn)錄，從而使癌細胞停止增殖，趨向分化。已有研究報道TSA對肝癌、胃癌、宮頸癌、前列腺癌及神經(jīng)母細胞瘤等多種腫瘤細胞具有抗腫瘤作用1，但對甲狀腺癌細胞的影響國內(nèi)外研究甚少， 對甲狀腺鱗癌尚無報道。本研究旨在探討 TSA對甲狀腺鱗癌細胞株 SW579細胞增殖與凋亡的影響。

4、1 材料與方法主要試劑與儀器TSA (SIGMA公司 ) 用二甲基亞砜（ DMSO）充分溶解，配成 4×10-4mol/L的貯備液， - 20 避光保存。使用時用細胞培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。AnnexinVFITC 凋亡檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司；L15 培養(yǎng)液 (SIGMA公司產(chǎn)品 ) 按照說明用三蒸水配置，100 U/mL青霉素、 100 g/mL 的鏈霉素，調(diào)整 pH 值至， m微孔濾器無菌過濾， 4 冰箱保存。使用前加入 10% 的胎牛血清。四甲基偶氮唑藍（ SIGMA公司）；倒置顯微鏡 (JAPAN OLYMPUS TOKYO)、流式細胞儀 ( 美國貝克曼庫爾特有限公

5、司 ) 、熒光顯微鏡 (JAPANOLYMPUSTOKYO)L15 培養(yǎng)液（ SIGMA公司）； Multiskan Ascent 自動酶標檢測儀。細胞培養(yǎng)及實驗分組甲狀腺鱗癌細胞株SW579購自上海生命科學院細胞和生物化學研究所。該細胞株在 L15 培養(yǎng)液中、飽和濕度、 37 、無 CO2 孵箱中培養(yǎng)。當細胞匯合至培養(yǎng)瓶底面積 80%左右時進行傳代培養(yǎng)。以 105/mL 濃度接種于 25 cm2的培養(yǎng)瓶中，24 h 待細胞貼壁后細胞處于對數(shù)生長期時給藥， 使 TSA終濃度分別為 25 、 50 、 100 、 200、400 nmol/L ，加入最大溶解劑量的 DMSO為對照組 DMSO濃度

6、小于 %(V/V)，對細胞生長無影響 。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)在藥物處理后 48 h 后取出培養(yǎng)瓶，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化，并拍攝記錄細胞形態(tài)。MTT法檢測細胞生長抑制率取對數(shù)生長期的細胞按1×105/L接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中， 每孔200 L，實驗組分別加入不同濃度的TSA20 L ( 終濃度分別為 25、50、100、200、400 nmol/L) ，對照組加入最大溶解劑量的DMSO，每組設(shè) 8 個平行孔。 置于 37 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，作用48 h后，每孔加入20 l MTT 液(5 g/L，以PBS緩沖液配制 ) ，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，棄上清，每孔再加入二甲基亞

7、砜 (DMSO)150 L，震蕩 10 min，用 DG-3033型酶聯(lián)免疫檢測儀測定 490 nm吸光度 (A) 值。用下面的公式計算抑制率。抑制率 ( )=(1- 實驗組 A 值/ 對照組 A)×100%。熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況取對數(shù)生長期的細胞按1×106/L 接種于 24 孔細胞培養(yǎng)板中， TSA作用48 h后，取出培養(yǎng)板，去除培養(yǎng)液，用PBS洗細胞2 3 次， 95%酒精固定1520 min ，倒出酒精后用PBS再洗，加入1%冰醋酸作用30 秒，倒出冰醋酸用PBS洗，用 %的吖啶橙染色 15 min，倒出吖啶橙，用PBS洗后置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。流

8、式細胞儀檢測細胞凋亡率不同濃度組的 TSA作用 48 h 后，取出培養(yǎng)瓶，去除培養(yǎng)液，加入 2 mL 消化液消化 1 min 左右，加入 5 mL 培養(yǎng)液，用吸管反復吹打成單細胞懸液，記數(shù)后收集細胞于離心管中， 1 000 rmp 離心 5 min ，參照試劑盒說明，用 4 預冷的 PBS洗細胞 2 次，將細胞重懸于 250 L BindingBuffer ，調(diào)節(jié)其濃度為106/mL，取 100 L 的細胞懸液于 5 mL 流式管中，加入 5 L AnnexinV FITC 和 10 L、20 g/mL PI ，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng) 15 min，加入 400 L PBS 后上流式細胞儀檢測

9、。統(tǒng)計學處理實驗所得數(shù)據(jù)以±s 表示，應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P具有顯著性意義， P具有極顯著性意義。2結(jié)果TSA 對細胞形態(tài)特征的影響不同濃度 TSA作用于 SW579細胞后，與對照組相比，細胞生長速度變慢，在對照組中成多角形及梭形的細胞經(jīng)TSA處理后可見細胞貼壁延遲、回縮， TSA 的濃度越高，回縮越明顯；再增加TSA濃度至在 800 nmol/L 時，細胞大部分都回縮成球形， 細胞很快死亡， 如圖 1 所示。 A對照組 BTSA 濃度為 25 nmol/LCTSA 濃度為 100 nmol/LDTSA 濃度為 400 nmol/L 圖 1倒置顯微鏡下細胞的形態(tài)

