HA-HI試驗(yàn)在家禽免疫監(jiān)測(cè)中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)教學(xué)探討

1、    ha/hi試驗(yàn)在家禽免疫監(jiān)測(cè)中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)教學(xué)探討    張濟(jì)培陳濟(jì)鐺陳建紅司興奎摘要：本文就紅細(xì)胞凝集（ha）與紅細(xì)胞凝集抑制（hi）試驗(yàn)（微量法）在家禽新城疫等疫病免疫監(jiān)測(cè)中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)課教學(xué)的若干方面，包括課程題目、教學(xué)目的、教學(xué)內(nèi)容、實(shí)驗(yàn)用材、操作關(guān)鍵、結(jié)果判斷、誤差規(guī)避、指導(dǎo)接種、時(shí)間安排等，談?wù)勛约憾嗄陙斫谈牡奶接憽Ⅲw會(huì)，以期達(dá)到改善本實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)效果，提高教學(xué)效率，貼近生產(chǎn)實(shí)際，加強(qiáng)生產(chǎn)指導(dǎo)作用等目的。關(guān)鍵詞：雞新城疫;免疫監(jiān)測(cè);實(shí)驗(yàn)課;教改：g642.0     文獻(xiàn)標(biāo)志碼：a 

2、60;   ：1674-9324（2019）13-0278-03我國嚴(yán)重危害家禽健康且病原具有血凝性的病毒性傳染病，在上世紀(jì)80年代初期之前，主要是雞新城疫1;80年代中期至90年代初期增加了鴿瘟（又稱鴿新城疫，鴿i型副粘病毒病）、產(chǎn)蛋下降綜合征、h9亞型禽流感等2，3，90年代中期之后，再增加了h5亞型禽流感、h7亞型禽流感等和水禽新城疫（也有稱水禽副粘病毒病，鵝副粘病毒病，鴨副粘病毒?。７揽厣鲜鲆卟〉年P(guān)鍵方法之一是，實(shí)施特異免疫接種和免疫監(jiān)控。而監(jiān)控免疫效果的有效方法是ha（紅細(xì)胞凝集）與hi（紅細(xì)胞凝集抑制）試驗(yàn)。ha與hi技術(shù)對(duì)于正確指導(dǎo)禽群的雞新城疫、鴿瘟、禽流

3、感、產(chǎn)蛋下降綜合征等重要疫病的常規(guī)免疫接種、加強(qiáng)接種和緊急接種具有重要的作用。筆者經(jīng)常進(jìn)行本技術(shù)的實(shí)驗(yàn)課教學(xué)，并不斷在解決教學(xué)難點(diǎn)、疑點(diǎn)，改善教學(xué)效果、提高教學(xué)效率、貼近生產(chǎn)實(shí)際、加強(qiáng)生產(chǎn)指導(dǎo)作用等方面進(jìn)行思考，積累了一些心得，謹(jǐn)陳述如下，以供參考。一、關(guān)于本實(shí)驗(yàn)課的題目病原具有血凝性的家禽病毒性傳染病，除雞新城疫，尚有鴿瘟、水禽新城疫、禽流感和產(chǎn)蛋下降綜合征等。上述各種傳染病均可應(yīng)用hi試驗(yàn)（微量法）進(jìn)行免疫監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)術(shù)式大同小異。2004年以前，本校在進(jìn)行雞新城疫免疫監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)過程中，穿插提及鴿瘟、水禽新城疫、禽流感和產(chǎn)蛋下降綜合征等的免疫監(jiān)測(cè)要點(diǎn)。2005年以后，本校禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大

4、綱將“雞新城疫免疫監(jiān)測(cè)”課題名稱改為“禽具血凝性病毒病的免疫監(jiān)測(cè)以新城疫免疫監(jiān)測(cè)為例”，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書中的必要環(huán)節(jié)，提示各種疫病免疫監(jiān)測(cè)技術(shù)的不同要點(diǎn)，以期提高本實(shí)驗(yàn)課的信息容量。實(shí)驗(yàn)課題作了上述修改后，在實(shí)驗(yàn)課開始時(shí)，要著意解題，講明何謂免疫監(jiān)測(cè)，具有血凝性的病毒病主要包括哪些，本試驗(yàn)以何種病的免疫監(jiān)測(cè)為例等，以引起學(xué)生的注意。二、關(guān)于本實(shí)驗(yàn)課目的要求本實(shí)驗(yàn)課的目的與要求，通常只著重于“掌握雞新城疫免疫監(jiān)測(cè)的方法紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)與紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)”，這樣對(duì)于學(xué)生在獸醫(yī)專業(yè)基礎(chǔ)課上已學(xué)過的“紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)與紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)”知識(shí)，未能給以明顯的提升、發(fā)展。實(shí)踐證明，僅掌握紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)與紅

