疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)

1、會(huì)計(jì)學(xué)1疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)第1頁(yè)/共73頁(yè)2一、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)異常與疾病發(fā)生一、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)異常與疾病發(fā)生二、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略二、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略三、三、HGP與疾病相關(guān)基因的研究與疾病相關(guān)基因的研究四、生物信息學(xué)主要研究領(lǐng)域四、生物信息學(xué)主要研究領(lǐng)域第2頁(yè)/共73頁(yè) 人體內(nèi)人體內(nèi)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子分子結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)和功能功能的的異常異常是疾病發(fā)生發(fā)展是疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因的主要原因 。第3頁(yè)/共73頁(yè)第4頁(yè)/共73頁(yè)第5頁(yè)/共73頁(yè)6第6頁(yè)/共73頁(yè)（二）細(xì)胞間信號(hào)異常（二）細(xì)胞間信號(hào)異常（三）細(xì)胞內(nèi)因素（三）細(xì)胞內(nèi)因素（一）基因的結(jié)構(gòu)改變（一）基

2、因的結(jié)構(gòu)改變第7頁(yè)/共73頁(yè)8第8頁(yè)/共73頁(yè) （一）基因結(jié)構(gòu)改變（一）基因結(jié)構(gòu)改變 定義：定義：DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改變了基因結(jié)構(gòu)。，改變了基因結(jié)構(gòu)。第9頁(yè)/共73頁(yè)轉(zhuǎn)換（轉(zhuǎn)換（transitiontransition）顛換（顛換（transversiontransversion）第10頁(yè)/共73頁(yè)（3 3）插入（）插入（insertioninsertion）；）；第11頁(yè)/共73頁(yè)第12頁(yè)/共73頁(yè) 2.2.基因突變引起的遺傳效應(yīng)基因突變引起的遺傳效應(yīng)a.同義突變 (consense mutation)b. 錯(cuò)義突變 (missense mutation)c. 無(wú)義突變

3、 (nonsense mutation)d. 終止密碼子突變或延長(zhǎng)突變e. 起始密碼子突變 (initiation codon mutation)f. 非編碼序列點(diǎn)突變 (point mutation in noncoding sequence)第13頁(yè)/共73頁(yè)14同義突變同義突變 、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、延長(zhǎng)突變、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、延長(zhǎng)突變、起始密碼子突變、非編碼序列點(diǎn)突變起始密碼子突變、非編碼序列點(diǎn)突變第14頁(yè)/共73頁(yè)3. 3. 基因突變影響不均一核基因突變影響不均一核RNA(RNA(hnRNAhnRNA) )的剪接的剪接 基因突變發(fā)生在 hnRNA 一級(jí)結(jié)構(gòu)特定的剪接位點(diǎn)上，導(dǎo)致 h

4、nRNA 的剪接錯(cuò)誤，產(chǎn)生異常的 mRNA，產(chǎn)生異常的蛋白產(chǎn)物，改變生物性狀。第15頁(yè)/共73頁(yè)4. 結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾病結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾病血紅蛋白分子一級(jí)結(jié)構(gòu)上的輕微差別；正常成年人血紅蛋白中的鏈的第六位的谷氨酸殘基被纈氨酸取代就會(huì)導(dǎo)致鐮刀形細(xì)胞貧血病的異常血紅蛋白HbS 的生成。第16頁(yè)/共73頁(yè)血紅蛋白病血紅蛋白病鐮刀形細(xì)胞貧血癥鐮刀形細(xì)胞貧血癥第17頁(yè)/共73頁(yè)第18頁(yè)/共73頁(yè)地中海貧血：珠蛋白合成地中海貧血：珠蛋白合成( (量量) )減少，又稱珠蛋白合成減少，又稱珠蛋白合成障礙性貧血。障礙性貧血。 第19頁(yè)/共73頁(yè)基因突變類型基因突變類型 異常異常H

5、b 氨基酸變化氨基酸變化 臨床特征臨床特征 錯(cuò)義突變錯(cuò)義突變 Hb Shuangfeng 27GluLys(GAGAAG) 不穩(wěn)定Hb病 Hb S 6GluVal(GAGGUG) 鐮刀型細(xì)胞貧血 Hb Bibba 136LeuPro(CUGCCA) 不穩(wěn)定Hb病 無(wú)義突變無(wú)義突變 Hb Mckees Rocks 145Tyr終止(UAUUAA) 不穩(wěn)定Hb病 終止密碼突變終止密碼突變 Hb Constant Spring 142UAACAA- - -地貧 (延長(zhǎng)：142Gln- -173UAA) 密碼子缺失密碼子缺失 Hb Gun Hill 9195缺失 不穩(wěn)定Hb病 密碼子插入密碼子插入 H

