WesternBlot結(jié)果條帶全面分析

1、學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考Western Blot結(jié)果條帶全面分析Q1. 啥也沒有原因 ：比較多，如果單純一張沒有任何顯色的X 光片，最可能是一抗加成其他抗體，或者二抗種屬加錯了，比如兔的加成鼠的。解決辦法 ：仔細檢查抗體是否加錯，確認轉(zhuǎn)膜沒有問題。經(jīng)驗 ：上面的圖片展示的是一點信號都沒有，如果是這樣大部分情況是抗體加錯了。如果中間出現(xiàn)了細微的條帶，可能原因是蛋白上樣量太少，一抗?jié)舛冗^低， ECL發(fā)光液失效。另外如果轉(zhuǎn)膜出現(xiàn)了問題，比如膜放反了，自然是一個白片。Q2. 高背景原因 ：封閉不夠好，一抗?jié)舛雀?，洗膜時間和次數(shù)不夠解決辦法 ：降低一抗?jié)舛龋黾酉茨r間和次數(shù)。經(jīng)驗 ：高背景可能是W

2、B 中最常見出現(xiàn)的問題，目的條帶單一清晰，但是其他地方又彌漫性較為均一的背景 （比較連續(xù)的） 。其實只要我們注意操作規(guī)范， 不偷工減料就很容易避免，洗膜按照規(guī)定來 5min*5 次或者 10min*3 次，不要改成 5min*3 次，或者 10min*2 次。Q3. 非特異性條帶原因 ：一抗非特異性與蛋白結(jié)合解決辦法 ：更換一抗經(jīng)驗 ：此種情況絕大多數(shù)是因為一抗不好，你無法判斷那一條是目的條帶。如果實在沒有更好的抗體， 建議采用陰性對照和陽性對照來確定上述哪個條帶是目的條帶。 當然這種情況下有一種很小幾率的可能是一抗?jié)舛忍咭鸬姆翘禺愋越Y(jié)合。Q4. 條帶中出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈原因 ：電轉(zhuǎn)中膜和

3、膠之間存在氣泡。解決辦法 ：轉(zhuǎn)膜前去掉膜和膠之間的氣泡經(jīng)驗 ：我們常常將電轉(zhuǎn)液倒入一個盤子里，倒入的液體不能太多也不能太少，最好的高度是與放上第一層濾紙齊平， 然后往濾紙上澆點轉(zhuǎn)膜液， 把電泳膠用清水清洗下， 將電泳膠平鋪到濾紙上， 仔細檢查濾紙與膠之間是否有氣泡， 可以左右前后觀察， 不同方向觀察之后確認無氣泡，然后再往膠上面澆點電轉(zhuǎn)液，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜的兩側(cè)中間，使膜成U 型，然后將U 型的底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣一般氣泡很少。然后上層濾紙同樣用U 型的放置方法，用玻璃棒稍微貼實下，然后蓋上海綿。注意不要來回趕氣泡，這樣反而會帶入氣泡。Q5. 條帶中間

4、出現(xiàn)白色（反白）原因 ：中心部位高濃度HRP把底物消耗過快，中間部位底物消耗結(jié)束之后就不發(fā)光了解決辦法 ：降低蛋白量，降低一抗和二抗的濃度。經(jīng)驗 ：如果你足夠迅速，可以在中間部位底物消耗之前就把X 光片給定影出來，但是時間很難把握，建議還是從降低蛋白量，降低一抗二抗?jié)舛热胧帧W(xué)習(xí)資料學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考Q6. 出現(xiàn)黑點和黑斑原因 ：膜上其他部位與一抗或者二抗非特異性結(jié)合解決辦法 ：封閉牛奶一定要純，封閉結(jié)束之后要洗經(jīng)驗 ：我們常常是等到要封閉的時候發(fā)現(xiàn)沒有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的時候往往不管是否已經(jīng)完全溶解，如果沒有完全溶解的情況下加牛奶倒膜上，會導(dǎo)致很多

