分子生物學方法在食品安全檢測中的應用

1、年第期月出版tr品工程© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版分子生物學方法在食品安全檢測中的應用土鑫車振明黃韜睿兩華大學生物工種學院成都© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishi

2、ng House. All rights reserved, 年第期月出版© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版摘 耍 綜述了食品中病原微生物的快速檢測方 法詳述r 技術(shù)和基岡芯片這兩種技術(shù)的研究 進展并對這兩種方法特點與應用進行了探討。關(guān)鍵詞 僅品安全 微生物 基因芯片 檢 測方法在 年 我國食品安全事件頻發(fā) 福壽螺 爭件、人造蜂蜜事件、毒豬油事件、多寶他爭件等 等都再次給人們敲響了食品安全的警鐘。隨著食品 匸業(yè)的發(fā)展以及對食品安全的巫視傳

3、統(tǒng)分析方法 已經(jīng)遠不能滿足食品檢測的需耍迫切盂耍靈敏度 更高、特界性更強、簡便快捷的fr品安全檢測技術(shù) 和方法因此近年來世界國的許多機構(gòu)和學者 都致力于快速檢測技術(shù)和方法的研究 改進和開發(fā) 了一些快速的檢測技術(shù)和方法 現(xiàn)將兒種主耍方法 概述如下。技術(shù) 技術(shù)即聚合福 王鑫女年出生西華大學生物丁程學院在讀碩I：研究生。收稿日期鏈式反應也稱無細胞克隆系統(tǒng)是 年誕生的 一項 體外擴増技術(shù) 該技術(shù)自問世以來 就以 驚人的速度廣泛地應用丁生命科學的眾多領域。前 在食品工程領域中致病性微生物、轉(zhuǎn)卑因tr品的檢測 等方面的應用也越來越受關(guān)注。技術(shù)的基本原理與方法技術(shù)是一種利用變性與復性原理在體外利用聚合酶活性

4、在引物的引導和脫氧核糖核口酸等參與下將模板在數(shù)小時內(nèi)進行百萬倍擴増。該技術(shù)利用兩段寡核口酸作為 反應的引物以及四種脫氧核昔三磷酸 、 聚合師作為反應物將提取到的 稱為模 板片段精確擴増。該酚促反應最基本的個環(huán)節(jié)是模板 的變性即在°C下模板雙 鏈變?yōu)閱捂溡锱c模板鏈的特異性復性由聚合幽催化引物引導璉山 向 延伸從而完成一個變性復性延伸 的 循環(huán)。至此完成了的第一輪反應 而后反復進行變性、復性和延伸的循環(huán) 從而使擴増 產(chǎn)鼠呈指數(shù)上升。技術(shù)在食品微生物檢測方面的應用單核細胞増多性李斯特氏菌單核細胞增多性李斯特氏菌是一種巫耍的人備共患病致病病菌 能引起人和動物腦膜炎、敗血癥及孕婦流產(chǎn)等 且

5、死亡率極高可達 。 廣泛存在于動物、水產(chǎn)品等中 主要通過食物進行傳播。過去對 食胡中進行檢測時克隆培養(yǎng)的標準方法需耍周的時間才能得出結(jié)果血涓學檢測方法如等也存在著特異性、敏感性差等問題 技術(shù)的出現(xiàn)給李氏菌的檢測帶來J'曙光。姜永強等 根據(jù)發(fā)農(nóng)的單核細胞増生性李斯特菌的巫耍毒力基 因的全皋囚字列 設計出引物 建立了該菌的 診斷方法。金大智等運用實時熒光技術(shù)建立對食晶中單増李氏菌進行檢 測的快速方法 設計的引物和探針的序列特異性 強省去凝膠電泳的繁瑣降低了污染的可能性。 對 種病原進彳j的檢測結(jié)果表明用實時熒光 法檢測單核細胞增多李斯特氏菌 更快速、敏 感、特異性更離。金黃色葡萄球菌金黃色