6、b Grady 118與119間插入3個(gè)氨基酸 無(wú)明顯癥狀 移碼突變移碼突變 Hb Tak 147UAAACU AA- 不穩(wěn)定Hb病 -158UAA(Thr) 第20頁(yè)/共73頁(yè) 5. 5. 常常見單基因?。阂妴位虿。杭膊∶Q疾病名稱 發(fā)病頻率發(fā)病頻率( ) 遺傳方式遺傳方式 致病基因致病基因 典型癥狀典型癥狀血友病血友病A 0.1 X連鎖連鎖 凝血因子凝血因子 不規(guī)則出血不規(guī)則出血血友病血友病B 0.03 X連鎖連鎖 凝血因子凝血因子 不規(guī)則出血不規(guī)則出血杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良 0.3 X連鎖連鎖 肌營(yíng)養(yǎng)因子肌營(yíng)養(yǎng)因子 肌萎縮肌萎縮貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良 0.05 X連鎖連鎖

7、肌營(yíng)養(yǎng)因子肌營(yíng)養(yǎng)因子 肌萎縮肌萎縮脆性脆性X綜合征綜合征 0.5 X連鎖連鎖 FMR1 智力障礙智力障礙舞蹈病舞蹈病 0.5 常染色體顯性常染色體顯性 舞蹈病因子舞蹈病因子 癡呆癡呆神經(jīng)纖維神經(jīng)纖維 0.4 常染色體顯性常染色體顯性 NF-1,2 癌變癌變珠蛋白生成障礙性貧血珠蛋白生成障礙性貧血 0.05 常染色體隱性常染色體隱性 珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇 貧血貧血鐮刀細(xì)胞貧血鐮刀細(xì)胞貧血 0.1 常染色體隱性常染色體隱性 珠蛋白基因珠蛋白基因 貧血貧血, 局部缺血局部缺血苯丙酮酸尿苯丙酮酸尿 0.1 常染色體隱性常染色體隱性 苯丙氨酸羥基化酶苯丙氨酸羥基化酶 無(wú)苯丙酮酸代謝能力無(wú)苯丙酮酸代謝

8、能力囊性纖維化囊性纖維化 0.4 常染色體隱性常染色體隱性 CFTR 進(jìn)行性肺損傷及其他進(jìn)行性肺損傷及其他 第21頁(yè)/共73頁(yè)第22頁(yè)/共73頁(yè)第23頁(yè)/共73頁(yè)第24頁(yè)/共73頁(yè)第25頁(yè)/共73頁(yè)第26頁(yè)/共73頁(yè)二、二、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略1通過(guò)結(jié)構(gòu)分析確定基因變異 PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接測(cè)序法、TaqMan探針法SNP分型、SNaPshot分型法、Mass Array分型法2基因表達(dá)水平分析 差異顯示、基因表達(dá)芯片、RNA-seq分析3通過(guò)功能學(xué)研究確定致病基因 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、RNAi技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達(dá)第27頁(yè)/共73頁(yè)

9、281 1通過(guò)通過(guò)結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析確定基因變異確定基因變異 PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接測(cè)序法、TaqMan探針法SNP分型、SNaPshot法、Mass Array法第28頁(yè)/共73頁(yè)29第29頁(yè)/共73頁(yè)30（2）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)第30頁(yè)/共73頁(yè)第31頁(yè)/共73頁(yè)32第32頁(yè)/共73頁(yè)33第33頁(yè)/共73頁(yè)34針對(duì)染色體上的不同SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PCR引物引物和TaqMan探針探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。探針的5-端和3-端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅淬滅熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)。存在PCR產(chǎn)物時(shí)，產(chǎn)生適合于核酸外切酶

10、核酸外切酶活性的底物，從而將探針5-端連接的熒光分子熒光分子從探針上切割下來(lái)，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。第34頁(yè)/共73頁(yè)35通常用于通常用于10-30個(gè)個(gè)SNP位點(diǎn)分析位點(diǎn)分析第35頁(yè)/共73頁(yè)36MassEXTEND單堿基延伸反應(yīng)，緊挨SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一段探針，在反應(yīng)體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在使探針僅在SNP位點(diǎn)處延位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基即終止。伸一個(gè)堿基即終止。根據(jù)SNP位點(diǎn)的不同，探針將結(jié)合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質(zhì)譜儀即可檢測(cè)出這種分子分子量量差異，從而實(shí)現(xiàn)SNP分型的目的。第36頁(yè)/共73頁(yè)37 差異顯示、基因表達(dá)芯片、RNA-seq分析第37

11、頁(yè)/共73頁(yè) 在不同的生長(zhǎng)時(shí)期、在個(gè)體的發(fā)育與分化的不同階段、在生物體對(duì)疾病的反應(yīng)以及不同的環(huán)境下調(diào)控基因的表達(dá)是不同的，這就是基因的差別表達(dá)（differential expression）。第38頁(yè)/共73頁(yè)原理原理：利用兩組特殊的引物對(duì)差別表達(dá)的基因進(jìn)行擴(kuò)增。3端引物端引物：利用mRNA的poly A尾巴設(shè)計(jì)。根據(jù)mRNA結(jié)構(gòu)分析知道，poly A尾巴之前的兩個(gè)堿基只有12種可能的排列組合：根據(jù)這12種排列組合，設(shè)計(jì)12種不同的引物。這些引物由1112個(gè) T 及兩個(gè)其它的堿基組成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱錨定