5、細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，尚遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足雞新城疫等疫病免疫監(jiān)測(cè)的目的。對(duì)于即將進(jìn)入禽病防治一線工作的學(xué)生，還應(yīng)能依據(jù)免疫監(jiān)測(cè)的結(jié)果分析禽群目前的免疫狀況，指導(dǎo)相應(yīng)禽群實(shí)施進(jìn)一步的免疫接種。故在本實(shí)驗(yàn)課的具體指導(dǎo)過程中和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書內(nèi)容中，都應(yīng)注意讓學(xué)生將“依據(jù)血凝性病毒病免疫監(jiān)測(cè)的結(jié)果指導(dǎo)禽群相應(yīng)病毒病的免疫接種”作為本實(shí)驗(yàn)課的重要目的之一。三、關(guān)于實(shí)驗(yàn)原理充分了解實(shí)驗(yàn)原理，對(duì)于掌控實(shí)驗(yàn)整體，把握實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵，較高質(zhì)量地完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容具有重要的作用。以往，筆者考慮到獸醫(yī)專業(yè)學(xué)生前期曾在微生物學(xué)課程學(xué)習(xí)過ha/hi反應(yīng)原理，故在上本實(shí)驗(yàn)課時(shí)，僅僅簡單地帶領(lǐng)學(xué)生重溫一下：“血凝性病毒具有凝集紅細(xì)胞的能力，且該能力

6、可以被特異抗體所抑制”。后來發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)學(xué)生對(duì)于該概念理解并不深刻，較難據(jù)此洞悉本實(shí)驗(yàn)的原理，不利于提高學(xué)生在實(shí)驗(yàn)操作過程的主動(dòng)性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果大打折扣。鑒此，在近幾年的教學(xué)中，筆者設(shè)計(jì)并采用了如下的一個(gè)講授方法。1.提問學(xué)生：“血凝性病毒具有一個(gè)重要的生物學(xué)特性是什么？”引導(dǎo)學(xué)生回憶：“該類病毒具有血凝特性;該血凝性可被相應(yīng)抗體所抑制”。2.具體解釋：上述“”的含義和反應(yīng)現(xiàn)象是：“如果在反應(yīng)孔中依次加入血凝性病毒（抗原）和家禽紅細(xì)胞，孔底將會(huì)出現(xiàn)凝集圖像，讀作凝集，記作+，此反應(yīng)稱為凝集反應(yīng)（ha）”;上述“”的含義和反應(yīng)現(xiàn)象是“反應(yīng)孔中加入血凝性病毒（抗原）、相應(yīng)血清（抗體）、家禽紅細(xì)

7、胞，孔底將會(huì)出現(xiàn)凝集抑制圖像，讀作凝集抑制，記作-，此反應(yīng)稱為凝集抑制反應(yīng)（hi）”。3.推進(jìn)判斷：將被檢血清作凝集抑制試驗(yàn)，可以據(jù)反應(yīng)結(jié)果圖像確定其中是否含有相應(yīng)的抗體（孔底圖像為“凝集”時(shí)，被檢血清不含抗體;孔底圖像為“凝集抑制”時(shí)，被檢血清含有相應(yīng)抗體）。4.拓展認(rèn)識(shí)：在上述hi試驗(yàn)中，如果對(duì)被檢血清不作稀釋，則試驗(yàn)只可獲得一個(gè)定性的結(jié)果（確定血清中有或無相應(yīng)抗體）;如果對(duì)被檢血清作一系列的倍比稀釋，對(duì)每一個(gè)稀釋度的血清作hi反應(yīng)，則試驗(yàn)就可依據(jù)最終出現(xiàn)完全抑制反應(yīng)的血清稀釋度的高低情況，獲得一個(gè)定量的結(jié)果（確定血清中相應(yīng)抗體有多少個(gè)log2）。經(jīng)過上述方法對(duì)試驗(yàn)原理作講解，絕大部分學(xué)生