10、（×100）SW579細胞生長抑制率檢測結(jié)果TSA 各濃度組細胞生長抑制率見表1。表1TSA 對 SW579細胞生長抑制率的影響 TSA終濃度表示與對照組相比，P； #表示與前一組相比， PSW579細胞株經(jīng)不同濃度TSA作用后，各組細胞抑制率隨著藥物濃度的升高而升高（ P），說明 TSA可抑制細胞生長，且呈劑量依賴性。熒光顯微鏡下細胞凋亡檢測結(jié)果吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng) TSA處理的各組細胞均可見染色質(zhì)的濃集和邊集，核膜出芽及凋亡小體等現(xiàn)象；TSA濃度越高，染色質(zhì)的濃集和邊集越明顯，核膜出芽及凋亡小體越多，如圖2 所示。A對照組 BTSA 濃度為 25 nmol/LCT

11、SA 濃度為 100nmol/LDTSA 濃度為 400 nmol/L圖 2 熒光顯微鏡下細胞的凋亡（× 200） 細胞凋亡率的檢測結(jié)果該細胞株經(jīng)不同濃度 TSA作用后，與對照組相比， 各組細胞凋亡率顯著升高，并隨著 TSA濃度的升高而升高， P，如表 2 所示。表 2不同濃度 TSA作用下的細胞凋亡率表示與對照組相比， P； #表示與前一組相比， P3討論近年的研究顯示 2，表觀遺傳修飾調(diào)控基因表達主要包括DNA的甲基化和組蛋白乙酰化。近幾年，人們才對組蛋白乙酰化的機理有所理解。 HDAC抑制劑主要是通過改變組蛋白的乙酰化程度來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)， 從而達到調(diào)控基因表達的作用，其主要生

12、物效應(yīng)包括誘導腫瘤細胞分化、 細胞周期阻滯和細胞凋亡。TSA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有抑制腫瘤細胞生長的組蛋白去乙?；敢种苿?3，能抑制多種腫瘤細胞生長， 誘導其細胞分化和凋亡， 但具體作用機制還尚未完全明確。MTT是評價細胞增殖的重要指標，本研究中通過MTT、熒光顯微鏡與流式細胞儀的檢測方法從抑制細胞生長增殖與促進凋亡的角度來觀察 TSA對 SW579 細胞株的作用情況。結(jié)果顯示：在 25400 nmol/L 濃度范圍內(nèi)，隨著 TSA濃度的升高，細胞生長抑制率和凋亡率均明顯升高， 且呈劑量依賴性， 顯微鏡下觀察與對照組相比，細胞生長速度變慢，在對照組中成多角形及梭形的細胞經(jīng) TSA 處理后可見

13、細胞貼壁延遲、回縮， TSA 的濃度越高，回縮越明顯；熒光顯微鏡下各組細胞均可見染色質(zhì)的濃集和邊集， 核膜出芽及凋亡小體等現(xiàn)象； 當 TSA濃度達到 400 nmol/L 時，細胞生長抑制率可達 %，凋亡率幾近 50%，在熒光顯微鏡下也可見明顯的凋亡特征，但再提升 TSA濃度至 800 nmol/L 時，細胞幾近死亡。本實驗結(jié)果表明， TSA對 SW579細胞株抑制增殖作用可能主要是通過誘導細胞凋亡而起作用的，且最適濃度在 25400 nmol/L 范圍內(nèi)。 Greenberg VL 等研究表明4TSA能抑制甲狀腺癌細胞株生長、 促進其凋亡，阻滯細胞周期于 G1和 G2/M 期，同時增加 p2

14、1(Cip1/WAF1) 及 p27 Kip1 的表達，抑制 cyclins A 、 B 的表達。其作用是通過激活 caspase 級聯(lián)反應(yīng)，阻滯細胞周期及抑制細胞周期依賴性蛋白激酶活性來實現(xiàn)的。 Zarnegar R 等 5用曲古抑菌素 A 觀察 3 種甲狀腺癌細胞株 TPC-1、XTC-1、 FTC-133131I 的攝取，發(fā)現(xiàn)能明顯提高 NISmRNA的表達，并且同時 PDSmRNA轉(zhuǎn)錄減少。增加了放射性碘在腫瘤的滯留， 碘攝取增強。 另有研究表明6，組蛋白去乙酰酶抑制劑亦能在顯著增加 NIS mRNA的表達的同時，增加 5脫碘酶，從而增加甲狀腺癌細胞的攝碘，促進甲狀腺癌細胞的再分化。有

15、關(guān) TSA對甲狀腺鱗癌 SW579細胞株生長增殖及細胞凋亡的作用機制還有待于進一步深入研究?！緟⒖嘉墨I】1 Alao JP，LamEW，Ali S，et deacetylaseinhibitortrichostatinA repressesestrogen receptoralpha-dependenttranscriptionand promotesproteasomal degradationof cyclinD1 in humanbreast carcinoma celllines J .Clin Cancer Res ，20XX，10(23) ： 8094-8104.E，Wolffe

16、specific gene repression J.Eur J Biochem，2Ballestar20XX，268(1) ： 1-6.3 Curtin M ，Glaser deacetylase inhibitors：the Abbott experience J .Curr Med Chem ，20XX，10(22) ：2373-22.4 Greenberg VL，Williams JM，Cogswell JP，et al. Histone deacetylase inhibitors promote apoptosis and differential cell cycle arrest inanaplastic thyroid cancer cellsJ.Thyroid ，20XX，11(4) ：315-325.5 Zarnegar R ， Brunaud L ，Kanauchi H ，et the effectiveness ofradio