蛋白質(zhì)分子生物學(xué)改造和表達(dá)

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)分子生物學(xué)改造和表達(dá)蛋白質(zhì)分子生物學(xué)改造和表達(dá)第五講 蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá) 重點(diǎn)：重點(diǎn)：蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)改造蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)改造 重組蛋白的表達(dá)重組蛋白的表達(dá)難點(diǎn)：難點(diǎn)：蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)改造蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)改造 天然蛋白質(zhì)在生物體中含量一般較低，難以提取和大量制備，限制了它的推廣應(yīng)用。 重組DNA技術(shù)的建立，使人們?cè)诤艽蟪潭壬蠑[脫對(duì)天然蛋白質(zhì)源的依賴。 這一原理已成功地應(yīng)用于酶制劑的工業(yè)生產(chǎn)。(丹麥Novozymes,80%)Step 2: overlap and extensionStep 1: Introduction of mismatch and amplifica

2、tion of AD and BC fragmentsOverlapBCDACBDABCDA3overlapping strands extensionBA PCR amplificationFinal PCR product with introduced mutation重疊延伸重疊延伸PCR 蛋白質(zhì)分子中兩個(gè)半胱氨酸的巰基之間氧化蛋白質(zhì)分子中兩個(gè)半胱氨酸的巰基之間氧化脫氫即形成二硫鍵。二硫鍵的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定脫氫即形成二硫鍵。二硫鍵的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)，增加蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，可以提高蛋性有關(guān)，增加蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，可以提高蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定白質(zhì)

3、分子的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。性。 綠色熒光蛋白（綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）是一是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。其內(nèi)源發(fā)光基團(tuán)在受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，可高效發(fā)射綠白。其內(nèi)源發(fā)光基團(tuán)在受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，可高效發(fā)射綠光，且無(wú)需底物和輔因子。光，且無(wú)需底物和輔因子。GFP可作為一種可作為一種“熒光標(biāo)簽熒光標(biāo)簽”被用被用來(lái)研究目標(biāo)蛋白的定位及移動(dòng)情況。來(lái)研究目標(biāo)蛋白的定位及移動(dòng)情況。 諾獎(jiǎng)獲得者：錢(qián)永健、下村修、約翰森諾獎(jiǎng)獲得者：錢(qián)永健、下村修、約翰森

4、 GFP蛋白三維結(jié)構(gòu) 然而，定點(diǎn)突變技術(shù)只能對(duì)天然酶蛋白中少數(shù)的氨基然而，定點(diǎn)突變技術(shù)只能對(duì)天然酶蛋白中少數(shù)的氨基酸殘基進(jìn)行替換，酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)基本維持不變，因而酸殘基進(jìn)行替換，酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)基本維持不變，因而對(duì)酶功能的改造較為有限。對(duì)酶功能的改造較為有限。 同時(shí)，已有的結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系的信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿同時(shí)，已有的結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系的信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)今人們對(duì)蛋白質(zhì)新功能的要求，因此目前采用足當(dāng)今人們對(duì)蛋白質(zhì)新功能的要求，因此目前采用體外分體外分子定向進(jìn)化子定向進(jìn)化的方法來(lái)改造酶蛋白的研究越來(lái)越多，并已在的方法來(lái)改造酶蛋白的研究越來(lái)越多，并已在短短幾年內(nèi)取得了令人矚目的成就。短短幾年內(nèi)取

5、得了令人矚目的成就。 q易錯(cuò)易錯(cuò)PCR（Error prone PCR）qDNA 攪亂重組（攪亂重組（DNA shuffling） DNA shuffling于于1994年由美國(guó)的年由美國(guó)的 Stemmer提出。這種提出。這種方法不僅可以對(duì)從隨機(jī)突變文庫(kù)中篩選出來(lái)一組突變基因人方法不僅可以對(duì)從隨機(jī)突變文庫(kù)中篩選出來(lái)一組突變基因人為進(jìn)化，還可以將具有結(jié)構(gòu)同源性的幾種基因進(jìn)行體外重組為進(jìn)化，還可以將具有結(jié)構(gòu)同源性的幾種基因進(jìn)行體外重組（Family shuffling)，共同進(jìn)化出一種新的蛋白質(zhì)。，共同進(jìn)化出一種新的蛋白質(zhì)。 通過(guò)這種方法產(chǎn)生的多樣性文庫(kù)，可以有效積累有益突通過(guò)這種方法產(chǎn)生的多樣性

