陜北地區(qū)馬鈴薯卷葉病毒的RT-PCR檢測(cè)與序列分析

1、    陜北地區(qū)馬鈴薯卷葉病毒的rtpcr檢測(cè)與序列分析    馮光惠+杜虎平+李夏隆+亢福仁摘要：以陜北8個(gè)縣（區(qū)）種植23代疑似帶毒的馬鈴薯葉片為材料，用trizol法提取馬鈴薯葉片總rna，以已公布的馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白（cp）基因序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)rt-pcr擴(kuò)增目的dna片段，對(duì)cp基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，采用dnastar軟件分析序列的一致性。結(jié)果表明，從陜北8個(gè)縣（區(qū)）馬鈴薯葉片中均擴(kuò)增到與預(yù)期大小一致、長(zhǎng)度為336 bp的目的片段，說(shuō)明馬鈴薯均感染了卷葉病毒。陜北8個(gè)縣（區(qū)）馬鈴薯卷葉病毒cp基因之間的序列一致性達(dá)99.6%以上，與國(guó)內(nèi)

2、外其他地區(qū)10個(gè)樣品cp基因的序列一致性為96.2%99.8%，表明馬鈴薯卷葉病毒的cp基因序列比較保守。關(guān)鍵詞：馬鈴薯卷葉病毒；cp基因；rt-pcr檢測(cè)；序列分析：s435.32 ：a ：0439-8114（2014）19-4734-03doi：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.19.060rt-pcr detection and cp gene sequence analysis of potato leaf roll virus in northern shaanxi provincefeng guang-hui，du hu-ping，li xia-long

3、，kang fu-ren（college of life science，yulin university， yulin 719000，shaanxi，china）abstract： taking 2-3 generations of suspected poisonous potato leaf planted in eight counties （districts） of northern shaanxi province as materials， the total rna was extracted from potato leaves by trizol method. spec

4、ific primers were published coat protein（cp） gene sequence of potato leaf roll virus. the dna fragment was amplified by rt-pcr. then the cp gene was cloned and sequenced. sequence identity was analyzed by dnastar software. the results showed that the gene sequence amplified from potato leaves from 8

5、 counties in northern shaanxi area were consistent with the expected size with length of 336 bp. these potatoes were all infected with potato leaf roll virus. the cp gene sequence identity between potato leaf roll virus in 8 counties （districts） of northern shaanxi was more than 99.6%. 10 samples of

6、 cp gene sequences from other regions at home and abroad had identity ranged from 96.2% to 99.8%. it is indicated that the cp gene of potato leaf roll virus is more conservative.key words： potato leaf roll virus； cp gene； rt-pcr detection； sequence analysis馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，plrv）是馬鈴薯主要的

7、病毒之一，分布于世界各地馬鈴薯種植區(qū)。卷葉病毒可通過(guò)種薯、蚜蟲(chóng)或嫁接傳播，感染卷葉病毒會(huì)造成馬鈴薯減產(chǎn)30%90%1。近年來(lái)，脫毒馬鈴薯在全國(guó)各地大面積推廣，但隨著脫毒種薯種植代（年）數(shù)的增加，病毒在植株體內(nèi)不斷積累和傳播，導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)逐漸下降，而且還會(huì)感染其他種類(lèi)的病毒和類(lèi)病毒。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)田間種植馬鈴薯的帶毒情況，采用莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒法、熱處理法、抗病毒藥劑法等2脫毒技術(shù)控制病毒的蔓延，可為脫毒馬鈴薯的推廣種植奠定基礎(chǔ)。檢測(cè)馬鈴薯病毒常用的方法有雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（das-elisa）、反轉(zhuǎn)錄pcr法（rt-pcr）和實(shí)時(shí)熒光定量pcr法。das-elisa法操

