利用Spurr樹(shù)脂包埋制備植物半薄切片方法研究

1、    利用spurr樹(shù)脂包埋制備植物半薄切片方法研究    王偉+朱佩燕摘 要：以擬南芥的根和葉片為材料，對(duì)利用spurr樹(shù)脂低粘度包埋劑進(jìn)行植物樣品包埋技術(shù)進(jìn)行了討論和改進(jìn)。關(guān)鍵詞：半薄切片；spurr樹(shù)脂；技術(shù)q81 a 1007-7731（2014）16-16-02半薄切片技術(shù)是將以樹(shù)脂作為包埋劑，用超薄切片機(jī)或石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片的技術(shù)。通過(guò)該技術(shù)所得到的切片厚度一般為0.53m，介于超薄切片和石蠟切片之間，因而被稱(chēng)為半薄切片，通常用于光學(xué)顯微鏡進(jìn)行較細(xì)微組織的觀察，或用于電子顯微鏡的初步組織定位1-2。半薄切片的制備與電鏡超薄切片的步驟較為類(lèi)似

2、，也需要經(jīng)過(guò)固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟，但由于其組織結(jié)構(gòu)保存較好，而且切片較薄，因此在光鏡下對(duì)于較細(xì)微組織結(jié)構(gòu)的觀察效果要比常規(guī)石蠟切片好，目前已被廣泛應(yīng)用于植物各個(gè)組織的顯微結(jié)構(gòu)的觀察。傳統(tǒng)上常采用epon 812作為包埋劑來(lái)制備半薄切片，但由于植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，尤其對(duì)于根尖及種子等材料，其具有致密的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而epon 812樹(shù)脂的粘度較高，因而在使用epon 812樹(shù)脂作為包埋劑時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)滲透不好的問(wèn)題，切片過(guò)程中出現(xiàn)空洞或破碎等現(xiàn)象；且由于epon 812樹(shù)脂易吸潮，在濕度大的時(shí)候容易發(fā)軟，使得難以切出較好的樣品3。而低黏度包埋劑spurr樹(shù)脂相對(duì)于epon 812樹(shù)脂，

3、具有黏度低、滲透效果好、所需聚合時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，更適用于植物材料的包埋處理。本文利用spurr樹(shù)脂作為包埋劑制備了擬南芥的葉及根的半薄切片，并對(duì)利用spurr樹(shù)脂包埋制備植物半薄切片的方法及可能遇到的一些問(wèn)題進(jìn)行了探討。1 材料與方法1.1 供試材料 擬南芥成熟葉片及根。spurr樹(shù)脂包埋試劑盒購(gòu)自美國(guó)polyscience公司，由erl4221樹(shù)脂、d.e.r736增塑劑、nsa硬化劑和dmae催化劑4種成分組成。1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取新鮮葉片或根用雙面刀片切成35mm厚的薄片或小段，放入含有4%（w/v）多聚甲醛、2%（w/v）戊二醛的50mm的二甲基砷酸鈉緩沖液（ph7.2）中，抽氣后置于4

4、固定24h以上。然后用50mm的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進(jìn)行清洗，然后將樣品轉(zhuǎn)移至含有2%鋨酸的二甲基砷酸鈉緩沖液中放置2h進(jìn)行前染色，再次用50mm的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進(jìn)行清洗，經(jīng)25%，50%，75%，95%和100%乙醇逐級(jí)脫水，每級(jí)不少于30min。無(wú)水乙醇脫水2h以上，并經(jīng)環(huán)氧丙烷進(jìn)一步置換脫水2次，每次1020min，將預(yù)先混合配制好的spurr樹(shù)脂和環(huán)氧丙烷按11滲透1h以上，再次用spurr樹(shù)脂滲透樣品2h。利用小的pcr管或ep管為模具，將樣品置于樹(shù)脂中進(jìn)行包埋，70聚合24h以上，冷卻后即可進(jìn)行半薄切片。切片厚度通常為12m，用

5、睫毛筆撈片至載玻片上，加水放展片臺(tái)上60進(jìn)行展片，并滴加0.5%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色。2 結(jié)果與分析3 討論（1）spurr樹(shù)脂生產(chǎn)商廠家給出的標(biāo)準(zhǔn)配方。但由于spurr樹(shù)脂受溫度和濕度影響較大，因此，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)氣候和工作條件的不同來(lái)調(diào)整配方。一般在北方的冬季需適當(dāng)增加增塑劑的含量，而在夏季和南方等雨水較多地區(qū)則應(yīng)適當(dāng)增加硬化劑的含量。由于包埋試劑盒中的硬化劑nsa對(duì)水分敏感，因此混合好的樹(shù)脂應(yīng)存放于密閉的干燥器中，盡量減少暴露于空氣中的時(shí)間，并盡快與材料共同轉(zhuǎn)入pcr或ep管中蓋緊蓋子進(jìn)行聚合。由于spurr樹(shù)脂中的成分可與硅膠反應(yīng)，應(yīng)盡量避免使用硅膠模具，防止兩者之間粘連導(dǎo)致包埋

