第十二章遺傳工程幻燈片講義-PowerPointPre

1、 第第12章章 遺傳工程遺傳工程 本章教學時數(shù)：本章教學時數(shù)：2 2學時。學時。本章重點：基因工程的基本流程。本章重點：基因工程的基本流程。本章難點：分子標記和基因圖譜；本章難點：分子標記和基因圖譜； 研究基因功能的方法研究基因功能的方法 1 1 遺傳遺傳工程概述工程概述 遺傳工程：遺傳工程： 細胞工程細胞工程 酶工程酶工程 發(fā)酵工程發(fā)酵工程 基因工程基因工程遺傳工程的概念遺傳工程的概念 遺傳工程遺傳工程 （genetic engineeringgenetic engineering），），也稱生物工程（也稱生物工程（biological biological engineeringengin

2、eering）。）。 是指利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生是指利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或更適合人類物體，使其產(chǎn)生新的性狀或更適合人類需求的產(chǎn)品的遺傳學手段。需求的產(chǎn)品的遺傳學手段。廣義遺傳工程和狹義遺傳工程：廣義遺傳工程和狹義遺傳工程：廣義：包括細胞工程、基因工程、酶工程廣義：包括細胞工程、基因工程、酶工程和發(fā)酵工程等。和發(fā)酵工程等。狹義：基因工程。狹義：基因工程。 細胞工程 在離體（在離體（in vitroin vitro）條件下以細胞為基本單位，條件下以細胞為基本單位，借助人工培養(yǎng)基，對生物細胞進行培養(yǎng)、繁殖，借助人工培養(yǎng)基，對生物細胞進行培養(yǎng)、繁殖，或者使其發(fā)生

3、變異，從而改良生物品種、創(chuàng)造或者使其發(fā)生變異，從而改良生物品種、創(chuàng)造新品種、加速繁育，或利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用新品種、加速繁育，或利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的過程。物質(zhì)的過程。 細胞工程包括細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞器轉(zhuǎn)細胞工程包括細胞培養(yǎng)、細胞融合、細胞器轉(zhuǎn)移、生物體的克隆與規(guī)?；敝车取Ｒ?、生物體的克隆與規(guī)?；敝车?。第一個哺乳動物的克隆Dolly羊酶工程酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反應器中，利用酶的催化作用，在一定的生物反應器中，將相應的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品。將相應的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品。是酶學理論與化工技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)體系。是酶學理論與化工技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)體系。發(fā)酵工程發(fā)酵工

4、程 利用微生物與現(xiàn)代化工程技術(shù)相結(jié)合，利用微生物與現(xiàn)代化工程技術(shù)相結(jié)合，工廠化生產(chǎn)人類需要的物質(zhì)的一種技術(shù)工廠化生產(chǎn)人類需要的物質(zhì)的一種技術(shù)體系。體系。 目前醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素絕大部分目前醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素絕大部分都是發(fā)酵工程產(chǎn)品。都是發(fā)酵工程產(chǎn)品?；蚬こ袒蚬こ汤萌斯し椒ㄔ隗w外（利用人工方法在體外（in vitroin vitro）切割、切割、拼接、重組生物的遺傳物質(zhì)，獲得重組拼接、重組生物的遺傳物質(zhì)，獲得重組DNADNA分子，然后導入宿主細胞或個體，使分子，然后導入宿主細胞或個體，使受體的遺傳特性得到修飾或改良。受體的遺傳特性得到修飾或改良。基因工程操作的對象是基因工程操作的對

5、象是DNADNA分子。分子。又稱為重組又稱為重組DNADNA技術(shù)技術(shù)重組重組DNADNA技術(shù)流程技術(shù)流程 基因工程的工具酶基因工程的工具酶內(nèi)切核酸酶內(nèi)切核酸酶( (endonucleaseendonuclease) )DNADNA連接酶連接酶( (ligaseligase) )DNADNA聚合酶（聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）RNARNA聚合酶（聚合酶（RNA polymeraseRNA polymerase）反轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）最重要的工具酶是限制性核酸內(nèi)切酶最重要的工具