8、作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)，準(zhǔn)確度較高，但檢測(cè)病毒含量較低的馬鈴薯時(shí)，靈敏度和準(zhǔn)確度不高，會(huì)出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。rt-pcr檢測(cè)技術(shù)在病毒含量極低時(shí)也可以快速檢測(cè)馬鈴薯病毒，該方法具有靈敏、快速、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于馬鈴薯3、葡萄4等其他植物病毒的檢測(cè)。在rt-pcr檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上，研究者應(yīng)用多重rt-pcr對(duì)馬鈴薯多種病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)5-7。隨著實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)的發(fā)展，bright等8利用該方法檢測(cè)了馬鈴薯pvx、pvy、pva和plrv 4種病毒；sheila等9采用該方法檢測(cè)了pvx、pvs、tswv和plrv 4種病毒。多重rt-pcr和實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法大大提高了馬鈴薯病毒的

9、檢測(cè)效率，并逐漸應(yīng)用到其他植物、動(dòng)物病毒以及微生物的檢測(cè)上，但多重rt-pcr和熒光定量pcr方法易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象10，11。國(guó)內(nèi)研究者采用rt-pcr方法檢測(cè)了不同地區(qū)的馬鈴薯卷葉病毒12-14，但尚未見(jiàn)用rt-pcr法檢測(cè)和分析陜北地區(qū)馬鈴薯卷葉病毒的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以陜北8個(gè)縣（區(qū)）種植23代的疑似帶毒馬鈴薯為研究對(duì)象，采用rt-pcr方法檢測(cè)該地區(qū)的馬鈴薯卷葉病毒，并對(duì)馬鈴薯卷葉病毒的外殼蛋白（coat protein，cp）基因序列進(jìn)行分析，從而掌握病毒的變異程度，以期為脫毒馬鈴薯的種薯繁育和推廣種植提供依據(jù)。 1 材料與方法1.1 材料1.1.1 樣品的采集 于2013年7-10

10、月在馬鈴薯生長(zhǎng)盛期至成熟期，采集馬鈴薯疑似帶病毒植株葉片，常溫下保存于保濕組織培養(yǎng)瓶中，4 冰箱保存。供試馬鈴薯的具體情況見(jiàn)表1。1.1.2 儀器與試劑 主要儀器有pcr儀（朗基，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）、電泳儀、分光光度計(jì)、凝膠成像系統(tǒng)（bio-rad，美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司）。trizol試劑、cdna合成試劑盒、dna膠回收試劑盒、pgem-teasy載體、taq dna聚合酶、dntp、10×buffer均購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。1.1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件primer 5設(shè)計(jì)1對(duì)特異引

11、物，上游引物為5-cgcgctaacagagttcagcc-3，下游引物為5-gcaatgggggtccaactcat-3。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為336 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，將其用滅菌te（ph 8.0）稀釋至濃度為10 mol/l。1.2 方法1.2.1 馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr檢測(cè)1）馬鈴薯總rna的提取。采用trizol法參照文獻(xiàn)15的方法進(jìn)行，略做改動(dòng)。稱(chēng)取0.1 g馬鈴薯葉片在研缽中用液氮研磨，取1.5 ml離心管加入1 ml trizol，將研磨液與trizol溶液混合均勻；4 、12 000 r/min離心15 min；轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入0.2

12、 ml氯仿，渦旋混勻，室溫放置5 min，4 、12 000 r/min離心15 min；取上清液（水相）于另一離心管中，按上清液體積分別加入1/2體積的異戊醇、0.8 mol/l檸檬酸鈉和1.2 mol/l氯化鈉，混合均勻，室溫放置510 min，4 、12 000 r/min離心8 min，棄上清液，用1 ml 75%乙醇洗滌沉淀2次，4 、12 000 r/min離心15 min，小心倒掉乙醇，室溫自然干燥后溶于用depc處理過(guò)的ddh2o，于-80 條件下保存。2）cdna的合成。按照cdna合成試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，對(duì)提取的馬鈴薯葉片總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體反應(yīng)體系如下：馬鈴薯總rna