6、塊難以取出或變脆。（2）在包埋樣品時(shí)，應(yīng)根據(jù)所需進(jìn)行切片的方向?qū)Σ牧衔恢眠M(jìn)行調(diào)整。對(duì)于擬南芥根或葉片較為細(xì)薄的樣品，可在樣品下沿與樣品軸向垂直方向放置一根或若干根干凈的頭發(fā)絲，避免樣品過(guò)于接近包埋塊的邊緣，從而有利于修塊并防止由于過(guò)于接近包埋塊邊緣而在切片時(shí)出現(xiàn)碎裂現(xiàn)象。（3）在進(jìn)行染色的過(guò)程中，則需要保持在60加熱條件下滴加結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，染色液配置后需過(guò)濾去除雜質(zhì)后才可使用，染色23min后用水蒸餾水洗去多余染液，濾紙吸干，于60繼續(xù)展片干燥后即可觀察或中性樹(shù)膠封片。參考文獻(xiàn)1李和平.植物顯微技術(shù)m.北京：科學(xué)出版社，2009：67-78.2于紅麗，張大紅，徐夏紅，等.電鏡半薄切片制備

7、方法的改進(jìn)j.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24（2）：129-130.3楊瑞，范敬偉，劉文可，等.植物透射電鏡樣品制備技術(shù)的改進(jìn)及不同樹(shù)脂選擇比較j.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28（4）：5-7.（責(zé)編：張宏民）endprint摘 要：以擬南芥的根和葉片為材料，對(duì)利用spurr樹(shù)脂低粘度包埋劑進(jìn)行植物樣品包埋技術(shù)進(jìn)行了討論和改進(jìn)。關(guān)鍵詞：半薄切片；spurr樹(shù)脂；技術(shù)q81 a 1007-7731（2014）16-16-02半薄切片技術(shù)是將以樹(shù)脂作為包埋劑，用超薄切片機(jī)或石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片的技術(shù)。通過(guò)該技術(shù)所得到的切片厚度一般為0.53m，介于超薄切片和石蠟切片之間，因而被稱(chēng)為半薄切片，通常用于

8、光學(xué)顯微鏡進(jìn)行較細(xì)微組織的觀察，或用于電子顯微鏡的初步組織定位1-2。半薄切片的制備與電鏡超薄切片的步驟較為類(lèi)似，也需要經(jīng)過(guò)固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟，但由于其組織結(jié)構(gòu)保存較好，而且切片較薄，因此在光鏡下對(duì)于較細(xì)微組織結(jié)構(gòu)的觀察效果要比常規(guī)石蠟切片好，目前已被廣泛應(yīng)用于植物各個(gè)組織的顯微結(jié)構(gòu)的觀察。傳統(tǒng)上常采用epon 812作為包埋劑來(lái)制備半薄切片，但由于植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，尤其對(duì)于根尖及種子等材料，其具有致密的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而epon 812樹(shù)脂的粘度較高，因而在使用epon 812樹(shù)脂作為包埋劑時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)滲透不好的問(wèn)題，切片過(guò)程中出現(xiàn)空洞或破碎等現(xiàn)象；且由于epon 812樹(shù)脂易

9、吸潮，在濕度大的時(shí)候容易發(fā)軟，使得難以切出較好的樣品3。而低黏度包埋劑spurr樹(shù)脂相對(duì)于epon 812樹(shù)脂，具有黏度低、滲透效果好、所需聚合時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，更適用于植物材料的包埋處理。本文利用spurr樹(shù)脂作為包埋劑制備了擬南芥的葉及根的半薄切片，并對(duì)利用spurr樹(shù)脂包埋制備植物半薄切片的方法及可能遇到的一些問(wèn)題進(jìn)行了探討。1 材料與方法1.1 供試材料 擬南芥成熟葉片及根。spurr樹(shù)脂包埋試劑盒購(gòu)自美國(guó)polyscience公司，由erl4221樹(shù)脂、d.e.r736增塑劑、nsa硬化劑和dmae催化劑4種成分組成。1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取新鮮葉片或根用雙面刀片切成35mm厚的薄片或小段，