6、酶是限制性核酸內(nèi)切酶（restriction restriction endonucleaseendonuclease）限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶或稱限制性酶或稱限制性酶( (restriction enzyme),restriction enzyme),是基是基因工程因工程最重要的工具最重要的工具。在細菌中這些酶的功能是降解外來在細菌中這些酶的功能是降解外來DNADNA分子，分子，以限制以限制( (restriction)restriction)或阻止病毒侵染?；蜃柚共《厩秩尽＿@類酶能識別雙鏈這類酶能識別雙鏈DNADNA分子中特異的核苷酸分子中特異的核苷酸序列，并在特定的位置將雙連序列

7、，并在特定的位置將雙連DNADNA分子切斷。分子切斷。 Eco R 限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則：根據(jù)分離出這種酶的細菌在分類學上的屬名、根據(jù)分離出這種酶的細菌在分類學上的屬名、種名和菌株名來命名。種名和菌株名來命名。名稱的第一個字母是該細菌的屬名的第一個字名稱的第一個字母是該細菌的屬名的第一個字母，大寫，斜體。母，大寫，斜體。名稱的第二、三個字母是該細菌種名的前兩個名稱的第二、三個字母是該細菌種名的前兩個字母，小寫，斜體。字母，小寫，斜體。名稱的第四個字母是菌株的名稱，大寫或小寫，名稱的第四個字母是菌株的名稱，大寫或小寫，正體。如果沒有菌株名稱就不寫。正體。如果沒有菌

8、株名稱就不寫。名稱最后的是羅馬數(shù)字，表示從這種細菌中分名稱最后的是羅馬數(shù)字，表示從這種細菌中分離出來的酶的序號，如從某個菌株中分離出來離出來的酶的序號，如從某個菌株中分離出來的第一種酶為的第一種酶為，第二種酶為，第二種酶為，等等。，等等。如如EcoEcoR R來自大腸桿菌（來自大腸桿菌（Escherichia Escherichia colicoli）R R菌株，讀作菌株，讀作echo-r-oneecho-r-one；HinHind d 來自流感噬血桿菌來自流感噬血桿菌 （HemophilusHemophilus influenzaeinfluenzae）d d菌株菌株, ,讀作讀作hind-

9、three hind-three 限制酶的分類限制酶的分類限制性核酸內(nèi)切酶的工作分為限制性核酸內(nèi)切酶的工作分為2 2個步驟：個步驟： 識別特定的識別特定的DNADNA序列序列 在特定的位置切割在特定的位置切割DNADNA分子分子根據(jù)其作用特點根據(jù)其作用特點, ,可以將限制性酶分為三種類型：可以將限制性酶分為三種類型： 型型 型型 型。型。在基因工程中用途最廣泛的是在基因工程中用途最廣泛的是型限制酶。型限制酶。型限制酶型限制酶有特定的識別序列有特定的識別序列但切割位置遠離識別位置但切割位置遠離識別位置有的種類可以在同識別序列相距有的種類可以在同識別序列相距10001000bpbp的位置的位置上隨

10、機切割上隨機切割DNADNA分子分子在基因工程中沒有什么用途在基因工程中沒有什么用途型限制酶型限制酶有特定的識別序列有特定的識別序列切割位置在識別序列切割位置在識別序列33端相距端相距2020bpbp處，處，可以產(chǎn)生各種類型的單鏈末端?？梢援a(chǎn)生各種類型的單鏈末端。型限制酶在基因工程中有特定的用途，型限制酶在基因工程中有特定的用途，但總體來說，用途不大。但總體來說，用途不大。型限制酶型限制酶在在DNADNA上有特定的識別序列上有特定的識別序列而且其而且其切割位點就在識別序列內(nèi)部切割位點就在識別序列內(nèi)部基因工程中用途最廣基因工程中用途最廣識別序列是對稱的，在一條鏈中從識別序列是對稱的，在一條鏈中從

11、55到到33方方向的序列與其互補鏈從向的序列與其互補鏈從55到到33方向的序列完方向的序列完全相同，稱為回紋對稱序列全相同，稱為回紋對稱序列( (palindrome)palindrome)。 酶切與連接酶切與連接常常見見內(nèi)內(nèi)切切酶酶DNADNA連接酶連接酶(DNA (DNA ligaseligase) ) 共價連接共價連接5 5磷酸和磷酸和3 3OHOH，形成磷酸二形成磷酸二酯鍵酯鍵( (3 3 5 5phosphodiesterphosphodiester bond) bond) ，封，封閉閉DNADNA雙鏈上的缺刻雙鏈上的缺刻(nick)(nick)。反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶reverse re

12、verse transcriptasetranscriptase 3 3 載體載體( (vector)vector)將外源將外源DNADNA片段運送進宿主細胞片段運送進宿主細胞( (host host cell)cell)進行擴增或表達的運載工具稱進行擴增或表達的運載工具稱為載體為載體。載體也是載體也是DNADNA分子。分子。常用載體：常用載體： 細菌質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。細菌質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。 都要經(jīng)過人工改造都要經(jīng)過人工改造。 細菌人工染色體（細菌人工染色體（BACBAC） 酵母菌人工染色體（酵母菌人工染色體（YACYAC） 人類人工染色體（人類人工染色體（HACHAC）載體的基本條件

13、載體的基本條件有獨立的復制原點有獨立的復制原點( (oriori) )，能獨立地自我能獨立地自我復制，而且能帶動外源復制，而且能帶動外源DNADNA一起復制。一起復制。具有多種限制性酶的切點，用于連接外源具有多種限制性酶的切點，用于連接外源DNA DNA 片段。片段。載體上的限制酶酶切位點對于任何一種限載體上的限制酶酶切位點對于任何一種限制酶來說只能有一個。制酶來說只能有一個。具有一個選擇標記基因。具有一個選擇標記基因。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體分子量小分子量小(2.69(2.69kb),kb),但能攜帶較大的外源片段；拷貝數(shù)多但能攜帶較大的外源片段；拷貝數(shù)多, ,在每個宿主細胞在每個宿主細胞可達可達5

14、00500個；酶切位點多，克隆方便；具有個；酶切位點多，克隆方便；具有-互補顯色表型互補顯色表型, ,便于檢測。便于檢測。 互補顯色反應互補顯色反應 噬菌體（噬菌體（3030kbkb） 粘粒（粘粒（cosmidcosmid）載體（）載體（4545kbkb）細菌人工染色體細菌人工染色體BACBAC（300kb300kb）bacterial artificial chromosomebacterial artificial chromosome來源于來源于F F因子因子YAC（1Mb）yeast artificial chromosomeyeast artificial chromosomeTiT

15、i質(zhì)粒質(zhì)粒TiTi質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌的染色體外遺傳物質(zhì)質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌的染色體外遺傳物質(zhì)雙鏈閉合環(huán)狀雙鏈閉合環(huán)狀DNADNA，150150200kb200kb植物基因工程常用的載體植物基因工程常用的載體TiTi質(zhì)粒結(jié)構(gòu)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)T-DNAT-DNA Transfer DNA Transfer DNA是農(nóng)桿菌侵入植是農(nóng)桿菌侵入植物細胞時從物細胞時從TiTi質(zhì)質(zhì)粒上轉(zhuǎn)移到植物粒上轉(zhuǎn)移到植物細胞的一段細胞的一段DNADNAT-DNAT-DNA兩端個有兩端個有一段一段2525bpbp的同向的同向重復序列，是重復序列，是T-T-DNADNA的邊緣區(qū)的邊緣區(qū)LBLB；RBRB在同一條單鏈的在同一條單鏈的LBL

16、B和和RBRB內(nèi)各形成內(nèi)各形成一個缺口，單鏈一個缺口，單鏈T-DNAT-DNA進入植物進入植物細胞細胞4 4 基因的分離與鑒定基因的分離與鑒定 從基因庫中分離基因從基因庫中分離基因 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應( (PCR)PCR)擴增基因擴增基因人工合成基因人工合成基因T TDNADNA標簽法標簽法 ( (一一) )從基因庫中分離基因從基因庫中分離基因 1 1構(gòu)建基因庫構(gòu)建基因庫 2 2篩選基因庫篩選基因庫 3 3陽性克隆的分析與鑒定陽性克隆的分析與鑒定 1 1構(gòu)建基因庫構(gòu)建基因庫 基因庫基因庫 ( (library)library)是一組是一組DNADNA或或cDNAcDNA序列序列克隆的