6、葡萄球菌腸帝素 可引起人類中毒 其內(nèi)毒素一中毒休克綜合癥毒素 可引起中 毒休克綜合癥產(chǎn)生的脫皮毒索 、 與一系 列膿皰性匍籀球菌感染有關(guān)。等建立了檢測上述毒素叢因的 技術(shù)可在較短的時間內(nèi)檢 測出匍轉(zhuǎn)球菌莓株并ILJI有極高的特異性、敏感 性。國內(nèi)2；泓若等選擇腸毒素基因的第 堿基為上游引物 第 堿基為下 游引物應用 技術(shù)擴增出 基因的 長的 片段并建立了肖接利用細繭裂解液作 為模板的方法。沙門氏菌等根據(jù)腸炎沙門氏菌克隆株貝有的屬特異性序列片段設計出一對引物能快速地檢測出肉食品標本中的沙門氏繭檢測的 敏感性和特異性均為這保證了檢測的準確性。沈孝民用技術(shù)對各種不同血消型的沙f J繭和C知被該菌污染

7、的魚粉和動物產(chǎn)品的肉湯培養(yǎng)物 進行了檢測 結(jié)果顯示該方法特異性高 IL靈敬、 快速并可在 之內(nèi)完成。腸弗素大腸桿菌腸毒素大腸桿菌簡稱耐熱菌是一種嗜熱、嗜 酸、好氧的細甫能從濃縮蘋果汁中分離得到該 繭能經(jīng)受巴氏殺菌而存活嚴巫影響濃縮果汁的胡 質(zhì)國際上已有多起耐熱菌導致犬規(guī)模果汁敗壞事 件的報道。目前國際上耍求每蘋果濃縮汁中耐熱葡含帚小T 耐熱菌超標已成為制約我國濃 縮蘋果汁出口的主耍障礙之一。H前對耐熱繭的檢 測方法仍為常規(guī)的培養(yǎng)檢測法耗時很長一般需 耍 才能出檢測報告。檢測結(jié)果的滯后性使 Z無法及時指導生產(chǎn)無法及時向生產(chǎn)線反饋信息 以采取相應的防范、控制與淸洗措施.技術(shù)能使微最的核酸在數(shù)小時之

8、內(nèi)擴増至 原來的數(shù)白力倍以上只耍選擇適合的引物就可 特異性地人量擴增某一特定的 片斷至易檢測 水平 因此理論上可以通過特異性地擴增耐熱菌的 基因片斷而對其實現(xiàn)快速檢測。技術(shù)存在的主要問題及展望技術(shù)雖為一種快速、特異、靈敏、簡便、 高效的檢測新技術(shù)但其在食品中致毒、致病性微 生物檢測的實際應用中也存在不少問題必須認真 分析乞種JI體情況采取必耍的措施以提高反應 的特斤件和做感件避兔假陽件或假陽件結(jié)果。污染問題是一種極為靈敏的反應一旦有極少臬外 源性 污染就可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果所以在 操作時必須加以注意。假陰性問題僅品是復雜的反應基質(zhì)影響 反應的因索 很多如果不能冇效排除各影響因素的干擾很可 能出現(xiàn)

9、假陰性結(jié)果。此外如果在 操作過程中 各種實驗條件控制不當很容易導致產(chǎn)物突變也 會導致假陰性結(jié)果。對于這些問題必須有充分的考 慮和排除措施。引物設計及靶序列選擇引物的設計及靶序列的選擇是決定 結(jié)果的 關(guān)鍵因素引物不同則擴増物不同如果引物的設 計不當則直接彩響對關(guān)鍵靶序列的選擇降低檢測的靈敏度和特異性真至完全失敗。岡 而必須對擴增序列有充分的了解并規(guī)范 實 驗室操作技術(shù)。盡竹 技術(shù)在tr品的微生物安全性檢測方面 還存在著一些問題 但相信隨著研究的深入 這項 技術(shù)必將得以完善并迅速成為可以信賴的快速檢 測手段?；蛐酒夹g(shù)朋因芯片技術(shù)是鑒別微生物和轉(zhuǎn)展因成分厳有 效的手段之一 為全而、快速、球確地進

10、行伶品安 全檢測提供了一個嶄新的平臺。慕因芯片 芯 片、 微陣列技術(shù)是近十兒年來在生命科學領 域迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)是一項基于基因 農(nóng)達和堆肉功能研究的革命性技術(shù) 他綜合了分子© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版王鑫分屮生物學方仏在僅胡安全檢測中的應川© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期