13、5 l，anchored oligo（dt）18（0.5 g/l） 1 l，2×es reaction mix 10 l，easyscript rt enzyme mix 1 l，加rnase-free water至20 l。混勻后，水浴鍋中42 孵育30 min，pcr儀中85 條件下加熱失活5 min。3）pcr反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè)。pcr反應(yīng)體系：cdna 3 l，上游引物1 l，下游引物1 l，10×buffer 5 l，2.5 mmol/l dntps 4 l，taq dna聚合酶1 l，加ddh2o至50 l。pcr反應(yīng)程序：94 5 min；94 30 s，60 3

14、0 s，72 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 10 min。取6 l pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與1 l loading buffer混勻，用15 g/l瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr產(chǎn)物，于凝膠成像系統(tǒng)中照相。1.2.2 cp基因的克隆及序列分析 用dna膠回收試劑盒回收純化pcr產(chǎn)物，將其與pgem-teasy載體連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌trans1-t1感受態(tài)細(xì)胞，在加有iptg和x-gal的lb平板上篩選白色菌落，于lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，采用ecor和hind 限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將含目的條帶的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。用dnastar軟件分析cp基因的序

15、列相似性，并與genbank中搜索的國(guó)內(nèi)外10個(gè)不同地區(qū)的馬鈴薯卷葉病毒cp基因（表2）進(jìn)行序列相似性分析。2 結(jié)果與分析2.1 馬鈴薯卷葉病毒cp基因的rt-pcr檢測(cè)對(duì)采自陜北8個(gè)縣（區(qū)）馬鈴薯葉片所含病毒cp基因的rt-pcr產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，這8個(gè)樣品均能擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)度為336 bp的目的條帶，表明8個(gè)采樣點(diǎn)的馬鈴薯植株均感染了卷葉病毒。2.2 馬鈴薯卷葉病毒cp基因的序列一致性分析用dnastar軟件對(duì)馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，陜北8個(gè)縣（區(qū)）卷葉病毒 cp基因之間的一致性達(dá)到99.6%以上，序列之間變異率很低。以榆陽(yáng)區(qū)馬合鎮(zhèn)的馬鈴薯卷葉病毒cp基因?yàn)?/p>

16、對(duì)照（ck），與國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)10個(gè)馬鈴薯樣品cp基因的序列一致性為96.2%99.8%（表3），表明馬鈴薯卷葉病毒的cp基因序列比較保守，不易發(fā)生變異。3 討論本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，陜北8個(gè)縣（區(qū)）最近幾年都在推廣種植脫毒馬鈴薯，但一級(jí)脫毒種薯種植23年后，馬鈴薯葉片開(kāi)始出現(xiàn)卷曲、小葉、花葉、皺縮等癥狀，薯塊性狀發(fā)生變化，產(chǎn)量也呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明馬鈴薯卷葉病毒等單一病毒或各種復(fù)合病毒感染了馬鈴薯?？赡苁菍?duì)馬鈴薯脫毒苗及各級(jí)種薯的檢驗(yàn)、檢疫、監(jiān)督不夠嚴(yán)或者蚜蟲(chóng)通過(guò)汁液傳播使馬鈴薯感染病毒。rt-pcr分子檢測(cè)技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)馬鈴薯的帶毒情況，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍的病毒檢測(cè)技術(shù)。在普通rt-

17、pcr體系中，只要提取的馬鈴薯總rna質(zhì)量高，在檢測(cè)不同種類(lèi)的病毒和類(lèi)病毒時(shí)，設(shè)計(jì)不同的特異引物，就能擴(kuò)增出預(yù)期的目的條帶，不會(huì)發(fā)生假陰性現(xiàn)象，檢測(cè)效果好。另外，在用rt-pcr檢測(cè)常見(jiàn)的6種病毒pvx、pvy、pvs、pva、pvm和plrv以及類(lèi)病毒pstvd時(shí)，可通過(guò)改變pcr反應(yīng)體系中的溫度，實(shí)現(xiàn)多種病毒的同步檢測(cè)。 通過(guò)克隆測(cè)序，可了解馬鈴薯病毒的變異程度。馬鈴薯不同病毒的變異也有差異，本試驗(yàn)研究表明，陜北8縣（區(qū)）馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列的一致性在99.6%以上，而同地區(qū)馬鈴薯x病毒cp基因序列的一致性卻在95.2%99.4%。病毒變異率高低以及不同病毒變異率差異大小對(duì)馬鈴薯的產(chǎn)