17、集合體?？寺〉募象w。 創(chuàng)建基因文庫的目的是從特定的材料中創(chuàng)建基因文庫的目的是從特定的材料中分離目的分離目的DNADNA片段或基因。片段或基因。把所有的基因集中在一個庫中，采用一把所有的基因集中在一個庫中，采用一定的方法在庫中篩選目的基因。定的方法在庫中篩選目的基因。同時也便于基因的長期保存。同時也便于基因的長期保存。基因組文庫基因組文庫 Genomic DNA libraryGenomic DNA library使用與切割載體相同的限制酶，將供體使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組生物的基因組DNADNA切割成許多片段切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構(gòu)成一個重將所有片段連接到

18、載體上，構(gòu)成一個重組組DNADNA群體群體這個群體包含全基因組的遺傳信息這個群體包含全基因組的遺傳信息cDNAcDNA文庫文庫 cDNAcDNA library library 以以mRNAmRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補DNA(complementaryDNA(complementary DNADNA，cDNAcDNA) ) 將雙鏈將雙鏈cDNAcDNA與適當載體連接與適當載體連接 轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增，建成cDNAcDNA文庫文庫 基因組文庫與基因組文庫與 cDNAcDNA文庫的比較：文庫的比較：基因組文庫包含基因組的所有基因基

19、因組文庫包含基因組的所有基因 cDNAcDNA文庫只包括某一特定細胞類型、某一文庫只包括某一特定細胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時期的表達序列組織、或某一發(fā)育時期的表達序列 分離特定基因，分離特定基因，cDNAcDNA庫比較方便庫比較方便研究調(diào)控序列，必須基因組文庫研究調(diào)控序列，必須基因組文庫從基因庫中篩選特定的克隆從基因庫中篩選特定的克隆 一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底一個基因文庫中有幾萬個克隆，目的基因到底在哪個克隆上呢？在哪個克隆上呢？ 根據(jù)待選基因相關(guān)信息根據(jù)待選基因相關(guān)信息 確定篩選方法和條件。確定篩選方法和條件。 最常用的方法是最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探針利用一段

20、核苷酸序列作探針，用用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，篩選放射性同位素或非放射性同位素標記探針，篩選基因庫基因庫 DNA探針（探針（probe） 探針是一段能夠與待選目的基因互補的核酸序列探針是一段能夠與待選目的基因互補的核酸序列 DNADNA、cDNAcDNA、寡聚核苷酸寡聚核苷酸 單鏈、雙鏈單鏈、雙鏈 同位素標記、熒光標記、顏色標記同位素標記、熒光標記、顏色標記篩選文庫篩選文庫質(zhì)粒基因庫篩選質(zhì)?；驇旌Y選細菌混合液在培細菌混合液在培養(yǎng)在平板上養(yǎng)在平板上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上裂解細菌裂解細菌變性變性DNADNA標記探針標記探針雜交雜交漂洗漂洗放射自顯影或熒放射自顯影或熒光檢測光檢

21、測挑取對應菌落、挑取對應菌落、培養(yǎng)培養(yǎng)抽提質(zhì)粒抽提質(zhì)粒 陽性克隆的分析與鑒定陽性克隆的分析與鑒定 u 從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能最后得到目的進一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因基因 u 測序測序 自動測序儀自動測序儀u 功能分析功能分析 預測軟件預測軟件核酸序列測定的原理核酸序列測定的原理磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵測測序序電電泳泳圖圖譜譜核酸序列分析與功能預測核酸序列分析與功能預測 同源性比較同源性比較 同源基因是指那些起源相同、序列相似同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。的基因。 可從核酸及蛋白質(zhì)兩種水平比較基因間可從核酸及蛋白質(zhì)

22、兩種水平比較基因間的同源性。的同源性。 將測出的核酸序列同雜交的探針序列進將測出的核酸序列同雜交的探針序列進行比較行比較 將得到的序列發(fā)到將得到的序列發(fā)到BLASTBLAST等等DNA DataDNA Data庫的庫的網(wǎng)址上比較網(wǎng)址上比較開放閱讀框開放閱讀框（open reading frame, ORFopen reading frame, ORF）分析分析開放閱讀框：一段能編碼一條多肽鏈，并具有開放閱讀框：一段能編碼一條多肽鏈，并具有翻譯起始信號（翻譯起始信號（ATGATG）和終止信號和終止信號 ( (TAATAA、TAGTAG或或TGA)TGA)的核苷酸序列。的核苷酸序列。來自來自cDN