10、放入含有4%（w/v）多聚甲醛、2%（w/v）戊二醛的50mm的二甲基砷酸鈉緩沖液（ph7.2）中，抽氣后置于4固定24h以上。然后用50mm的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進(jìn)行清洗，然后將樣品轉(zhuǎn)移至含有2%鋨酸的二甲基砷酸鈉緩沖液中放置2h進(jìn)行前染色，再次用50mm的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進(jìn)行清洗，經(jīng)25%，50%，75%，95%和100%乙醇逐級(jí)脫水，每級(jí)不少于30min。無(wú)水乙醇脫水2h以上，并經(jīng)環(huán)氧丙烷進(jìn)一步置換脫水2次，每次1020min，將預(yù)先混合配制好的spurr樹(shù)脂和環(huán)氧丙烷按11滲透1h以上，再次用spurr樹(shù)脂滲透樣品2h。利用小的pcr

11、管或ep管為模具，將樣品置于樹(shù)脂中進(jìn)行包埋，70聚合24h以上，冷卻后即可進(jìn)行半薄切片。切片厚度通常為12m，用睫毛筆撈片至載玻片上，加水放展片臺(tái)上60進(jìn)行展片，并滴加0.5%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色。2 結(jié)果與分析3 討論（1）spurr樹(shù)脂生產(chǎn)商廠家給出的標(biāo)準(zhǔn)配方。但由于spurr樹(shù)脂受溫度和濕度影響較大，因此，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)氣候和工作條件的不同來(lái)調(diào)整配方。一般在北方的冬季需適當(dāng)增加增塑劑的含量，而在夏季和南方等雨水較多地區(qū)則應(yīng)適當(dāng)增加硬化劑的含量。由于包埋試劑盒中的硬化劑nsa對(duì)水分敏感，因此混合好的樹(shù)脂應(yīng)存放于密閉的干燥器中，盡量減少暴露于空氣中的時(shí)間，并盡快與材料共同轉(zhuǎn)入pcr或e

12、p管中蓋緊蓋子進(jìn)行聚合。由于spurr樹(shù)脂中的成分可與硅膠反應(yīng)，應(yīng)盡量避免使用硅膠模具，防止兩者之間粘連導(dǎo)致包埋塊難以取出或變脆。（2）在包埋樣品時(shí)，應(yīng)根據(jù)所需進(jìn)行切片的方向?qū)Σ牧衔恢眠M(jìn)行調(diào)整。對(duì)于擬南芥根或葉片較為細(xì)薄的樣品，可在樣品下沿與樣品軸向垂直方向放置一根或若干根干凈的頭發(fā)絲，避免樣品過(guò)于接近包埋塊的邊緣，從而有利于修塊并防止由于過(guò)于接近包埋塊邊緣而在切片時(shí)出現(xiàn)碎裂現(xiàn)象。（3）在進(jìn)行染色的過(guò)程中，則需要保持在60加熱條件下滴加結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，染色液配置后需過(guò)濾去除雜質(zhì)后才可使用，染色23min后用水蒸餾水洗去多余染液，濾紙吸干，于60繼續(xù)展片干燥后即可觀察或中性樹(shù)膠封片。參考文獻(xiàn)

13、1李和平.植物顯微技術(shù)m.北京：科學(xué)出版社，2009：67-78.2于紅麗，張大紅，徐夏紅，等.電鏡半薄切片制備方法的改進(jìn)j.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24（2）：129-130.3楊瑞，范敬偉，劉文可，等.植物透射電鏡樣品制備技術(shù)的改進(jìn)及不同樹(shù)脂選擇比較j.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28（4）：5-7.（責(zé)編：張宏民）endprint摘 要：以擬南芥的根和葉片為材料，對(duì)利用spurr樹(shù)脂低粘度包埋劑進(jìn)行植物樣品包埋技術(shù)進(jìn)行了討論和改進(jìn)。關(guān)鍵詞：半薄切片；spurr樹(shù)脂；技術(shù)q81 a 1007-7731（2014）16-16-02半薄切片技術(shù)是將以樹(shù)脂作為包埋劑，用超薄切片機(jī)或石蠟切片機(jī)進(jìn)行