18、量和品種有何影響，有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1 路 平，王 蒂，司懷軍.馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr快速檢測(cè)j.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（4）：532-534.2 李鳳云.馬鈴薯莖尖脫毒效果影響因素的研究j.中國(guó)馬鈴薯，2008，22（4）：201-204.3 吳興泉，時(shí) 妍，楊慶東，等.馬鈴薯病毒的rt-pcr檢測(cè)技術(shù)評(píng)述j.中國(guó)馬鈴薯，2011，25（4）：251-254.4 王建輝，劉建軍，陳克玲，等.三種葡萄病毒的rt-pcr檢測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化分析j.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2013，30（2）：197-201.5 nie x，singh r p. a novel usage of random

19、 primers for multiplex rt-pcr detection of virus and viroid in aphids，leaves，and tubersj. journal of virological methods，2001，91（1）：37-49.6 王中康，夏玉先，袁 青，等.馬鈴薯種苗復(fù)合感染病毒多重rt-pcr同步快速檢測(cè)j.植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（2）：109-115.7 董代幸，張祥林，羅 明，等.馬鈴薯病毒一步法多重rt-pcr檢測(cè)技術(shù)的構(gòu)建j.微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（1）：131-137.8 bright o a，patrick j s，p

20、hilip h b. simultaneous dection of potato viruses，plrv，pva，pvx and pvy from dormant potato tubers by tanman real-time rt-pcrj.journal of virological methods，2007，142（1-2）：1-9.9 sheila m m，michael g k，roger a c. a single tube，quantitative real-time rt-pcr assay that detects four potato viruses simult

21、aneouslyj. journal of virological methods，2009，161（2）：289-296.10 gambino g，gnbaudo i.simultaneous detection of nine grapevine viruses by multiplex rt-pcr with coamplification of a plant rna as internal controlj.virology，2006，96（11）：1223-1229.11 牛建新，馬兵鋼，何 梅，等.庫(kù)爾勒香梨主要病毒多重rt-pcr檢測(cè)技術(shù)研究j.植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（1

22、）：12-21.12 丁 銘，方 琦，李婷婷，等.馬鈴薯卷葉病毒云南分離物外殼蛋白基因的克隆與序列分析j. 植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（5）：473-476.13 吳興泉，譚曉榮，陳士華，等.馬鈴薯卷葉病毒福建分離物的基因克隆與序列分析j.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，40（4）：391-393.14 周 云，楊永智，王 艦.青海省馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr法檢測(cè)j.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（6）：210-211.15 courtney e j，amy o c，david k w. evaluation of isolation methods and rna integrity for

23、 bacterial rna quantitationj. journal of microbiological methods，2008，75（2）：318-324. 通過(guò)克隆測(cè)序，可了解馬鈴薯病毒的變異程度。馬鈴薯不同病毒的變異也有差異，本試驗(yàn)研究表明，陜北8縣（區(qū)）馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列的一致性在99.6%以上，而同地區(qū)馬鈴薯x病毒cp基因序列的一致性卻在95.2%99.4%。病毒變異率高低以及不同病毒變異率差異大小對(duì)馬鈴薯的產(chǎn)量和品種有何影響，有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1 路 平，王 蒂，司懷軍.馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr快速檢測(cè)j.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（4）：532

24、-534.2 李鳳云.馬鈴薯莖尖脫毒效果影響因素的研究j.中國(guó)馬鈴薯，2008，22（4）：201-204.3 吳興泉，時(shí) 妍，楊慶東，等.馬鈴薯病毒的rt-pcr檢測(cè)技術(shù)評(píng)述j.中國(guó)馬鈴薯，2011，25（4）：251-254.4 王建輝，劉建軍，陳克玲，等.三種葡萄病毒的rt-pcr檢測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化分析j.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2013，30（2）：197-201.5 nie x，singh r p. a novel usage of random primers for multiplex rt-pcr detection of virus and viroid in aphids，leaves，an