12、引物。第39頁(yè)/共73頁(yè)5端引物：5端為10個(gè)堿基（10-mer）組成的隨機(jī)引物。每一個(gè)隨機(jī)引物都可能與總mRNA中的某一些分子發(fā)生雜交，雜交位點(diǎn)也可能在mRNA的不同位點(diǎn)上。用 3錨定引物和 5隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得50100條100500bp的DNA擴(kuò)增帶。為了要尋找更多的DNA差異帶，應(yīng)使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5隨機(jī)引物。第40頁(yè)/共73頁(yè)第41頁(yè)/共73頁(yè)42第42頁(yè)/共73頁(yè)43第43頁(yè)/共73頁(yè)44第44頁(yè)/共73頁(yè)45第45頁(yè)/共73頁(yè)463通過(guò)通過(guò)功能學(xué)功能學(xué)研究確定致病基因研究確定致病基因 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、RNAi技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達(dá)第46頁(yè)/共73頁(yè)第

13、47頁(yè)/共73頁(yè)48 顯微注射法：顯微注射法：在顯微鏡下，直接將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過(guò)DNA的胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。第48頁(yè)/共73頁(yè)49第49頁(yè)/共73頁(yè)50第50頁(yè)/共73頁(yè)（2）基因敲除技術(shù)）基因敲除技術(shù)定義：通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。定義：通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。 應(yīng)用應(yīng)用DNA同源重組原理進(jìn)行基因敲除。同源重組原理進(jìn)行基因敲除。 利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除 RNA干擾也可以引起基因敲除干擾也可以引起基因敲除第51頁(yè)/共73頁(yè)52第52頁(yè)/共73頁(yè) 利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲

14、除利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除基因捕獲法基因捕獲法 利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù)，然后通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。第53頁(yè)/共73頁(yè)第54頁(yè)/共73頁(yè)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)CHS GeneCHS Gene矮牽?；ò珷颗；?Jorgensen, R, 1990)第55頁(yè)/共73頁(yè)RNA干擾干擾(RNA interference, RNAi) RNAi 是將一段雙鏈的RNA 序列導(dǎo)入機(jī)體或細(xì)胞中,機(jī)體或細(xì)胞中與之有同源序列的基因表達(dá)將會(huì)受到抑制,甚至表達(dá)

15、受到完全抑制第56頁(yè)/共73頁(yè) 三位在基因敲除技術(shù)敲除技術(shù)方面進(jìn)行了卓越、開拓性工作并取得了顯著成就的科學(xué)家分享了諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他們是美國(guó)鹽湖城猶他州大學(xué)的Marie Capecchi教授、美國(guó)北卡羅來(lái)納州大學(xué)的Oliver smithies教授以及英國(guó)加蒂夫大學(xué)的Martin Evans教授 第57頁(yè)/共73頁(yè)第58頁(yè)/共73頁(yè)隨著人類基因組草圖測(cè)定的完成，宣告了隨著人類基因組草圖測(cè)定的完成，宣告了“ 后基因組時(shí)代后基因組時(shí)代 ”的到的到來(lái)。來(lái)。功能基因組學(xué)功能基因組學(xué)成為研究的重心，成為研究的重心，蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究受到了空前的關(guān)注的研究受到了空前的關(guān)注，也為疾病相關(guān)基因的克

16、隆創(chuàng)造了條件。，也為疾病相關(guān)基因的克隆創(chuàng)造了條件。第59頁(yè)/共73頁(yè)同一種細(xì)胞或組織，處于不同的狀同一種細(xì)胞或組織，處于不同的狀態(tài)（態(tài)（生理與病理生理與病理等），發(fā)育的不同階段等），發(fā)育的不同階段，受到外界的不同影響時(shí)，都可能使細(xì)，受到外界的不同影響時(shí)，都可能使細(xì)胞中蛋白質(zhì)的情況產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從胞中蛋白質(zhì)的情況產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)而產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)注和研究的就是這些變化。注和研究的就是這些變化。第60頁(yè)/共73頁(yè)第61頁(yè)/共73頁(yè)第62頁(yè)/共73頁(yè)第63頁(yè)/共73頁(yè)第64頁(yè)/共73頁(yè)第65頁(yè)/共73頁(yè)2003-2-1630兩種慢性髓系白血病細(xì)胞對(duì)干擾素干擾素的不同反應(yīng)性的不同反應(yīng)性2002年度總結(jié)報(bào)告年度總結(jié)報(bào)告中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心Thank you!Thank you!第66頁(yè)/共73頁(yè)轉(zhuǎn)換（轉(zhuǎn)換（transitiontransition）顛換（顛換（transversiontransversion）第67頁(yè)/共73頁(yè)第68頁(yè)/共73頁(yè)4. 結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾病結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