8、可以非常清楚的了解具血凝性病毒病免疫監(jiān)測(cè)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)、基本過程及反應(yīng)結(jié)果判定、記錄的基本方法等，明顯提高了學(xué)生學(xué)習(xí)本技術(shù)的主動(dòng)性和學(xué)習(xí)效率。鑒于實(shí)驗(yàn)課程不允許花費(fèi)過多的時(shí)間講授，筆者對(duì)上述講授內(nèi)容制作了簡明的ppt，使講授可控制在5分鐘之內(nèi)完成。如將本內(nèi)容前置于禽病學(xué)理論課中相關(guān)疫?。ㄈ缧鲁且撸┑脑\斷內(nèi)容中，加以扼要陳述，實(shí)驗(yàn)課中再復(fù)習(xí)一下，效果會(huì)更好。四、關(guān)于實(shí)驗(yàn)用材教師在實(shí)驗(yàn)示范開始時(shí)，扼要、有序地介紹關(guān)鍵用材，有助于幫助學(xué)生對(duì)較復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)程序強(qiáng)化印象。在本實(shí)驗(yàn)中，以新城疫免疫監(jiān)測(cè)為例，介紹試驗(yàn)用材時(shí)，一方面，要讓學(xué)生注意新城疫免疫監(jiān)測(cè)所需的具體用材有哪些;另一方面，要讓學(xué)生注意不同的疫

9、病，需采用哪些不同的用材。在介紹抗原時(shí)，要強(qiáng)調(diào)抗原必須為具有4個(gè)凝集單位的抗原?？乖瘑挝贿^高過低都會(huì)明顯影響抗體的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于準(zhǔn)確配制4個(gè)凝集單位的抗原的術(shù)式，應(yīng)強(qiáng)調(diào)的關(guān)鍵包括：精確地實(shí)施ha試驗(yàn)操作;準(zhǔn)確地判讀ha試驗(yàn)結(jié)果;依據(jù)ha試驗(yàn)結(jié)果，準(zhǔn)確計(jì)算和量取抗原原液及稀釋液將抗原原液稀釋為4個(gè)凝集單位的抗原液;正確地對(duì)初配的4個(gè)凝集單位的抗原液作滴定檢測(cè)和必要的矯正。對(duì)于紅細(xì)胞懸浮液的配制，操作程序不算復(fù)雜，一般無大問題，要強(qiáng)調(diào)的是，離心洗滌紅細(xì)胞的時(shí)間、速度標(biāo)準(zhǔn)化，吸取紅細(xì)胞沉淀物溶積要準(zhǔn)確，水禽的免疫監(jiān)測(cè)試驗(yàn)（即對(duì)白鴨、番鴨、鵝的血清檢測(cè)）應(yīng)采用同種的成年動(dòng)物的紅細(xì)胞（或?yàn)闇p少制備紅

10、細(xì)胞種類，檢測(cè)水禽血清時(shí)一般可通用成年番鴨的紅細(xì)胞）配制1%的紅細(xì)胞懸浮液。還要指出被檢血清的采集時(shí)機(jī)、方法和比例。五、關(guān)于hi試驗(yàn)操作這是本實(shí)驗(yàn)課的實(shí)操重點(diǎn)。教師應(yīng)當(dāng)做一個(gè)精確到位的示范，并設(shè)法讓學(xué)生高度集中注意力觀察示范。hi實(shí)操環(huán)節(jié)常出現(xiàn)的問題：一是學(xué)生總感覺此操作較復(fù)雜，二是學(xué)生總會(huì)出現(xiàn)加樣出錯(cuò)情況。據(jù)此，教師示范前先將hi試驗(yàn)程序歸納為七步驟：（1）分裝稀釋液;（2）加入被檢血清;（3）稀釋血清;（4）加入4單位抗原;（5）加入紅細(xì)胞;（6）靜置感作;（7）判斷結(jié)果。示范過程，對(duì)每一個(gè)步驟邊示范邊強(qiáng)調(diào)12個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)（學(xué)生易出錯(cuò)點(diǎn)）。如分裝稀釋液注意最后一孔與前面各孔容量不同;被檢血清只