23、AcDNA庫的序列可直接進行庫的序列可直接進行0 0RFRF分析，比較分析，比較其與其他序列的同源性來確定其身份。其與其他序列的同源性來確定其身份。來自核基因庫的序列，因大多數(shù)真核生物基因來自核基因庫的序列，因大多數(shù)真核生物基因含有內(nèi)含子。含有內(nèi)含子。開放閱讀框（開放閱讀框（open reading frame, ORFopen reading frame, ORF）分析分析 TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG 61 CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGCTGCT

24、CCTTCTTCTTCTTC121 TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC181 CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGCATGTCATGA241 TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC301 CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT361 CATAAAAGTAGGAGTAGATCTTTAAT

25、TTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT421 TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT481 AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGTTATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA541 TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT601 GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG661 AAGCAC

26、CAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA721 TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA781 AGTAGTACAAAAATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG841 GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC901 CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGCAGTC

27、CGCGAAGGCC961 GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC1021 AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAGAAGGAA1081 GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG1141 GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG1201 GATGTCAAGTACAGCGAATTCGAGGC

28、CGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT1261 TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC1321 TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATACATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC1381 ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGTCAATCAACAGGCCAACCTACTCACTGACG1441 ATGGAGATGCTTATCGCCAACGGGCAGAGATTGGTGACATCGTCTTCGGAGATGATCGTC1501 G

29、ATTCCGGGGCCCAGAGGACGTCCCTGTGGCCTTCCACTTTTGCTCTCCTTGACAAGACC1561 ATCACGCAGGCAATGTCGTCGATTGGGTATCACCGGACATCAAGAGCGCGCCAAGAATCA1621 TACATCTGCTACTTATCGGAGCACGACTATTCTGGTTGGAACGGCACCATCACGCCCTTC1681 TCCAACTGGTCCGCCTTGCCTCTGCTGGAGATCGGCTTCGCCGGCGGTGCTGCACTCGCT1741 TTGCCACCCAGAAACGTCTTCTACAACGATCCACACCGCGG

30、TTTGTGCATGACCTTTGCT1801 CAGAATCCTGCTCTCAGGTCTCAGATACTGGGGAACAGGGTTACTCGATCCTTCGGAACA1861 ACCTTCGACATCCAGGGGAAACAATTCGGCTTCAAATATGCCGTTTGCTGATCGTCGATT1921 ATTCCTCATCCTATGATATCTTATAGCTTGCGGGTACGTACCAAGTATATATCAAACTAA1981 TTGCATACATGCTCTCCCTCCCTCTGTCCATGCATGTCCTCGTTTCATTGCAAATCTGCA2041 TCGATCAATCCAGTTA

31、CTGATAATTCCTCCTTATTAACTTAGGCTGATCGATCCATTGCT2101 TCTCGTGTGTATATTATGCAGGTCGATTAATTAGCTGGTTTGCCCAAATAACTGATCGGA2161 TTGGAGTCTTCTCCCGCGCTACACTACCCCTAGCTGCGATCGTATCACAAGCTAGCGGTA2221 CTTGATTTGGGACCTAATTCGTTCAAAAAAAACTTGGCAGCTTAATTTGGGACCTAGTAG2281CTAGCTGAGCCACTACTAGATGTTTACGTACCAGCTATCCGTCGTTTGTTTGTGTCT

32、CCT2341 GTGCTTGTGCT 2351bp( (二二) )聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應( (PCR)PCR)擴增基因擴增基因 利用利用PCRPCR方法可以在數(shù)小時內(nèi)使目的方法可以在數(shù)小時內(nèi)使目的DNADNA片段擴增到數(shù)百萬個拷貝。片段擴增到數(shù)百萬個拷貝。 基本原理：基本原理： 根據(jù)待擴增基因的部分序列合成根據(jù)待擴增基因的部分序列合成成對成對引引物，在體外合成物，在體外合成兩個引物之間的兩個引物之間的DNADNA序列。序列。聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應(PCRPCR，polymerase chain reactionpolymerase chain reaction)PCRPCR反應反