25、d tubersj. journal of virological methods，2001，91（1）：37-49.6 王中康，夏玉先，袁 青，等.馬鈴薯種苗復(fù)合感染病毒多重rt-pcr同步快速檢測(cè)j.植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（2）：109-115.7 董代幸，張祥林，羅 明，等.馬鈴薯病毒一步法多重rt-pcr檢測(cè)技術(shù)的構(gòu)建j.微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（1）：131-137.8 bright o a，patrick j s，philip h b. simultaneous dection of potato viruses，plrv，pva，pvx and pvy from dor

26、mant potato tubers by tanman real-time rt-pcrj.journal of virological methods，2007，142（1-2）：1-9.9 sheila m m，michael g k，roger a c. a single tube，quantitative real-time rt-pcr assay that detects four potato viruses simultaneouslyj. journal of virological methods，2009，161（2）：289-296.10 gambino g，gnba

27、udo i.simultaneous detection of nine grapevine viruses by multiplex rt-pcr with coamplification of a plant rna as internal controlj.virology，2006，96（11）：1223-1229.11 牛建新，馬兵鋼，何 梅，等.庫(kù)爾勒香梨主要病毒多重rt-pcr檢測(cè)技術(shù)研究j.植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（1）：12-21.12 丁 銘，方 琦，李婷婷，等.馬鈴薯卷葉病毒云南分離物外殼蛋白基因的克隆與序列分析j. 植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（5）：473-476

28、.13 吳興泉，譚曉榮，陳士華，等.馬鈴薯卷葉病毒福建分離物的基因克隆與序列分析j.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，40（4）：391-393.14 周 云，楊永智，王 艦.青海省馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr法檢測(cè)j.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（6）：210-211.15 courtney e j，amy o c，david k w. evaluation of isolation methods and rna integrity for bacterial rna quantitationj. journal of microbiological methods，2008，75（2）：318

29、-324. 通過(guò)克隆測(cè)序，可了解馬鈴薯病毒的變異程度。馬鈴薯不同病毒的變異也有差異，本試驗(yàn)研究表明，陜北8縣（區(qū)）馬鈴薯卷葉病毒cp基因序列的一致性在99.6%以上，而同地區(qū)馬鈴薯x病毒cp基因序列的一致性卻在95.2%99.4%。病毒變異率高低以及不同病毒變異率差異大小對(duì)馬鈴薯的產(chǎn)量和品種有何影響，有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1 路 平，王 蒂，司懷軍.馬鈴薯卷葉病毒的rt-pcr快速檢測(cè)j.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（4）：532-534.2 李鳳云.馬鈴薯莖尖脫毒效果影響因素的研究j.中國(guó)馬鈴薯，2008，22（4）：201-204.3 吳興泉，時(shí) 妍，楊慶東，等.馬鈴薯病毒的rt-

30、pcr檢測(cè)技術(shù)評(píng)述j.中國(guó)馬鈴薯，2011，25（4）：251-254.4 王建輝，劉建軍，陳克玲，等.三種葡萄病毒的rt-pcr檢測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化分析j.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2013，30（2）：197-201.5 nie x，singh r p. a novel usage of random primers for multiplex rt-pcr detection of virus and viroid in aphids，leaves，and tubersj. journal of virological methods，2001，91（1）：37-49.6 王中康，夏玉先，袁 青，等.馬鈴薯種苗復(fù)合感染病毒多重rt-pcr同步快速檢測(cè)j.植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（2）：109-115.7 董代幸，張祥林，羅 明，等.馬鈴薯病毒一步法多重rt-pcr檢測(cè)技術(shù)的構(gòu)建j.微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（1）：131-137.8 bright o a，patrick j s，philip h b. simultaneous dection of potato viruses，plrv，pva，pvx and pvy from dormant potato tubers by tanman real-time rt-pcrj.journal of viro