11、加入第一孔;稀釋血清要統(tǒng)一吹打次數(shù)和移液準(zhǔn)確性，最后二孔留作對(duì)照孔;最后一孔不加抗原，等等;示范結(jié)束時(shí)，讓學(xué)生共同回顧一次“七步驟”，旋即開始實(shí)操。這樣，基本上能保證95%以上的學(xué)生正確完成操作。hi試驗(yàn)結(jié)果的判斷，也是完成本實(shí)驗(yàn)的重中之重。如果不注意指導(dǎo)方法，也會(huì)使較大比例的學(xué)生出現(xiàn)誤判錯(cuò)判的情況。依據(jù)多年的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，筆者總結(jié)了結(jié)果判斷的示教要點(diǎn)如下：（1）首先要學(xué)生掌握好反應(yīng)結(jié)果判斷的基本時(shí)間，即以抗原對(duì)照孔和pbs對(duì)照孔反應(yīng)的情況做標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)pbs對(duì)照孔的紅細(xì)胞完全沉降到孔中央，且反應(yīng)孔中的液體清亮?xí)r，為最佳反應(yīng)時(shí)間，即為判定反應(yīng)的終點(diǎn)時(shí)間。（2）以pbs對(duì)照孔的紅細(xì)胞的流淌程度為依據(jù)，凡

12、是與pbs對(duì)照孔的紅細(xì)胞流淌情況一致的抗體檢測(cè)孔均判定為完全抑制孔。（3）要求學(xué)生逐一記錄抗體檢測(cè)孔的反應(yīng)圖像。（4）根據(jù)抗體檢測(cè)孔反應(yīng)系列圖像，找出完全抑制的最高血清稀釋度孔，以該孔血清稀釋度作為該血清的hi效價(jià)，寫出hi效價(jià)。（5）教師逐個(gè)檢查學(xué)生的試驗(yàn)結(jié)果，特別是讓學(xué)生指出hi反應(yīng)的終點(diǎn)孔，并讀出hi效價(jià)。六、關(guān)于實(shí)驗(yàn)誤差規(guī)避應(yīng)用hi試驗(yàn)進(jìn)行具血凝性病毒病的免疫監(jiān)測(cè)，導(dǎo)致誤差的因素較多，在示教、示范過程和學(xué)生操作過程中，教師要做到心中有數(shù)，重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)規(guī)避。除上述提及的一些操作要點(diǎn)外，尚需特別注意的環(huán)節(jié)有：正確使用移液器，滴管與移液器緊密接合，每次移液量盡可能準(zhǔn)確;作抗體的稀釋吹打過程，力度

13、要平穩(wěn)，每孔樣品吹打稀釋次數(shù)一致;4單位凝集抗原配制，必須進(jìn)行滴定試驗(yàn)，完全凝集孔要出現(xiàn)在第二孔，等等。七、關(guān)于指導(dǎo)雞群接種當(dāng)學(xué)生正確掌握了hi試驗(yàn)方法，并取得檢測(cè)結(jié)果后，教學(xué)的重點(diǎn)要轉(zhuǎn)入到如何依據(jù)hi試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)被檢禽群免疫工作上。（1）要正確引導(dǎo)學(xué)生討論雞群抗體臨界滴度的概念，確定科學(xué)的臨界滴度;（2）讓學(xué)生理解雞群抗體合格率的計(jì)算公式和計(jì)算方法;（3）讓學(xué)生理解和掌握不同日齡雞群免疫合格的標(biāo)準(zhǔn);（4）指導(dǎo)學(xué)生以免疫檢測(cè)的結(jié)果和免疫合格標(biāo)準(zhǔn)為主要依據(jù)，同時(shí)結(jié)合雞群其他情況，如相關(guān)免疫的時(shí)間間隔、雞群健康狀況、疫病流行動(dòng)態(tài)等，對(duì)雞群的進(jìn)一步免疫接種提出合理的意見。八、時(shí)間與程序安排本實(shí)驗(yàn)課內(nèi)

14、容較多，時(shí)間較緊，要比較合理地安排課程內(nèi)容，穿插安排示教、示范、學(xué)生操作，討論等程序。本實(shí)驗(yàn)課一般可安排23個(gè)課時(shí)。安排2學(xué)時(shí)時(shí)，4單位凝集抗原和紅細(xì)胞懸浮液均應(yīng)預(yù)先配備。教學(xué)過程可安排為：（1）教師簡單解題和指出目的內(nèi)容，確切說明原理;（2）扼要示范，點(diǎn)明用材，強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)程序和操作注意事項(xiàng);（3）在教師的巡視下，學(xué)生操作至抗原抗體感作步驟;（4）利用抗原抗體感作時(shí)間，教師具體指導(dǎo)結(jié)果判定的記錄方法和禽群免疫指導(dǎo)的方法;（5）學(xué)生判定記錄結(jié)果;教師對(duì)學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果及判斷記錄逐一作確認(rèn);（6）師生共同依據(jù)免疫監(jiān)測(cè)結(jié)果討論指導(dǎo)禽群免疫接種的方法;（7）實(shí)驗(yàn)課小結(jié)，指出實(shí)驗(yàn)存在問題，布置實(shí)驗(yàn)報(bào)告作業(yè)，強(qiáng)