33、應根據(jù)待擴增基因序列合成兩個引物，根據(jù)待擴增基因序列合成兩個引物，10-2010-20bpbp, ,分別分別與待擴增基因二條鏈的兩端互補。與待擴增基因二條鏈的兩端互補。在在DNADNA模板變性成單鏈后，兩個引物分別與單鏈模板變性成單鏈后，兩個引物分別與單鏈DNADNA復性，在耐熱的復性，在耐熱的TaqTaq polymersepolymerse及及4 4種脫氧核苷酸存種脫氧核苷酸存在下，由引物引導合成在下，由引物引導合成DNADNA新鏈。新鏈。3 3個步驟：個步驟： 變性變性 94-95, 94-95,雙鏈變性成單鏈雙鏈變性成單鏈 復性復性 50-70, 50-70,兩個引物分別與單鏈兩個引物

34、分別與單鏈DNADNA互補互補 延伸延伸 72, 72,在引物在引物TaqTaq酶的作用下從酶的作用下從5353的方的方向合成模板向合成模板DNADNA的互補鏈。的互補鏈。 PCRPCR反應常有反應常有25253535個循環(huán)個循環(huán)經(jīng)過經(jīng)過2525個循環(huán)以后，理論上原來一個分個循環(huán)以后，理論上原來一個分子子DNADNA可以擴增為可以擴增為10106 6個拷貝。個拷貝。僅用少量的模板僅用少量的模板DNADNA分子，可以得到大量分子，可以得到大量擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物。通常可以擴增通?？梢詳U增5 5kbkb左右的左右的DNADNA片段。片段。性能更好的性能更好的TaqTaq酶可以擴增長達酶可以擴增長達4

35、040kbkb的的DNADNA片段。片段。PCRPCR擴增的擴增的DNADNA序列經(jīng)過核酸序列測定分序列經(jīng)過核酸序列測定分析后，可作為基因工程的目的基因。析后，可作為基因工程的目的基因。PCRPCR循環(huán)數(shù)與產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關(guān)系循環(huán)數(shù)與產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關(guān)系循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)1 12 21 12 25 52 25 5323210102 210101024102415152 21515327683276820202 22020104857610485761101106 625252 2252533554432335544323103107 730302 23030107374182410737418241

36、101109 9PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)PCRPCR技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)的關(guān)鍵 人工合成寡核苷酸片段（引物）人工合成寡核苷酸片段（引物） 耐熱的耐熱的Taq DNA polymerase （來自（來自Thermus aquaticus，94kDa）PCRPCR方法已成為分子生物學研究常規(guī)手段方法已成為分子生物學研究常規(guī)手段而且還用于遺傳、發(fā)育、進化、疾病診而且還用于遺傳、發(fā)育、進化、疾病診斷、法醫(yī)學等領(lǐng)域斷、法醫(yī)學等領(lǐng)域PCRPCR技術(shù)的發(fā)明是現(xiàn)代生物學發(fā)展史上的技術(shù)的發(fā)明是現(xiàn)代生物學發(fā)展史上的又一個里程碑又一個里程碑發(fā)明人獲得了發(fā)明人獲得了19931993年諾貝爾化學獎年諾貝爾化學獎 （三

37、）（三） 人工合成基因人工合成基因根據(jù)已知的基因序列，或根據(jù)氨基酸序根據(jù)已知的基因序列，或根據(jù)氨基酸序列推測列推測DNADNA序列序列將化學合成寡核苷酸的方法與酶促合成將化學合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNADNA的方法結(jié)合起來，可以很快地人工合的方法結(jié)合起來，可以很快地人工合成基因。成基因。首先化學合成多個含有首先化學合成多個含有8080100100個核苷酸的寡聚個核苷酸的寡聚核苷酸核苷酸每個寡聚核苷酸片段之間有每個寡聚核苷酸片段之間有19192424個核苷酸的個核苷酸的重疊序列重疊序列再將各個寡聚核苷酸等量再將各個寡聚核苷酸等量( (摩爾濃度摩爾濃度) )混合，在混合，在DNADNA聚合酶

38、聚合酶 ( (或或TaqTaq酶酶) )作用下，各寡聚核苷酸又作用下，各寡聚核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補齊成為雙鏈。作為引物合成新鏈，使單鏈部分補齊成為雙鏈。再用兩個再用兩個PCRPCR引物，經(jīng)引物，經(jīng)PCRPCR擴增出擴增出DNADNA片段。若將片段。若將兩個兩個DNADNA片段放在一起，經(jīng)片段放在一起，經(jīng)SOE-SOE-PCR(sequencePCR(sequence overlapped overlapped extensionextension，SOESOE) )擴增出完整的基擴增出完整的基因片段因片段（四）（四） T TDNADNA標簽克隆基因標簽克隆基因 利用利用T TD