11、月出版© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved, 年第期月出版生物學、半導體微電子、激光、化學染料等領域的 垠新科學技術(shù)在生命科學和信息科學之.間架起了 道橋梁 是當今世界上高度交義、髙度綜介的詢 沿學科和研究熱點。LI前基因芯片正在成為獨品和 僅品原料檢測中一種較新的方法檢測僅品的營養(yǎng) 成分監(jiān)骨僅品的衛(wèi)生、安全和ft品質(zhì)杲保證人 類健廉并FI將對整個食品領域產(chǎn)生深刻的影響。宰內(nèi)芯片技術(shù)的基本原理與先進性將各種基因寡核伴酸點樣F芯片表面微生物 樣品 經(jīng) 擴增后

12、 制備熒光標記探針 然 后再與芯片上的寡孩疔酸點朵交最后通過扌3描儀 定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在 某些特定微生物.該技術(shù)可檢測各種介質(zhì)中的微牛物研究復雜 微生物群體的皋兇農(nóng)達。與傳統(tǒng)的檢測方法細肅培 養(yǎng)、生化鑒定、血消分型等相比 皐岡芯片技術(shù)的 先進性主耍體觀在 基因芯片可以實現(xiàn)微生物的 鬲通量和并行險測-次實驗即可得出全部結(jié)果 操作簡便快速幣個檢測只而 基本可以出結(jié) 果而傳統(tǒng)方法一般需特異性強敏感性高。宰因芯片技術(shù)在食胡微生物檢測方面的應用Cr品衛(wèi)生檢測中一個重耍的方面是及時準確的 檢測出仃胡中的病原性微生物 這些致病微t物的 存在會嚴巫威協(xié)人類的健康.不潔或音帶有致病菌

13、的fr品不僅造成大的經(jīng)濟損欠 還會嚴!（危害消 費者的健康 從食品的生產(chǎn)、加匸、運輸、銷倚、 消費的各個環(huán)節(jié)都極易被各種病菌污染。統(tǒng)計農(nóng)明在抽檢的一部分負胡中過去年由于受致 病菌污染而從市場上撤回的tr品數(shù)屋增加了 倍。中國在加入后而臨同樣的問題過去年中不僅發(fā)現(xiàn)了許多新的病菌而且一些已知病菌 也出現(xiàn)了抗性増強的趨勢以前被認為無害的微生 物在獲得致病基因和抗性厲也會導致許多致命的疾 病。由r缺乏介適的檢測方法這些致病繭即使偶 爾出現(xiàn)在食品屮也不能及時被檢測m來對人類 健康造成-定的威脅。僅品微生物的檢驗是確保茂 品質(zhì)鼠和安全的重耍于段因此加強對有書病菌的 篩選與檢測可有效防11：倉品被并種微生物

14、特別是 致病菌的污染和各種傳染病的蔓延。傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)檢測方法需耍經(jīng)過兒天的微生 物培養(yǎng)和復雜的計數(shù) 操作繁朵 不能及時反映生 產(chǎn)過程或銷售過程中的污染情況且靈敏度不高使得食品的安全檢測潛在一定的危險給消費者帶 來很大的威脅法快速比前者靈敏但成本高假陽性多也不是很好的檢測食品微生物污染 的方法?；蛐酒蓮V泛的應用于各種導致食卅| 敗的致病菌的檢測 該技術(shù)具有快速、準確、靈敏 等優(yōu)點可以及時反映食品中微生物的污染情況。 國內(nèi)外都已開始食品微生物檢測芯片的研究 并収 得了一些肯定的結(jié)論?；鶎酒瑢Ｒ恍院媚軌?qū)κ澈形廴镜奈⑸?物實現(xiàn)快速的在線檢測及時反映茂品屮存在的問 題為危害分析的關(guān)鍵控制點提

15、供可行的權(quán)威性報告。芯片還能對農(nóng)作物致病繭包括病帶、細 菌、直菌和線蟲迅速作出檢測常常能達到株或?qū)?的水平保證食胡原料的安全性能對畚類、水產(chǎn) 類進行微生物檢測 鑒別乳制品的好壞 檢測肉制 品的優(yōu)劣 真實判斷肉混合制品中某種成分的數(shù) 量。從 年開始我國每年都會爆發(fā)對蝦流行 性病帝病其危書是災難性的中國科存院海洋所 的徐洪濤借助 雜交技術(shù)將該病即的 作 成探針進行雜交從分子牛物學角度證明白斑病毒 感染是造成中國大陸對蝦連年爆發(fā)流行 病的主耍原 因。基因芯片技術(shù)存在的問題與展魁存在問題展內(nèi)芯片技術(shù)的研究和應用前景十分誘人但 作為一項新技術(shù) 仍有一些問題需耍解決 該技 術(shù)需要大量的已測知的、準確的 、