15、調(diào)實(shí)驗(yàn)報(bào)告寫作的注意事項(xiàng)。為了簡明扼要，節(jié)約時(shí)間，對(duì)于實(shí)驗(yàn)原理、4單位凝集抗原制備、紅細(xì)胞懸浮液配備、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定方法、禽群免疫合格率計(jì)算與免疫指導(dǎo)方法討論等環(huán)節(jié)，都建議制備和使用合適的ppt輔助示教。九、關(guān)于作業(yè)批改要點(diǎn)就課堂教學(xué)而言，做好作業(yè)批改，是糾正學(xué)生技術(shù)錯(cuò)誤，提高實(shí)驗(yàn)課效率的最后一個(gè)重要環(huán)節(jié)。多年來，我們發(fā)現(xiàn)學(xué)生發(fā)生率較高的錯(cuò)誤點(diǎn)，包括：不如實(shí)陳述實(shí)驗(yàn)用材，誤將ha程序誤為hi程序，hi反應(yīng)終點(diǎn)“圖”、“數(shù)”不一致（hi效價(jià)概念不清），雞群抗體臨界滴度概念錯(cuò)誤，雞群抗體合格率公式套用數(shù)據(jù)錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)報(bào)告格式欠規(guī)范，等等，這些問題都被我們列為作業(yè)批改的主要關(guān)注點(diǎn)。十、小結(jié)“雞新城疫免

16、疫監(jiān)測(cè)”實(shí)驗(yàn)課非常重要。適當(dāng)修改課題和課程目的，內(nèi)容上兼顧到幾種相關(guān)傳染病的免疫監(jiān)測(cè);注意實(shí)驗(yàn)用材、實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn)和結(jié)果判斷方法要點(diǎn)的教學(xué)指導(dǎo)、示范;注意講清部分容易出現(xiàn)歧義的概念，規(guī)避歧義;避免易造成實(shí)驗(yàn)誤差的各種因素;加強(qiáng)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床免疫方法的討論、分析;精心穿插、安排教學(xué)過程中的各部分內(nèi)容，提高教學(xué)效率。如此，將可進(jìn)一步改善本實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)質(zhì)量，使之在雞新城疫、鴿瘟、水禽新城疫、禽流感和產(chǎn)蛋下降綜合征感染等傳染病的免疫防控中發(fā)揮更多作用。不僅如此，由于本實(shí)驗(yàn)涉及眾多獸醫(yī)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的基本技能，實(shí)際上是一個(gè)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)綜合技能訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)課程，因此，不斷探索改進(jìn)本課程的教學(xué)方法，對(duì)于強(qiáng)化獸醫(yī)專

17、業(yè)高年級(jí)學(xué)生獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)技能的綜合應(yīng)用能力，以及提高其學(xué)習(xí)應(yīng)用現(xiàn)代獸醫(yī)高新實(shí)驗(yàn)技術(shù)的能力，均有裨益，值得同行給以更多的注意和重視。參考文獻(xiàn)：1丁壯，尹仁福，薛聰，王建忠，錢晶.新城疫流行病學(xué)新特點(diǎn)與鵝新城疫防控策略j.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（1）：159-168.2熊永忠，王秀榮，曹殿軍，劉培欣，張勇.鴿源新城疫病毒的分離與鑒定j.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002，（5）：22.3廖秀云，陶虹，邵建宏，羅寶正，薄清如，劉國昌，徐海聶，沙才華.新型基因芯片檢測(cè)禽流感病毒、新城疫病毒和雞減蛋綜合征病毒j.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（10）：15-20.study on the application

18、of ha/hi test in poultry immunosurveillancezhang ji-pei，chen ji-dang，chen jian-hong，si xing-kui（department of animal medicine，college of life sciences and engineering，foshan institute of science and technology，foshan，guangdong 528231，china）abstract：this paper deals with several aspects of experimental teaching in the application of hemagglutination （ha） and hemagglutination inhibition （hi） test （micro method） to the immune monitori