39、NADNA插入創(chuàng)造突變體插入創(chuàng)造突變體 獲得突變體的純合材料獲得突變體的純合材料 分析突變體性狀與分析突變體性狀與T TDNADNA的共分離關(guān)系的共分離關(guān)系 PCR PCR獲得獲得T TDNADNA的側(cè)翼基因組序列的側(cè)翼基因組序列 用所得序列作探針篩選基因文庫，獲得用所得序列作探針篩選基因文庫，獲得目標基因或克隆目標基因或克隆 再作進一步的分析再作進一步的分析T TDNADNA標簽克隆基因的基本原理標簽克隆基因的基本原理構(gòu)建構(gòu)建T TDNADNA載體載體轉(zhuǎn)化植物（轉(zhuǎn)化植物（T1T1，T TDNADNA雜合體）雜合體）篩選篩選T2T2，獲得突變體獲得突變體尋找與尋找與T TDNADNA共分離的個

40、體共分離的個體讓其自交，產(chǎn)生純合體讓其自交，產(chǎn)生純合體PCRPCR獲得獲得T TDNADNA兩側(cè)的基因組序列兩側(cè)的基因組序列利用側(cè)翼利用側(cè)翼DNADNA序列作探針從序列作探針從DNADNA文庫中釣取基因文庫中釣取基因基因功能驗證基因功能驗證（遺傳互補測驗，用分離的野生基因轉(zhuǎn)化突變體，恢復功能）（遺傳互補測驗，用分離的野生基因轉(zhuǎn)化突變體，恢復功能）重組重組DNADNA分子的構(gòu)建分子的構(gòu)建v 用相同的內(nèi)切酶酶解目的基因與載體用相同的內(nèi)切酶酶解目的基因與載體v 將載體與目的基因混合將載體與目的基因混合v 用用DNA DNA ligaseligase連接連接重組重組DNADNA分子的構(gòu)建分子的構(gòu)建5

41、5 外源基因?qū)胨拗骷毎庠椿驅(qū)胨拗骷毎鹶 將目的基因與載體連接，構(gòu)建重組將目的基因與載體連接，構(gòu)建重組DNADNA分子分子v 重組重組DNADNA分子必須導入宿主細胞才能擴分子必須導入宿主細胞才能擴增或表達增或表達重組重組DNADNA導入原核生物導入原核生物v 原核生物基因工程的受體通常是大腸桿菌原核生物基因工程的受體通常是大腸桿菌v 導入方式多用轉(zhuǎn)化法導入方式多用轉(zhuǎn)化法v 也有用結(jié)合的方法也有用結(jié)合的方法重組重組DNADNA導入植物導入植物1 1、根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)、根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)2 2、基因槍法、基因槍法根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)根癌農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌（Agrobacte

42、riumAgrobacterium tumefacienstumefaciens)根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化是應用得最根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化是應用得最早而廣泛的一種植物轉(zhuǎn)化方法。早而廣泛的一種植物轉(zhuǎn)化方法。雙子葉植物、單子葉植物都可以用。雙子葉植物、單子葉植物都可以用。將目的基因與花椰菜花葉病毒將目的基因與花椰菜花葉病毒3535S S啟動子啟動子及終止子組成嵌合及終止子組成嵌合DNADNA分子分子插入到插入到TiTi衍生質(zhì)粒的衍生質(zhì)粒的RBRB與與LBLB之間構(gòu)成重之間構(gòu)成重組質(zhì)粒組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌細胞轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌細胞重組根瘤土壤桿菌感染植物細胞重組根瘤土壤桿菌感染植物細胞使質(zhì)粒的部分使質(zhì)粒的部分DNADNA與目的基因一起整合到與目的基因一起整合到植物染色體上，實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化植物染色體上，實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化 植物轉(zhuǎn)基因過程植物轉(zhuǎn)基因過程基因槍法基因槍法基因槍（基因槍（gene gungene gun）法，又稱微粒轟擊法，又稱微粒轟