16、片段的信息 他們使該技術(shù)成為人規(guī)模、集成化和整體 獲取生物信息的仃效手段*亍芯片制作工藝復 雜 信號檢測也需專門的儀器設備 一般實驗室難 以承擔其高昂的費用樣品制備和標記比較復 朵沒有一個統(tǒng)一的質(zhì)鼠控制標準實驗室不能 共享數(shù)據(jù)和資料庫等。這些都在一定程度上限制了 基因芯片技術(shù)在食晶檢測中的應用。解決方法與發(fā)展方向為使卑因芯片成為實驗室研究或?qū)嵺`中可以普 遍采用的技術(shù) 須從以下兒方面著手解決問題 提高慕因芯片的特井件、幣:宜性簡化樣品制備 和標記操作 増加信號檢測的靈敏度 研制和 開發(fā)高度集成化的樣胡制備、基因擴増、孩酸標記 及檢測儀器。另外食胡及食品原料中不斷出現(xiàn)的 新轉(zhuǎn)入?yún)惨蚣癈T晶病原微生

17、物的復雜化也是茂品檢測中應用基丙芯片技術(shù)需耍解決的問題?；蛐酒夹g(shù)盡管存在一定的不足和局限但 該技術(shù)八仃檢測系統(tǒng)微型化、檢測樣胡微磺化的特 點同時兼I檢測效率高、能同時分析多種基因或 診斷 序列的優(yōu)勢很適丁僅品中病原微生物 和轉(zhuǎn)展因成分的檢測及鑒定隨著研究的不斷深入 和技術(shù)的完善基因芯片技術(shù)一足會在食品科學研 究領域發(fā)揮越來越重要的作用。其他分子生物學檢測技術(shù)核酸探針技術(shù)核酸探針是指帶有標記的特異片斷.根據(jù)堿基互補原則 核酸探針能特異性地與冃的 雜交垠后用特定的方法測定標記物.探針標記方 式分為放射性標記、非放射性標記。放射性標記的 核酸探針的特異性非常強檢測病原微生物速度比 常規(guī)方法快得多

18、。U前用的較多的是用生物索 抗生物素蛋門系統(tǒng)標記的非放射性核酸探針該探 針已在沙門氏商、產(chǎn)腸毒索大腸桿商及乙型肝炎病 毒檢測中得到了廣泛應用。基因重組法由于基因重組尤其是轉(zhuǎn)化作用僅出現(xiàn)丁同 種或親緣關(guān)系分近的菌株Z間 所以堆因巫組技 術(shù)可以用丁細茵的分類和鑒定中。如用轉(zhuǎn)化法測定 由食品傳染的、能引起痢疾的志賀氏細菌?；鶅?nèi)重 紐法無需對待測菌株進行純培養(yǎng)而II無需什么特 殊的試劑和設備 簡便易行 所以是一種很有前途 的鑒定法。食品安全檢測方法的缺點和不足而TI還貝有靈敏 度高、操作簡便、檢測周期短、檢測成本低等優(yōu) 點。 探針雜交與 聯(lián)介使用檢測食胡微生 物將是今后tr品微生物檢測技術(shù)的一個巫耍研究方 向若能克服兩者存在的易污染產(chǎn)生假陽性結(jié)果的 缺失 相信大規(guī)模推廣應用指日可待.參考文獻姜永強雷詐榮李瑾等應用 方法檢 定單孩細胞増多性李斯特菊 中華預防醫(yī) 學雜志金大智謝明杰曹際姐代品中單增李氏菌 實時熒光 檢測鑒定方法的建立 遼寧 師范大學學報自然科學版云泓若 李月琴 周天鴻 技術(shù)檢測金黃色爸萄球繭腸毒索自然科學版沈孝民涂書淸用中沙門氏菌的研究基因 暨南大學學報技術(shù)檢測動物產(chǎn)品 追究動物檢疫社巍定屋 技術(shù)在食源性致病微生物檢測中的應用 食晶科學王元平 吳淸平 張菊梅 等基因芯片技術(shù)及 貳在食品衛(wèi)生微生物檢測中的應用 中國 衛(wèi)生檢驗雜志© 1994-20