6、文庫(kù)，可以有效積累有益突變，排除有害突變和中性突變，同時(shí)也可實(shí)現(xiàn)目的蛋白質(zhì)多變，排除有害突變和中性突變，同時(shí)也可實(shí)現(xiàn)目的蛋白質(zhì)多種特性的共進(jìn)化。種特性的共進(jìn)化。 DNA改造改造 DNA shuffling過(guò)程示意圖 產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶分解卵磷脂使卵產(chǎn)生卵磷脂酶分解卵磷脂使卵黃瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)乳光渾濁帶黃瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)乳光渾濁帶 融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用可以使蛋白質(zhì)的表達(dá)與融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用可以使蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化方便地進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，將目標(biāo)蛋白編碼基純化方便地進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，將目標(biāo)蛋白編碼基因與一段被稱為因與一段被稱為“親和尾親和尾”（Affinity tail）的編）的

7、編碼序列相連接，這段碼序列相連接，這段“親和尾親和尾”可以與親和層析可以與親和層析柱上的配基特異地結(jié)合，柱上的配基特異地結(jié)合，使目標(biāo)蛋白可以用親和使目標(biāo)蛋白可以用親和層析的方法快速而簡(jiǎn)便地純化出來(lái)。層析的方法快速而簡(jiǎn)便地純化出來(lái)。poly-Argpoly-His 內(nèi)含肽：內(nèi)含肽：在蛋白質(zhì)成熟過(guò)程中被剪切掉的一段框內(nèi)融合于前體蛋白的氨基酸序列。 現(xiàn)階段蛋白質(zhì)異源表達(dá)的關(guān)鍵問(wèn)題就是發(fā)展克隆基因的表達(dá)方法，即找到理想的宿主表達(dá)系統(tǒng)。目前常用的表達(dá)系統(tǒng)有細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，這些表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)。 六種假絲酵母（六種假絲酵母（Candida）的基因組序列已被確定，

8、并與白）的基因組序列已被確定，并與白念珠菌（一種海洋酵母和面包酵母）的基因組序列進(jìn)行了對(duì)念珠菌（一種海洋酵母和面包酵母）的基因組序列進(jìn)行了對(duì)比。假絲酵母是人類所遭受的伺機(jī)性真菌感染的最常見(jiàn)原因比。假絲酵母是人類所遭受的伺機(jī)性真菌感染的最常見(jiàn)原因。 基因組對(duì)比顯示了與致病性物種相關(guān)的驚人的基因家族擴(kuò)展基因組對(duì)比顯示了與致病性物種相關(guān)的驚人的基因家族擴(kuò)展現(xiàn)象。假絲酵母生物學(xué)的其他方面，包括遺傳編碼的演化，現(xiàn)象。假絲酵母生物學(xué)的其他方面，包括遺傳編碼的演化，以及交配和減數(shù)分裂過(guò)程的架構(gòu)，也可通過(guò)對(duì)不同物種進(jìn)行以及交配和減數(shù)分裂過(guò)程的架構(gòu)，也可通過(guò)對(duì)不同物種進(jìn)行對(duì)比來(lái)研究。對(duì)比來(lái)研究。TrxtagHistagthrombinSTagenterokinase目標(biāo)蛋白目標(biāo)蛋白硫氧還蛋白標(biāo)簽硫氧還蛋白標(biāo)簽?zāi)改改c激酶腸激酶 AOX-醇氧化酶 S - 分泌信號(hào) MCS 多克隆位點(diǎn) TT-終止信號(hào) HIS4-組氨醇脫氫酶 Kanamycin-抗卡拉霉素基因 pBR322-大腸桿菌的復(fù)制起始位點(diǎn) Ampicillin-抗氨芐青霉素基因 蛋白質(zhì)分子中兩個(gè)半胱氨酸的巰基之間氧化蛋白質(zhì)分子中兩個(gè)半胱氨酸的巰基之間氧化脫氫即形成二硫鍵。二硫鍵的數(shù)量與蛋