14、切片的技術(shù)。通過(guò)該技術(shù)所得到的切片厚度一般為0.53m，介于超薄切片和石蠟切片之間，因而被稱(chēng)為半薄切片，通常用于光學(xué)顯微鏡進(jìn)行較細(xì)微組織的觀察，或用于電子顯微鏡的初步組織定位1-2。半薄切片的制備與電鏡超薄切片的步驟較為類(lèi)似，也需要經(jīng)過(guò)固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟，但由于其組織結(jié)構(gòu)保存較好，而且切片較薄，因此在光鏡下對(duì)于較細(xì)微組織結(jié)構(gòu)的觀察效果要比常規(guī)石蠟切片好，目前已被廣泛應(yīng)用于植物各個(gè)組織的顯微結(jié)構(gòu)的觀察。傳統(tǒng)上常采用epon 812作為包埋劑來(lái)制備半薄切片，但由于植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，尤其對(duì)于根尖及種子等材料，其具有致密的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而epon 812樹(shù)脂的粘度較高，因而在使用epon

15、 812樹(shù)脂作為包埋劑時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)滲透不好的問(wèn)題，切片過(guò)程中出現(xiàn)空洞或破碎等現(xiàn)象；且由于epon 812樹(shù)脂易吸潮，在濕度大的時(shí)候容易發(fā)軟，使得難以切出較好的樣品3。而低黏度包埋劑spurr樹(shù)脂相對(duì)于epon 812樹(shù)脂，具有黏度低、滲透效果好、所需聚合時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，更適用于植物材料的包埋處理。本文利用spurr樹(shù)脂作為包埋劑制備了擬南芥的葉及根的半薄切片，并對(duì)利用spurr樹(shù)脂包埋制備植物半薄切片的方法及可能遇到的一些問(wèn)題進(jìn)行了探討。1 材料與方法1.1 供試材料 擬南芥成熟葉片及根。spurr樹(shù)脂包埋試劑盒購(gòu)自美國(guó)polyscience公司，由erl4221樹(shù)脂、d.e.r736增塑劑、

16、nsa硬化劑和dmae催化劑4種成分組成。1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取新鮮葉片或根用雙面刀片切成35mm厚的薄片或小段，放入含有4%（w/v）多聚甲醛、2%（w/v）戊二醛的50mm的二甲基砷酸鈉緩沖液（ph7.2）中，抽氣后置于4固定24h以上。然后用50mm的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進(jìn)行清洗，然后將樣品轉(zhuǎn)移至含有2%鋨酸的二甲基砷酸鈉緩沖液中放置2h進(jìn)行前染色，再次用50mm的二甲基砷酸鈉緩沖液分4次，每次浸泡15min進(jìn)行清洗，經(jīng)25%，50%，75%，95%和100%乙醇逐級(jí)脫水，每級(jí)不少于30min。無(wú)水乙醇脫水2h以上，并經(jīng)環(huán)氧丙烷進(jìn)一步置換脫水2次，每次1020min

17、，將預(yù)先混合配制好的spurr樹(shù)脂和環(huán)氧丙烷按11滲透1h以上，再次用spurr樹(shù)脂滲透樣品2h。利用小的pcr管或ep管為模具，將樣品置于樹(shù)脂中進(jìn)行包埋，70聚合24h以上，冷卻后即可進(jìn)行半薄切片。切片厚度通常為12m，用睫毛筆撈片至載玻片上，加水放展片臺(tái)上60進(jìn)行展片，并滴加0.5%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色。2 結(jié)果與分析3 討論（1）spurr樹(shù)脂生產(chǎn)商廠家給出的標(biāo)準(zhǔn)配方。但由于spurr樹(shù)脂受溫度和濕度影響較大，因此，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)氣候和工作條件的不同來(lái)調(diào)整配方。一般在北方的冬季需適當(dāng)增加增塑劑的含量，而在夏季和南方等雨水較多地區(qū)則應(yīng)適當(dāng)增加硬化劑的含量。由于包埋試劑盒中的硬化劑nsa對(duì)水分敏感，因此混合好的樹(shù)脂應(yīng)存放于密閉的干燥器中，盡量減少暴露于空氣中的時(shí)間，并盡快與材料共同轉(zhuǎn)入pcr或ep管中蓋緊蓋子進(jìn)行聚合。由于spurr樹(shù)脂中的成分可與硅膠反應(yīng)，應(yīng)盡量避免使用硅膠模具，防止兩者之間粘連導(dǎo)致包埋塊難以取出或變脆。（2）在包埋樣品時(shí)，應(yīng)根據(jù)所需進(jìn)行切片的方向?qū)Σ牧衔恢眠M(jìn)行調(diào)整。對(duì)于擬南芥根或葉片較為細(xì)薄的樣品，可在樣品下沿與樣品軸向垂直方向放置一根或若干根干凈的頭發(fā)絲，避免樣品過(guò)于接近包埋塊的邊緣，從而有利于修塊并防止由于過(guò)于接近包埋塊邊緣而在切片時(shí)出現(xiàn)碎裂現(xiàn)象。（3）在進(jìn)行染色