5、不溶性顆粒附著在膜上， 這就會導(dǎo)致發(fā)光時候膜上的黑點。 所以牛奶溶解之后， 最好靜止一下，然后輕輕地吸取上層牛奶進行封閉，封閉結(jié)束之后一定要洗三遍之后再加一抗。Q7. 條帶拖尾原因 ：蛋白量太大，一抗?jié)舛群蜁r間太長解決辦法 ：根據(jù)情況調(diào)整蛋白量，同時一抗?jié)舛群蜁r間也可以縮短。經(jīng)驗 ：這種情況很容易出現(xiàn)，因為很多原因都可能導(dǎo)致這一個結(jié)果。一般來說，蛋白量都是我們經(jīng)過很多次摸索得出的最適蛋白量，因此不太可能是蛋白量過多引起的。最有可能的是因為一抗?jié)舛忍?，作用時間太長引起的。另外洗一抗和洗二抗千萬不要偷工減漏，建議5min*5 次，不要但是洗這么多次就把抗體和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮，真正

6、的抗原抗體的結(jié)合是通過這種方式洗不掉的。Q8. 出現(xiàn)重影原因 ：熒光強度比較高，在壓片時，放好之后不小心又輕微移動了一段距離解決辦法 ： X 光片放上去之后，就不要動了，即使放歪了也沒關(guān)系。經(jīng)驗 ：有的時候出現(xiàn)重新剛好在上下位置，并且重影會相對弱一些，不要誤以為抗體識別了該蛋白的另外一種異構(gòu)形式。Q9. 出現(xiàn)非均一性背景原因 ：膜可能曾經(jīng)干過解決辦法 ：在每一步的操作過程中，都需要注意不要讓膜干經(jīng)驗 ：在封閉的時候， 洗一抗， 洗二抗， 以及發(fā)光的時候都時刻需要注意蛋白面不要風(fēng)干，風(fēng)干之后結(jié)果很可能就是這個樣子。注意與高背景區(qū)別。Q10. 某個條帶變形原因 ： SDSPAGE膠中存在氣泡或者某

7、不溶性顆粒解決辦法 ：配膠過程中要小心，使用無雜質(zhì)的液體。經(jīng)驗 ：很多實驗室中使用的不是最新的設(shè)備， 比如配膠用的海綿墊， 如果用了很多年之后，會從下面往上面漏小氣泡， 當氣泡足夠小并且膠快凝固的時候， 走到中間的小氣泡就停留在膠內(nèi)，并會影響到后面的跑膠。另外配膠用的水，SDS， Tris 緩沖液要注意不要有雜質(zhì)。Q11. 條帶呈啞鈴狀原因 ：配置膠有問題解決辦法 ：把膠配好，不合格的膠堅決不用經(jīng)驗 ：出現(xiàn)啞鈴最大的可能是膠沒有配置好，膠凝固后不均一，不知道大家有沒有出現(xiàn)如下的配膠情況， 下圖中示意拔完梳子之后的結(jié)果，如果你拔完梳子之后出現(xiàn)圖中下面部分的樣子， 多半會出現(xiàn)啞鈴狀。另外還有一種可

8、能是樣品中含有太多雜質(zhì)，沒有離心下來， 然后雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白自然被推擠到兩邊。學(xué)習(xí)資料學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考Q12. 最邊緣條帶彎曲原因 ：電泳電流不均一解決辦法 ：換用新的電泳槽；不使用兩邊的兩孔經(jīng)驗 ：一般我們使用的是10 孔的的膠，如果你上樣剛好10 個孔，那么最兩頭的兩個孔肯定會歪曲。另外上樣最好在膠的中間，這樣電場均一。Q13. 電泳過程中出現(xiàn)現(xiàn)象及問題（ 1）整個條帶呈 “ ”狀：凝膠冷卻不均一，電泳槽老化。（ 2）整個條帶呈 “ ”： 凝膠左右兩頭沒有凝固好（ 3）溴酚藍拖尾：樣品溶解不好。（ 4）縱向的紋理：上樣樣品中存在不溶性顆粒（ 5）溴酚藍很粗：濃縮膠濃縮效果不好，可能是濃縮膠太短，或者是濃縮膠配錯。（ 6）在分離膠中跑不動： Tris-Cl PH值不對，或者忘記加 SDS。Q14. 其他問題（1）蛋白分子量偏高或者偏低?？赡苁悄z的濃度與目的蛋白的濃度不對應(yīng)，比如說100KD的蛋白你用 12%的膠跑，或者說20KD的蛋白你用 6%的